dna重組技術(shù)的原理及步驟 課件

DNA重組技術(shù)的原理及步驟

第五組：鄭桂賢DNA重組技術(shù)的原理及步驟一、發(fā)展歷史1951年，美國學(xué)者E．萊德伯格等發(fā)現(xiàn)了噬菌體。1957年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)了抗藥性質(zhì)粒。20世紀70年代初，生物化學(xué)研究的進展也為重組DNA技術(shù)奠定了基礎(chǔ)1978年，諾貝爾生醫(yī)獎頒給發(fā)現(xiàn)DNA

限制酶的納森斯、亞伯與史密斯時，斯吉巴爾斯基在《基因》期刊中寫道：限制酶將帶領(lǐng)我們進入合成生物學(xué)的新時代。基因工程、遺傳工程、分子克隆作為DNA重組技術(shù)的代名詞被廣泛使用。一、發(fā)展歷史1951年，美國學(xué)者E．萊德伯格等發(fā)現(xiàn)了噬菌體。二、DNA重組技術(shù)的原理1.目的基因的獲取2.克隆載體的選擇與構(gòu)建3.外源基因與載體的連接4.重組DNA導(dǎo)入受體菌5.重組體的篩選6.克隆基因的表達二、DNA重組技術(shù)的原理1.目的基因的獲取三、

DNA重組技術(shù)的步驟

1.分：分離目的基因

2.切：對目的基因和載體適當(dāng)切割

3.接：目的基因與載體連接

4.轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌

5.篩：篩選出含有重組體的受菌體三、DNA重組技術(shù)的步驟RecombinantDNATechnology①從細胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因⑦重組體的篩選RecombinantDNATechnology①從細胞（一）分：目的基因的獲取

1.化學(xué)合成法:較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物、測序引物、核酸雜交探針、定點突變

2.基因組DNA、cDNA3.聚合酶鏈反應(yīng)（一）分：目的基因的獲取

1.化學(xué)合成法:較短的基因（cDNA文庫基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA基因組DNA文庫限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細菌體外包裝cDNA文庫基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA基因組DNA文庫克隆載體的選擇和構(gòu)建

理想載體具備的條件：可轉(zhuǎn)移性、復(fù)制功能、多克隆位點（廣泛、特異）、顯著的篩選標(biāo)志，便于篩選和鑒定、安全性常用克隆載體：質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA

質(zhì)粒是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子；具有自我復(fù)制功能；帶有抗性基因及表型識別等遺傳性標(biāo)記;經(jīng)改造后具有多克隆位點。pBR322是一個人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒，有萬能質(zhì)粒之稱。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三個親本質(zhì)粒經(jīng)復(fù)雜的重組過程構(gòu)建而成的?？寺≥d體的選擇和構(gòu)建

理想載體具備的條件：可轉(zhuǎn)移性、復(fù)制功多克隆位點ori復(fù)制起始點遺傳標(biāo)記Amppolylinker質(zhì)粒載體多克隆位點ori復(fù)制起始點遺傳標(biāo)記Amppolylinker（二）切：對目的基因和載體適當(dāng)切割（二）切：對目的基因和載體適當(dāng)切割（1）與DNA分子相關(guān)的幾種酶及基因工程的其他工具

（1）與DNA分子相關(guān)的幾種酶及基因工程的其他工具

限制性內(nèi)切核酸酶

在特異位點上切割DNA分子分三類，常用為Ⅱ類酶識別序列呈回文對稱5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的識別序列HaeⅠ的識別序列限制性內(nèi)切核酸酶

在特異位點上切割DNA分子5’-GAAT（三）接：目的基因與載體連接

(三)連接策略

1.粘端DNA間的連接

(1)同一限制性內(nèi)切酶切割位點連接

(2)不同限制性內(nèi)切酶切割位點連接

2.平端DNA間的連接

3.同聚物加尾連接

4.人工接頭連接（三）接：目的基因與載體連接

(三)連接策略粘端連接CCGGCCGGGGCCGGCC

CGGC

CGGCCGGC

CGGC

CCGG

GGCCHapⅡT4-DNA連接酶粘端連接CCGGCCGGGGC平端連接

AGCT

TCGAAluⅠDNA連接酶AGCTAGCTTCGATCGA平端連接AGCTTCGAAlu同聚物加尾連接同聚物加尾連接（四）轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌

?無性繁殖

?感受態(tài)細胞:容易接受外源DNA的狀態(tài).?方式:轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染（四）轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌

?無性繁殖導(dǎo)入大腸桿菌?導(dǎo)入哺乳動物細胞

1.氯化鈣轉(zhuǎn)化法

2.電擊法3.體外包裝感染法

?1.顯微注射法?2.電穿孔法3.DNA-磷酸鈣共沉淀?4.DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法5.病毒感染法?6.脂質(zhì)體介導(dǎo)法?7.細胞融合法8.原生質(zhì)體融合法9.微細胞介導(dǎo)法導(dǎo)入大腸桿菌（五）篩：篩選出含有重組體的受菌體

直接選擇法間接篩選法核酸水平蛋白質(zhì)水平

1.抗藥性選擇*1.酶切圖譜免疫學(xué)的技術(shù)：*2.核酸探針SDS、2.標(biāo)志補救*3.PCR

Westernblot、3.分子雜交法*4.序列測定ELISA、放免、免疫沉淀、熒光抗體等

（五）篩：篩選出含有重組體的受菌體

直接選擇法抗藥性選擇抗藥性選擇2）標(biāo)志補救（?-半乳糖苷酶法）

（LacZ基因）插入片段（LacZ基因失活）LacZ酶氨芐培養(yǎng)基2）標(biāo)志補救（?-半乳糖苷酶法）

（LacZ基因）插入片段(六)克隆基因的表達

原核表達體系——表達載體的標(biāo)準(zhǔn)：

1.含有大腸桿菌適宜的選擇標(biāo)志

2.具有能調(diào)控轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生大量mRNA的強啟動子

3.含有適當(dāng)?shù)姆g控制序列

4.含有合理設(shè)計的多接頭克隆位點真核表達體系關(guān)鍵步驟是將重組DNA導(dǎo)入真核細胞(六)克隆基因的表達

質(zhì)粒噬菌體病毒PCRcDNA人工合成基因文庫限制性內(nèi)切酶有切口的載體有切口的目的基因DNA連接酶

重組體

轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染體外包裝帶重組體的宿主細胞

表型篩選電泳法核酸雜交免疫學(xué)方法目的基因的表達基因載體目的基因粘端連接平端連接尾接法分切接轉(zhuǎn)篩質(zhì)粒噬菌體病毒PCRcDNA人總觀總觀參考文章張亞旭DNA重組技術(shù)的研究綜述生物技術(shù)進展2012年第2卷第一期57-83張洪淵生物化學(xué)教程第七章Page479王鏡巖朱圣庚徐長法生物化學(xué)下冊第40章Page580百度百科馬克學(xué)席興宇轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染和感染的解析生物學(xué)教學(xué)2010（第35卷）第10期參考文章張亞旭DNA重組技術(shù)的研究綜述生物技術(shù)進展2謝謝觀看謝謝觀看DNA重組技術(shù)的原理及步驟

第五組：鄭桂賢DNA重組技術(shù)的原理及步驟一、發(fā)展歷史1951年，美國學(xué)者E．萊德伯格等發(fā)現(xiàn)了噬菌體。1957年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)了抗藥性質(zhì)粒。20世紀70年代初，生物化學(xué)研究的進展也為重組DNA技術(shù)奠定了基礎(chǔ)1978年，諾貝爾生醫(yī)獎頒給發(fā)現(xiàn)DNA

限制酶的納森斯、亞伯與史密斯時，斯吉巴爾斯基在《基因》期刊中寫道：限制酶將帶領(lǐng)我們進入合成生物學(xué)的新時代?；蚬こ獭⑦z傳工程、分子克隆作為DNA重組技術(shù)的代名詞被廣泛使用。一、發(fā)展歷史1951年，美國學(xué)者E．萊德伯格等發(fā)現(xiàn)了噬菌體。二、DNA重組技術(shù)的原理1.目的基因的獲取2.克隆載體的選擇與構(gòu)建3.外源基因與載體的連接4.重組DNA導(dǎo)入受體菌5.重組體的篩選6.克隆基因的表達二、DNA重組技術(shù)的原理1.目的基因的獲取三、

DNA重組技術(shù)的步驟

1.分：分離目的基因

2.切：對目的基因和載體適當(dāng)切割

3.接：目的基因與載體連接

4.轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌

5.篩：篩選出含有重組體的受菌體三、DNA重組技術(shù)的步驟RecombinantDNATechnology①從細胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因⑦重組體的篩選RecombinantDNATechnology①從細胞（一）分：目的基因的獲取

1.化學(xué)合成法:較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物、測序引物、核酸雜交探針、定點突變

2.基因組DNA、cDNA3.聚合酶鏈反應(yīng)（一）分：目的基因的獲取

1.化學(xué)合成法:較短的基因（cDNA文庫基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA基因組DNA文庫限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細菌體外包裝cDNA文庫基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA基因組DNA文庫克隆載體的選擇和構(gòu)建

理想載體具備的條件：可轉(zhuǎn)移性、復(fù)制功能、多克隆位點（廣泛、特異）、顯著的篩選標(biāo)志，便于篩選和鑒定、安全性常用克隆載體：質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA

質(zhì)粒是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子；具有自我復(fù)制功能；帶有抗性基因及表型識別等遺傳性標(biāo)記;經(jīng)改造后具有多克隆位點。pBR322是一個人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒，有萬能質(zhì)粒之稱。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三個親本質(zhì)粒經(jīng)復(fù)雜的重組過程構(gòu)建而成的?？寺≥d體的選擇和構(gòu)建

理想載體具備的條件：可轉(zhuǎn)移性、復(fù)制功多克隆位點ori復(fù)制起始點遺傳標(biāo)記Amppolylinker質(zhì)粒載體多克隆位點ori復(fù)制起始點遺傳標(biāo)記Amppolylinker（二）切：對目的基因和載體適當(dāng)切割（二）切：對目的基因和載體適當(dāng)切割（1）與DNA分子相關(guān)的幾種酶及基因工程的其他工具

（1）與DNA分子相關(guān)的幾種酶及基因工程的其他工具

限制性內(nèi)切核酸酶

在特異位點上切割DNA分子分三類，常用為Ⅱ類酶識別序列呈回文對稱5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的識別序列HaeⅠ的識別序列限制性內(nèi)切核酸酶

在特異位點上切割DNA分子5’-GAAT（三）接：目的基因與載體連接

(三)連接策略

1.粘端DNA間的連接

(1)同一限制性內(nèi)切酶切割位點連接

(2)不同限制性內(nèi)切酶切割位點連接

2.平端DNA間的連接

3.同聚物加尾連接

4.人工接頭連接（三）接：目的基因與載體連接

(三)連接策略粘端連接CCGGCCGGGGCCGGCC

CGGC

CGGCCGGC

CGGC

CCGG

GGCCHapⅡT4-DNA連接酶粘端連接CCGGCCGGGGC平端連接

AGCT

TCGAAluⅠDNA連接酶AGCTAGCTTCGATCGA平端連接AGCTTCGAAlu同聚物加尾連接同聚物加尾連接（四）轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌

?無性繁殖

?感受態(tài)細胞:容易接受外源DNA的狀態(tài).?方式:轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染（四）轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌

?無性繁殖導(dǎo)入大腸桿菌?導(dǎo)入哺乳動物細胞

1.氯化鈣轉(zhuǎn)化法

2.電擊法3.體外包裝感染法

?1.顯微注射法?2.電穿孔法3.DNA-磷酸鈣共沉淀?4.DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法5.病毒感染法?6.脂質(zhì)體介導(dǎo)法?7.細胞融合法8.原生質(zhì)體融合法9.微細胞介導(dǎo)法導(dǎo)入大腸桿菌（五）篩：篩選出含有重組體的受菌體

直接選擇法間接篩選法核酸水平蛋白質(zhì)水平

1.抗藥性選擇*1.酶切圖譜免疫學(xué)的技術(shù)：*2.核酸探針SDS、2.標(biāo)志補救*3.PCR

Westernblot、3.分子雜交法*4.序列測定ELISA、放免、免疫沉淀、熒光抗體等

（五）篩：篩選出含有重組體的受菌體

直接選擇法抗藥性選擇抗藥性選擇2）標(biāo)志補救（?-半乳糖苷酶法）

（LacZ基因）