實驗三 病原細菌的鑒定與藥物敏感性(大)課件

1實驗三

病原細菌的分離、鑒定與毒力分析一、實驗目的1．掌握無菌操作條件下致病菌的分離方法與程序；2．了解細菌鑒定的方法，熟悉細菌常用的生理生化反應及原理。2二、實驗內容1.平板劃線法分離病原細菌；2．病原細菌的形態(tài)與生理生化鑒定； 3．病原細菌的人工感染（課外選作實驗）。3三、主要儀器及試材顯微鏡，解剖鏡，解剖用具，包括解剖盤、解剖刀、解剖針、大小手術剪、大小鑷子，培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、紗布等。蒸餾水、魚用生理鹽水，70%的乙醇、BHI培養(yǎng)基、生化管等。人工感染嗜水氣單胞菌的魚，未知病原菌感染的魚（剪掉部分背鰭或腹鰭作為標記)。5四、實驗方法與步驟（三）病原細菌的生理生化鑒定分別測定分離菌和嗜水氣單胞菌的12種生化指標：氧化酶，吲哚實驗，VP，H2S，鳥氨酸脫羧酶，精氨酸雙水解酶性，七葉苷，賴氨酸脫羧酶，山梨醇，蔗糖，纖維二糖，明膠。取生化管于距離內容物上方2cm處用砂輪割開，迅速于酒精燈火焰消毒，然后接種菌株，以封口膜或液體石蠟封口，置35℃孵育，依據說明書進行。6四、實驗方法與步驟（四）病原細菌的毒力分析1．實驗魚：實驗環(huán)境下暫養(yǎng)7-10天。每組不少于50條，設不少于3個平行重復。2．菌懸液制備：液體培養(yǎng)基增殖，用無菌生理鹽水懸浮。經計數后采用等對數間距設計約5個感染劑量進行感染試驗。對照組以無菌生理鹽水。3．注射方法：感染前實驗魚用MS-222麻醉，用濕毛巾裹住魚體頭部。（1）腹腔注射：腹鰭基部無鱗片處。（2）肌肉注射：背鰭前端與側線之間的中部區(qū)域。7四、實驗方法與步驟（四）藥物敏感性實驗（一）紙片擴散法

1.原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的濃度梯度，細菌的生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，即抑菌圈愈大，藥物敏感性越強。8四、實驗方法與步驟2.實驗操作

1）倒平板

2）菌懸液制備：挑取斜面中菌苔于少量生理鹽水中制成細菌懸液，將菌液濃度調到1*107cfu/mL。以玻璃刮鏟將0.1mL細菌懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面；

3）貼片：將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了能準確觀察結果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上（在平皿中均勻貼四片）；

4）培養(yǎng)：28℃溫箱中培養(yǎng)24h，記錄結果；1012四、實驗方法與步驟（二）肉湯試管稀釋法

1.原理：以肉湯液體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后接入待檢菌，定量測定抗菌藥物對被測菌的最低抑菌濃度（MIC）。

2.實驗操作

1）菌液準備：挑取金黃色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理鹽水中制成細菌懸液，將菌液濃度調到1*107cfu/mL備用；14四、實驗方法與步驟3）接種：每只試管中加入0.1ml的菌液；4）培養(yǎng)：置37℃溫箱，培養(yǎng)24h；5）結果觀察：肉眼觀察，以不出現肉眼可見生長的最低藥物濃度為該藥對測試菌的MIC。根據結果換算出最小抑菌濃度（μg/mL）。8000800400200100502512.56.253.12

1.560.78無菌生理鹽水1.8mL0.2mL抗生素8萬/mL下排培養(yǎng)液每管1.8mL對應加0.2mL8040201052.51.250.60.3

0.1500.816五、實驗注意事項

分離、接種時嚴格按照無菌操作要求進行。

革蘭氏染色過程中涂片務求均勻，切忌過厚，染色過程中不可使染液干涸。藥敏實驗，在貼片時用無菌鑷子輕輕觸壓藥物紙片，使之與培養(yǎng)基充分接觸，貼片后不能再更改紙片位置；鑷取藥物紙片時一旦掉到培養(yǎng)基表面，則繼續(xù)保持其位置，切勿鑷起重新放置，以防不同抗生素交叉影響。17六、實驗安排1-4節(jié)(1)配培養(yǎng)基（固體、液體分裝），包培養(yǎng)皿（10包），配制生理鹽水，滅菌（4瓶）；(2)完成細菌染色、觀察和生化指標測定；4-8節(jié)(1)倒平板接種貼紙；(2)藥液稀釋接種；（3）第二天早上看結果。18七、實驗報告（一