中農(nóng) 生物化學(xué)課件第17章RNA的合成

這是位于甘肅省酒泉市阿克塞哈薩克族自治縣縣城西約50公里紅柳溝的柱廊狀宮殿式丹霞地貌局部（4月20日攝）。

甘肅省酒泉市阿克塞哈薩克族自治縣紅柳溝的丹霞地貌呈南北走向、全長(zhǎng)約6公里，處在阿爾金山主峰腳下，以柱廊、宮殿等形狀為主，壯觀美麗，堪稱鬼斧神工。

這段丹霞地貌過去曾長(zhǎng)期不被外界了解，2007年經(jīng)有關(guān)丹霞地貌專家考察，確定其為柱廊狀宮殿式丹霞地貌。這是位于甘肅省酒泉市阿克塞哈薩克族自治縣縣城西約50公里紅柳1中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成2壯美的南極

壯美的南極3中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成4中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成5中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成6第十七章RNA的生物合成第十七章RNA的生物合成7KeyTermstranscriptionRNApolymerasepromotersitestranscriptionfactorfootprintingconsensussequencesigmasubunittranscriptionbubblerho(r)proteinTATAboxenhancerpre-mRNA5cappoly(A)tailRNAeditingRNAsplicingspliceosomesmallnuclearRNA(snRNA)alternativesplicingcatalyticRNAself-splicingIII.SynthesizingKeyTermspre-mRNA8中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成9

RNA的合成過程包括起始，延伸和終止三個(gè)部分（RNA）n+NTP→（RNA）n+1+PPiRNA合成需要;雙鏈DNA

活化前提(NTP)鎂離子或錳離子酶類RNA的合成過程包括起始，延伸和終止三個(gè)部分10識(shí)別階段；酶與啟動(dòng)子的結(jié)合（全酶）DNA鏈的局部打開.轉(zhuǎn)錄的起始階段；DNA摸板和RNA堿基配對(duì)RNA鏈的延長(zhǎng)；核心酶向前移動(dòng)，RNA鏈延長(zhǎng).轉(zhuǎn)錄的終止；酶到達(dá)基因轉(zhuǎn)錄終點(diǎn).新合成的RNA和RNA聚合酶從DNA上脫落.識(shí)別階段；酶與啟動(dòng)子的結(jié)合（全酶）DNA鏈的局部打開.11TranscriptionIsCatalyzedbyRNAPolymerase

WebeginourconsiderationoftranscriptionbyexaminingtheprocessinbacteriasuchasE.coli.RNApolymerasefromE.coliisaverylarge(~400kd)andcomplexenzymeconsistingoffourkindsofsubunits.Thesubunitcompositionoftheentireenzyme,calledtheholoenzyme,isa2bbs.Thessubunithelpsfindapromotersitewheretranscriptionbegins,participatesintheinitiationofRNAsynthesis,andthendissociatesfromtherestoftheenzyme.RNApolymerasewithoutthissubunit(a2bb)iscalledthecoreenzyme.Thecoreenzymecontainsthecatalyticsite.ThiscatalyticsiteresemblesthatofDNApolymeraseinthatitincludestwometalionsinitsactiveform.Onemetalionremainsboundtotheenzyme,whereastheotherappearstocomeinwiththenucleosidetriphosphateandleavewiththepyrophosphate.Threeconservedaspartateresiduesoftheenzymeparticipateinbindingthesemetalions.NotethattheoverallstructuresofDNApolymeraseandRNApolymerasearequitedifferent;theirsimilaractivesitesaretheproductsofconvergentevolution.TranscriptionIsCatalyzedby12一RNA聚合酶☆1960-1961年發(fā)現(xiàn)，全酶分子量465000，有五種亞基組成，含有兩個(gè)鋅原子☆全酶中無希格碼亞基的酶稱為核心酶，核心酶只能使已開始的RNA鏈延長(zhǎng)，不具有起始合成RNA的能力☆希格碼亞基稱為起始亞基☆RNA聚合酶的作用是合成一條與被轉(zhuǎn)錄的DNA互補(bǔ)的反平行的RNA鏈。RNA以5?→3?方向合成，而RNA聚合酶沿著模板鏈3?→5?方向移動(dòng)。

一RNA聚合酶☆1960-1961年發(fā)現(xiàn)，全酶分子量46513RNAPolymeraseStructures.Thethree-dimensionalstructuresofRNApolymerasesfromaprokaryote

(Thermusaquaticus)andaeukaryote(Saccharoromycescerevisiae).Thetwolargestsubunitsforeachstructure

areshownindarkredanddarkblue.Thesimilarityofthesestructuresrevealsthattheseenzymeshavethesame

evolutionaryoriginandhavemanymechanisticfeaturesincommon.RNAPolymeraseStructures.The14RNAChainsAreFormeddeNovoandGrowinthe5-to-3DirectionRNAChainsAreFormeddeNovo15★★RNA聚合酶的組成★★RNA聚合酶的組成16中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成17中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成18二真核生物RNA聚合酶RNA聚合酶I:存在于核仁,

轉(zhuǎn)錄28S,18S,

5.8SrRNA.RNA聚合酶II:存在于核質(zhì),轉(zhuǎn)錄mRNARNA聚合酶III:存在于核質(zhì),轉(zhuǎn)錄tRNA和5SrRNA結(jié)構(gòu)含有8-14個(gè)亞基

二真核生物RNA聚合酶RNA聚合酶I:存在于核仁,19★轉(zhuǎn)錄泡★轉(zhuǎn)錄泡20三摸板鏈負(fù)鏈無意義鏈

非摸板鏈正鏈有意義鏈三摸板鏈負(fù)鏈無意義鏈

21DNAUnwinding.RNApolymeraseunwindsabout17basepairsoftemplateDNA.DNAUnwinding.RNApolymerase22TranscriptionBubble.AschematicrepresentationofatranscriptionbubbleintheelongationofanRNA

transcript.DuplexDNAisunwoundattheforwardendofRNApolymeraseandrewoundatitsrearend.TheRNA-DNA

hybridrotatesduringelongation.TranscriptionBubble.Aschema23中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成24四RNA聚合酶與啟動(dòng)子的識(shí)別啟動(dòng)子(Promoter)四RNA聚合酶與啟動(dòng)子的識(shí)別啟動(dòng)子(Promoter)25ProkaryoticPromoterSequences.Acomparisonoffivesequencesfromprokaryoticpromotersrevealsa

recurringsequenceofTATAATcenteredonposition-10.The-10consensussequence(inred)wasdeducedfromalarge

numberofpromotersequences.Thesequencesarefromthe(A)lac,(B)gal,and(C)trpoperonsofE.coli;(D)froml

phage;and(E)fromFC174phage.

III.SynthesizingProkaryoticPromoterSequences26Thefirstnucleotide(thestartsite)ofatranscribedDNAsequenceisdenotedas+1andthesecondoneas+2;thenucleotideprecedingthestartsiteisdenotedas-1.ThesedesignationsrefertothecodingstrandofDNA.RecallthatthesequenceofthetemplatestrandofDNAisthecomplementofthatoftheRNAtranscript(seeFigure5.26).Incontrast,thecodingstrandofDNAhasthesamesequenceasthatoftheRNAtranscriptexceptforthymine(T)inplaceofuracil(U).Thecodingstrandisalsoknownasthesense(+)strand,andthetemplatestrandastheantisense(-)strand.Thefirstnucleotide(thestar27啟動(dòng)子

在RNA合成中用作模板的鏈稱模板鏈或負(fù)（-）鏈。與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈稱為非模板鏈或正（+）鏈。非模板鏈與轉(zhuǎn)錄的RNA在堿基序列上是一致的，只是DNA中用T代替了U。非模板鏈有時(shí)又稱為編碼鏈，它在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成中沒有直接功能。RNA合成中轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)標(biāo)上+1，這個(gè)位點(diǎn)前面的堿基對(duì)標(biāo)以負(fù)數(shù)，它們是不被轉(zhuǎn)錄的，而起始之后的堿基序列標(biāo)以正數(shù)。這里不設(shè)0數(shù)。5?端方向稱上游(upstream)3?端方向稱下游(downstream)根據(jù)習(xí)慣是指非模板鏈中的序列。啟動(dòng)子28實(shí)驗(yàn)證明，啟動(dòng)子序列中某些核苷酸是保守的，即在大多數(shù)情況下它們都會(huì)出現(xiàn)，稱為共有序列。原核與真核生物啟動(dòng)子通常含有兩個(gè)共有序列。原核生物共有序列出現(xiàn)在-10和-35所以稱-10區(qū)和-35區(qū)。真核生物共有序列出現(xiàn)在-25和-75，分別稱為-25區(qū)（TATAbox或Hoghessbox）和-75區(qū)（CAATbox）。緊鄰轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的共有序列是一個(gè)A/T富含區(qū)，它使DNA雙鏈容易局部解鏈。

實(shí)驗(yàn)證明，啟動(dòng)子序列中某些核苷酸是保守的，即在大多數(shù)情況下它29中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成30五起始1．δ亞基與核心酶結(jié)合形成RNA聚合酶全酶。2．全酶以靜電作用和啟動(dòng)子上游非特異性DNA結(jié)合。3．RNA聚合酶全酶沿DNA上下游動(dòng)，包括共有序列在內(nèi)與啟動(dòng)子特異性結(jié)合，全酶結(jié)合后引起DNA片段部分解鏈伸展開約11bp（從-9~+2）4．酶與ATP或GTP結(jié)合，結(jié)合的三磷酸核苷酸形成轉(zhuǎn)錄物的5?末端，剛結(jié)合上的三磷酸核苷3?→OH與下一個(gè)核苷酸生成磷酸酯鍵。所以真核和原核生物的轉(zhuǎn)錄作用以A或G開始。5．當(dāng)全酶繼續(xù)向下游移動(dòng)，約有4個(gè)核苷酸與ATP（GTP）進(jìn)行聚合。δ亞基從全酶上解離，核心酶繼續(xù)合成。新RNA鏈生長(zhǎng)方向是5?→3?，新合成的RNA鏈與被轉(zhuǎn)錄的DNA鏈互補(bǔ)，反平行。SigmaSubunitsofRNAPolymeraseRecognizePromoterSites五起始SigmaSubunitsofRNAPo31中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成32六RNA鏈的延長(zhǎng)RNA鏈的延長(zhǎng)是5′→3′方向，按堿基互補(bǔ)原則依次連接核苷酸，每秒合成最大速度為50個(gè)核苷酸，轉(zhuǎn)錄由啟動(dòng)子至終止子RNA聚合酶全酶識(shí)別起始位點(diǎn)，合成幾個(gè)磷酸二酯鍵，希格瑪亞基釋出核心酶繼續(xù)催化，酶沿著DNA摸板3′→5′移動(dòng)，前面的DNA雙股漸打開，轉(zhuǎn)錄過的區(qū)域又形成雙股DNA。轉(zhuǎn)錄中DNA雙股中只有一股為摸板鏈

5‘端是pppG

或pppA

從頭合成，第二個(gè)核苷酸就與ATP（或GTP）的3?-OH形成3?，5?-磷酸二酯鍵繼而參入RNA鏈。在參入核苷酸的過程中重復(fù)形成3?，5?-磷酸二酯鍵構(gòu)成轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)階段，此階段RNA鏈不斷延伸。RNA聚合酶后面的DNA恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)?shù)竭_(dá)DNA的一個(gè)特殊位點(diǎn)時(shí)，轉(zhuǎn)錄即停止。RNA聚合酶無校對(duì)功能故轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)的誤差是復(fù)制的10萬倍。由于一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物很多因而可以耐受如此大的誤差。六RNA鏈的延長(zhǎng)RNA鏈的延長(zhǎng)是5′→3′方向，按堿基互補(bǔ)33中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成34終止包括：停止RNA鏈的延長(zhǎng)

新生RNA鏈的釋放RNA聚合酶從DNA上釋放原核生物的終止子?原核生物的終止子在終止點(diǎn)之前均有一個(gè)回文結(jié)構(gòu)，其產(chǎn)生的RNA可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。在終點(diǎn)前還有一系列U,回文對(duì)稱區(qū)通常有一段富含G-C的序列。七RNA鏈的終止終止包括：停止RNA鏈的延長(zhǎng)七RNA鏈的終止35TerminationSignal.Aterminationsignalfoundatthe3endofanmRNAtranscriptconsistsofaseries

ofbasesthatformastablestem-loopstructureandaseriesofUresidues.TerminationSignal.Aterminat36中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成37中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成38大腸桿菌的兩類終止子?依賴于rho(ρ)終止子；必須在rho(ρ)存在下發(fā)生終止。此類終止子其回文結(jié)構(gòu)不富含G-C區(qū),回文結(jié)構(gòu)之后也無寡聚U。?

不依賴于rho(ρ)終止子(簡(jiǎn)單終止子)；此類終止子除能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)外，在終點(diǎn)有6個(gè)U核苷酸,回文對(duì)稱去有一段富含G-C序列。

rho(ρ);分質(zhì)量為46000的蛋白質(zhì)，通常以6聚體的形式存在。在有RNA存在時(shí)它能水解三磷酸腺苷，rho(ρ)可沿RNA鏈移動(dòng)。有rho(ρ)時(shí)合成RNA鏈短。無rho(ρ)時(shí)合成RNA鏈長(zhǎng)。大腸桿菌的兩類終止子?依賴于rho(ρ)終止子；必須在r39E.coli的轉(zhuǎn)錄終止有兩種機(jī)制★不依賴rho因子的終止機(jī)制。在富含A/T的DNA基礎(chǔ)上，前段還富含G/C的節(jié)段，富含G/C的RNA轉(zhuǎn)錄物自身回折形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的末端還有一連續(xù)U堿基序列可與模板鏈A堿基序列互補(bǔ)，當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，迫使聚合酶暫時(shí)停止作用?！镆蕾噐ho(ρ蛋白)因子的終止機(jī)制。在無A/T和G/C富含節(jié)段發(fā)生的，需rho參加，rho因子是由相同的6個(gè)亞基組成的寡聚蛋白質(zhì)。rho蛋白只有在單鏈RNA存在的情況下水解ATP與新生單鏈RNA結(jié)合。rho蛋白的ATP酶活性使rho蛋白沿新生RNA鏈轉(zhuǎn)錄泡單方向移動(dòng)。將RNA－DNA分開，終止轉(zhuǎn)錄。E.coli的轉(zhuǎn)錄終止有兩種機(jī)制★不依賴rho因子的終止機(jī)制40Effectofrho

ProteinOntheSizeofRNATranscripts.EffectofrhoProteinOntheS41MechanismFortheTerminationofTranscriptionbyrProtein.ThisproteinisanATP-dependent

helicasethatbindsthenascentRNAchainandpullsitawayfromRNApolymeraseandtheDNAtemplate.

MechanismFortheTermination42中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成43中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成44八RNA生物合成的抑制劑嘌呤和嘧啶的類似物

人工合成的堿基類似物DNA摸板功能的抑制物

烷化物放線菌素嵌入染料

RNA聚合酶的抑制物

利福酶素利鏈菌素八RNA生物合成的抑制劑嘌呤和嘧啶的類似物45中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成46中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成47中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成48中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成49中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成50中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成51中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成52中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成53九RNA轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后的RNA最初是以一種完全沒有活性的形式存在，稱為初級(jí)轉(zhuǎn)錄物（primarytranscript）。這種初級(jí)轉(zhuǎn)錄物需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加工，使之轉(zhuǎn)變成有活性和成熟的RNA。轉(zhuǎn)錄后的加工包含3種共有的分子變化：1從初級(jí)轉(zhuǎn)錄物上移去核苷酸；2給轉(zhuǎn)錄物添加上核苷酸；3轉(zhuǎn)錄物中特殊堿基的修飾。

九RNA轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后的RNA最初是以一種完全沒有活性的54?原核生物的rRNA

的加工?真核生物的rRNA

的加工?原核生物的tRNA的加工?原核生物的mRNA的加工?真核生物的mRNA的加工?原核生物的rRNA的加工55核糖體RNA（rRNA）前體和轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）前體的加工

1．原核生物的rRNA前體沉降系數(shù)是30S含有一個(gè)拷貝的5S，16S，23SrRNA和幾個(gè)tRNA前體。2．真核生物的rRNA前體沉降系數(shù)為35~47S，含有一個(gè)拷貝的5.8S，18S和28SrRNA。第四個(gè)真核rRNA即5SRNA只有一個(gè)單獨(dú)的前體。經(jīng)RNA酶切割前導(dǎo)序列成為成熟的核糖體RNA。3．原核和真核的tRNA的轉(zhuǎn)錄過程也是先合成大的前體。大多數(shù)真核tRNA前體在反密碼子附近有一個(gè)內(nèi)含子，并含有前導(dǎo)序列。經(jīng)專一的核酸酶連續(xù)作用將它們切除，用CCA-OH替代3?端UU后而成為成熟的tRNA。核糖體RNA（rRNA）前體和轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）前體的加56PrimaryTranscript.Cleavageofthistranscriptproduces5S,16S,and23SrRNAmoleculesandatRNA

molecule.Spacerregionsareshowninyellow.PrimaryTranscript.Cleavageo57中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成58中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成59中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成60酵母移去14個(gè)核苷酸前導(dǎo)序列酵母移去14個(gè)核苷酸前導(dǎo)序列61中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成62TransferRNAPrecursorProcessing.TheconversionofayeasttRNAprecursorintoamaturetRNA

requirestheremovalofa14-nucleotideintron(yellow),thecleavageofa5leader(green),andtheremovalofUUand

theattachmentofCCAatthe3end(red).Inaddition,severalbasesaremodified.TransferRNAPrecursorProcess63★核酸酶核酸酶P是專一的核糖核酸酶。催化大多數(shù)tRNA前提產(chǎn)生分子的5′端（切除前導(dǎo)序列形成pG）。由-RNA分子（377核苷酸）和一個(gè)蛋白質(zhì)分子組成，保持完整的酶活性兩者都需要。但催化亞基是RNA而不是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)只起保持RNA正確折疊和最大的催化活性。核酸酶P（ribozyme）是一種具有工具酶一樣催化活性的核酸?！锖怂崦负怂崦窹是專一的核糖核酸酶。催化大多數(shù)tRNA前提64mRNA的加工1．原核mRNA不進(jìn)行加工，轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)同時(shí)進(jìn)行。2．真核生物mRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物要經(jīng)過剪接外顯子、戴帽、多聚腺苷酸化等加工過程。a.外顯子剪接許多真核基因是以不連續(xù)基因或割裂基因出現(xiàn)。有些序列戴有遺傳信息，為RNA節(jié)段編碼，稱為外顯子，有些序列不為RNA編碼，但含有某些調(diào)控成分，這種插入的序列稱為內(nèi)含子。內(nèi)含子將一個(gè)外顯子與另一個(gè)外顯子分隔開，mRNA前體中存在內(nèi)含子和外顯子的相應(yīng)序列。加工過程主要是切除內(nèi)含子后連接外顯子。它是由核內(nèi)小RNA（snRNA）和核內(nèi)小核糖核糖白（snRNP）聚集形成專一性很差的復(fù)合物，稱剪接體。剪接體通過自身的snRNA和轉(zhuǎn)錄物之間堿基互補(bǔ)來識(shí)別剪接位點(diǎn)。mRNA的加工65b.mRNA5?端戴帽和3?端加尾真核mRNA需要進(jìn)行兩種修飾。在5?端加一甲基化帽子和在3?端加上多聚腺苷酸（polyA）尾。轉(zhuǎn)錄進(jìn)行時(shí)5?末端的修飾作用就立即開始，構(gòu)成共轉(zhuǎn)錄加工加帽反應(yīng)分四步進(jìn)行。真核mRNA合成后需要在3?-OH端加上一個(gè)polyA尾巴。核酸內(nèi)切酶從mRNA前體的高度保守的AAUAAA切割信號(hào)下游10~30個(gè)核苷酸的位點(diǎn)進(jìn)行酶切，然后在聚腺苷酸酶催化下加上polyA。polyA可保護(hù)mRNA的3?-末端不會(huì)被核酸酶降解，并有助于mRNA從細(xì)胞投向胞漿轉(zhuǎn)移。b.mRNA5?端戴帽和3?端加尾66Cappingthe5End.Capsatthe5endofeukaryoticmRNAinclude7-methylguanylate(red)attachedbyatriphosphatelinkagetotheriboseatthe5end.Noneoftheribosesaremethylatedincap0,oneismethylatedincap1,

andbotharemethylatedincap2.Cappingthe5End.Capsatthe67PolyadenylationofaPrimaryTranscript.AspecificendonucleasecleavestheRNAdownstreamof

AAUAAA.Poly(A)polymerasethenaddsabout250adenylateresidues.

PolyadenylationofaPrimaryT68中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成69

帽子結(jié)構(gòu)常被甲基化Cap0Cap1Cap2

m7G-5′-PPP-5′-Nm帽子的功能★使mRNA免遭核酸酶的破壞★能使mRNA與核糖體小亞基結(jié)合,開始合成蛋白質(zhì)★被蛋白質(zhì)合成的起始因子識(shí)別,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成

帽子結(jié)構(gòu)常被甲基化70絕大多數(shù)真核生物mRNA具PolyA尾巴功能mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必須？提高mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性真核生物mRNA的拼接真核生物mRNA的甲基化修飾cDNA絕大多數(shù)真核生物mRNA具PolyA尾巴cDNA71中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成72中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成73中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成74中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成75中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成76真核生物mRNA的加工轉(zhuǎn)錄含有外顯子和內(nèi)含子的mRNA的前體（hnRNA）切除內(nèi)含子5‘端帽子結(jié)構(gòu)和3’端多聚A的結(jié)構(gòu)真核生物mRNA的加工轉(zhuǎn)錄含有外顯子和內(nèi)含子的mRNA的前體77RNAPolymeraseStructures.Thethree-dimensionalstructuresofRNApolymerasesfromaprokaryote

(Thermusaquaticus)andaeukaryote(Saccharoromycescerevisiae).Thetwolargestsubunitsforeachstructure

areshownindarkredanddarkblue.Thesimilarityofthesestructuresrevealsthattheseenzymeshavethesame

evolutionaryoriginandhavemanymechanisticfeaturesincommon.RNAPolymeraseStructures.The78中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成79中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成80中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成81中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成82中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成83中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成84中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成85中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成86中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成87中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成88中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成89中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成90中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成91中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成92中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成93中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成94中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成95中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成96中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成97中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成98中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成99中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成100中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成101中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成102中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成103中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成104中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成105中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成106中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成107這是位于甘肅省酒泉市阿克塞哈薩克族自治縣縣城西約50公里紅柳溝的柱廊狀宮殿式丹霞地貌局部（4月20日攝）。

甘肅省酒泉市阿克塞哈薩克族自治縣紅柳溝的丹霞地貌呈南北走向、全長(zhǎng)約6公里，處在阿爾金山主峰腳下，以柱廊、宮殿等形狀為主，壯觀美麗，堪稱鬼斧神工。

這段丹霞地貌過去曾長(zhǎng)期不被外界了解，2007年經(jīng)有關(guān)丹霞地貌專家考察，確定其為柱廊狀宮殿式丹霞地貌。這是位于甘肅省酒泉市阿克塞哈薩克族自治縣縣城西約50公里紅柳108中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成109壯美的南極

壯美的南極110中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成111中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成112中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成113第十七章RNA的生物合成第十七章RNA的生物合成114KeyTermstranscriptionRNApolymerasepromotersitestranscriptionfactorfootprintingconsensussequencesigmasubunittranscriptionbubblerho(r)proteinTATAboxenhancerpre-mRNA5cappoly(A)tailRNAeditingRNAsplicingspliceosomesmallnuclearRNA(snRNA)alternativesplicingcatalyticRNAself-splicingIII.SynthesizingKeyTermspre-mRNA115中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成116

RNA的合成過程包括起始，延伸和終止三個(gè)部分（RNA）n+NTP→（RNA）n+1+PPiRNA合成需要;雙鏈DNA

活化前提(NTP)鎂離子或錳離子酶類RNA的合成過程包括起始，延伸和終止三個(gè)部分117識(shí)別階段；酶與啟動(dòng)子的結(jié)合（全酶）DNA鏈的局部打開.轉(zhuǎn)錄的起始階段；DNA摸板和RNA堿基配對(duì)RNA鏈的延長(zhǎng)；核心酶向前移動(dòng)，RNA鏈延長(zhǎng).轉(zhuǎn)錄的終止；酶到達(dá)基因轉(zhuǎn)錄終點(diǎn).新合成的RNA和RNA聚合酶從DNA上脫落.識(shí)別階段；酶與啟動(dòng)子的結(jié)合（全酶）DNA鏈的局部打開.118TranscriptionIsCatalyzedbyRNAPolymerase

WebeginourconsiderationoftranscriptionbyexaminingtheprocessinbacteriasuchasE.coli.RNApolymerasefromE.coliisaverylarge(~400kd)andcomplexenzymeconsistingoffourkindsofsubunits.Thesubunitcompositionoftheentireenzyme,calledtheholoenzyme,isa2bbs.Thessubunithelpsfindapromotersitewheretranscriptionbegins,participatesintheinitiationofRNAsynthesis,andthendissociatesfromtherestoftheenzyme.RNApolymerasewithoutthissubunit(a2bb)iscalledthecoreenzyme.Thecoreenzymecontainsthecatalyticsite.ThiscatalyticsiteresemblesthatofDNApolymeraseinthatitincludestwometalionsinitsactiveform.Onemetalionremainsboundtotheenzyme,whereastheotherappearstocomeinwiththenucleosidetriphosphateandleavewiththepyrophosphate.Threeconservedaspartateresiduesoftheenzymeparticipateinbindingthesemetalions.NotethattheoverallstructuresofDNApolymeraseandRNApolymerasearequitedifferent;theirsimilaractivesitesaretheproductsofconvergentevolution.TranscriptionIsCatalyzedby119一RNA聚合酶☆1960-1961年發(fā)現(xiàn)，全酶分子量465000，有五種亞基組成，含有兩個(gè)鋅原子☆全酶中無希格碼亞基的酶稱為核心酶，核心酶只能使已開始的RNA鏈延長(zhǎng)，不具有起始合成RNA的能力☆希格碼亞基稱為起始亞基☆RNA聚合酶的作用是合成一條與被轉(zhuǎn)錄的DNA互補(bǔ)的反平行的RNA鏈。RNA以5?→3?方向合成，而RNA聚合酶沿著模板鏈3?→5?方向移動(dòng)。

一RNA聚合酶☆1960-1961年發(fā)現(xiàn)，全酶分子量465120RNAPolymeraseStructures.Thethree-dimensionalstructuresofRNApolymerasesfromaprokaryote

(Thermusaquaticus)andaeukaryote(Saccharoromycescerevisiae).Thetwolargestsubunitsforeachstructure

areshownindarkredanddarkblue.Thesimilarityofthesestructuresrevealsthattheseenzymeshavethesame

evolutionaryoriginandhavemanymechanisticfeaturesincommon.RNAPolymeraseStructures.The121RNAChainsAreFormeddeNovoandGrowinthe5-to-3DirectionRNAChainsAreFormeddeNovo122★★RNA聚合酶的組成★★RNA聚合酶的組成123中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成124中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成125二真核生物RNA聚合酶RNA聚合酶I:存在于核仁,

轉(zhuǎn)錄28S,18S,

5.8SrRNA.RNA聚合酶II:存在于核質(zhì),轉(zhuǎn)錄mRNARNA聚合酶III:存在于核質(zhì),轉(zhuǎn)錄tRNA和5SrRNA結(jié)構(gòu)含有8-14個(gè)亞基

二真核生物RNA聚合酶RNA聚合酶I:存在于核仁,126★轉(zhuǎn)錄泡★轉(zhuǎn)錄泡127三摸板鏈負(fù)鏈無意義鏈

非摸板鏈正鏈有意義鏈三摸板鏈負(fù)鏈無意義鏈

128DNAUnwinding.RNApolymeraseunwindsabout17basepairsoftemplateDNA.DNAUnwinding.RNApolymerase129TranscriptionBubble.AschematicrepresentationofatranscriptionbubbleintheelongationofanRNA

transcript.DuplexDNAisunwoundattheforwardendofRNApolymeraseandrewoundatitsrearend.TheRNA-DNA

hybridrotatesduringelongation.TranscriptionBubble.Aschema130中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成131四RNA聚合酶與啟動(dòng)子的識(shí)別啟動(dòng)子(Promoter)四RNA聚合酶與啟動(dòng)子的識(shí)別啟動(dòng)子(Promoter)132ProkaryoticPromoterSequences.Acomparisonoffivesequencesfromprokaryoticpromotersrevealsa

recurringsequenceofTATAATcenteredonposition-10.The-10consensussequence(inred)wasdeducedfromalarge

numberofpromotersequences.Thesequencesarefromthe(A)lac,(B)gal,and(C)trpoperonsofE.coli;(D)froml

phage;and(E)fromFC174phage.

III.SynthesizingProkaryoticPromoterSequences133Thefirstnucleotide(thestartsite)ofatranscribedDNAsequenceisdenotedas+1andthesecondoneas+2;thenucleotideprecedingthestartsiteisdenotedas-1.ThesedesignationsrefertothecodingstrandofDNA.RecallthatthesequenceofthetemplatestrandofDNAisthecomplementofthatoftheRNAtranscript(seeFigure5.26).Incontrast,thecodingstrandofDNAhasthesamesequenceasthatoftheRNAtranscriptexceptforthymine(T)inplaceofuracil(U).Thecodingstrandisalsoknownasthesense(+)strand,andthetemplatestrandastheantisense(-)strand.Thefirstnucleotide(thestar134啟動(dòng)子

在RNA合成中用作模板的鏈稱模板鏈或負(fù)（-）鏈。與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈稱為非模板鏈或正（+）鏈。非模板鏈與轉(zhuǎn)錄的RNA在堿基序列上是一致的，只是DNA中用T代替了U。非模板鏈有時(shí)又稱為編碼鏈，它在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成中沒有直接功能。RNA合成中轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)標(biāo)上+1，這個(gè)位點(diǎn)前面的堿基對(duì)標(biāo)以負(fù)數(shù)，它們是不被轉(zhuǎn)錄的，而起始之后的堿基序列標(biāo)以正數(shù)。這里不設(shè)0數(shù)。5?端方向稱上游(upstream)3?端方向稱下游(downstream)根據(jù)習(xí)慣是指非模板鏈中的序列。啟動(dòng)子135實(shí)驗(yàn)證明，啟動(dòng)子序列中某些核苷酸是保守的，即在大多數(shù)情況下它們都會(huì)出現(xiàn)，稱為共有序列。原核與真核生物啟動(dòng)子通常含有兩個(gè)共有序列。原核生物共有序列出現(xiàn)在-10和-35所以稱-10區(qū)和-35區(qū)。真核生物共有序列出現(xiàn)在-25和-75，分別稱為-25區(qū)（TATAbox或Hoghessbox）和-75區(qū)（CAATbox）。緊鄰轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的共有序列是一個(gè)A/T富含區(qū)，它使DNA雙鏈容易局部解鏈。

實(shí)驗(yàn)證明，啟動(dòng)子序列中某些核苷酸是保守的，即在大多數(shù)情況下它136中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成137五起始1．δ亞基與核心酶結(jié)合形成RNA聚合酶全酶。2．全酶以靜電作用和啟動(dòng)子上游非特異性DNA結(jié)合。3．RNA聚合酶全酶沿DNA上下游動(dòng)，包括共有序列在內(nèi)與啟動(dòng)子特異性結(jié)合，全酶結(jié)合后引起DNA片段部分解鏈伸展開約11bp（從-9~+2）4．酶與ATP或GTP結(jié)合，結(jié)合的三磷酸核苷酸形成轉(zhuǎn)錄物的5?末端，剛結(jié)合上的三磷酸核苷3?→OH與下一個(gè)核苷酸生成磷酸酯鍵。所以真核和原核生物的轉(zhuǎn)錄作用以A或G開始。5．當(dāng)全酶繼續(xù)向下游移動(dòng)，約有4個(gè)核苷酸與ATP（GTP）進(jìn)行聚合。δ亞基從全酶上解離，核心酶繼續(xù)合成。新RNA鏈生長(zhǎng)方向是5?→3?，新合成的RNA鏈與被轉(zhuǎn)錄的DNA鏈互補(bǔ)，反平行。SigmaSubunitsofRNAPolymeraseRecognizePromoterSites五起始SigmaSubunitsofRNAPo138中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成139六RNA鏈的延長(zhǎng)RNA鏈的延長(zhǎng)是5′→3′方向，按堿基互補(bǔ)原則依次連接核苷酸，每秒合成最大速度為50個(gè)核苷酸，轉(zhuǎn)錄由啟動(dòng)子至終止子RNA聚合酶全酶識(shí)別起始位點(diǎn)，合成幾個(gè)磷酸二酯鍵，希格瑪亞基釋出核心酶繼續(xù)催化，酶沿著DNA摸板3′→5′移動(dòng)，前面的DNA雙股漸打開，轉(zhuǎn)錄過的區(qū)域又形成雙股DNA。轉(zhuǎn)錄中DNA雙股中只有一股為摸板鏈

5‘端是pppG

或pppA

從頭合成，第二個(gè)核苷酸就與ATP（或GTP）的3?-OH形成3?，5?-磷酸二酯鍵繼而參入RNA鏈。在參入核苷酸的過程中重復(fù)形成3?，5?-磷酸二酯鍵構(gòu)成轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)階段，此階段RNA鏈不斷延伸。RNA聚合酶后面的DNA恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)?shù)竭_(dá)DNA的一個(gè)特殊位點(diǎn)時(shí)，轉(zhuǎn)錄即停止。RNA聚合酶無校對(duì)功能故轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)的誤差是復(fù)制的10萬倍。由于一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物很多因而可以耐受如此大的誤差。六RNA鏈的延長(zhǎng)RNA鏈的延長(zhǎng)是5′→3′方向，按堿基互補(bǔ)140中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成141終止包括：停止RNA鏈的延長(zhǎng)

新生RNA鏈的釋放RNA聚合酶從DNA上釋放原核生物的終止子?原核生物的終止子在終止點(diǎn)之前均有一個(gè)回文結(jié)構(gòu)，其產(chǎn)生的RNA可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。在終點(diǎn)前還有一系列U,回文對(duì)稱區(qū)通常有一段富含G-C的序列。七RNA鏈的終止終止包括：停止RNA鏈的延長(zhǎng)七RNA鏈的終止142TerminationSignal.Aterminationsignalfoundatthe3endofanmRNAtranscriptconsistsofaseries

ofbasesthatformastablestem-loopstructureandaseriesofUresidues.TerminationSignal.Aterminat143中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成144中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成145大腸桿菌的兩類終止子?依賴于rho(ρ)終止子；必須在rho(ρ)存在下發(fā)生終止。此類終止子其回文結(jié)構(gòu)不富含G-C區(qū),回文結(jié)構(gòu)之后也無寡聚U。?

不依賴于rho(ρ)終止子(簡(jiǎn)單終止子)；此類終止子除能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)外，在終點(diǎn)有6個(gè)U核苷酸,回文對(duì)稱去有一段富含G-C序列。

rho(ρ);分質(zhì)量為46000的蛋白質(zhì)，通常以6聚體的形式存在。在有RNA存在時(shí)它能水解三磷酸腺苷，rho(ρ)可沿RNA鏈移動(dòng)。有rho(ρ)時(shí)合成RNA鏈短。無rho(ρ)時(shí)合成RNA鏈長(zhǎng)。大腸桿菌的兩類終止子?依賴于rho(ρ)終止子；必須在r146E.coli的轉(zhuǎn)錄終止有兩種機(jī)制★不依賴rho因子的終止機(jī)制。在富含A/T的DNA基礎(chǔ)上，前段還富含G/C的節(jié)段，富含G/C的RNA轉(zhuǎn)錄物自身回折形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的末端還有一連續(xù)U堿基序列可與模板鏈A堿基序列互補(bǔ)，當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，迫使聚合酶暫時(shí)停止作用?！镆蕾噐ho(ρ蛋白)因子的終止機(jī)制。在無A/T和G/C富含節(jié)段發(fā)生的，需rho參加，rho因子是由相同的6個(gè)亞基組成的寡聚蛋白質(zhì)。rho蛋白只有在單鏈RNA存在的情況下水解ATP與新生單鏈RNA結(jié)合。rho蛋白的ATP酶活性使rho蛋白沿新生RNA鏈轉(zhuǎn)錄泡單方向移動(dòng)。將RNA－DNA分開，終止轉(zhuǎn)錄。E.coli的轉(zhuǎn)錄終止有兩種機(jī)制★不依賴rho因子的終止機(jī)制147Effectofrho

ProteinOntheSizeofRNATranscripts.EffectofrhoProteinOntheS148MechanismFortheTerminationofTranscriptionbyrProtein.ThisproteinisanATP-dependent

helicasethatbindsthenascentRNAchainandpullsitawayfromRNApolymeraseandtheDNAtemplate.

MechanismFortheTermination149中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成150中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成151八RNA生物合成的抑制劑嘌呤和嘧啶的類似物

人工合成的堿基類似物DNA摸板功能的抑制物

烷化物放線菌素嵌入染料

RNA聚合酶的抑制物

利福酶素利鏈菌素八RNA生物合成的抑制劑嘌呤和嘧啶的類似物152中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成153中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成154中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成155中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成156中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成157中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成158中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成159中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成160九RNA轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后的RNA最初是以一種完全沒有活性的形式存在，稱為初級(jí)轉(zhuǎn)錄物（primarytranscript）。這種初級(jí)轉(zhuǎn)錄物需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加工，使之轉(zhuǎn)變成有活性和成熟的RNA。轉(zhuǎn)錄后的加工包含3種共有的分子變化：1從初級(jí)轉(zhuǎn)錄物上移去核苷酸；2給轉(zhuǎn)錄物添加上核苷酸；3轉(zhuǎn)錄物中特殊堿基的修飾。

九RNA轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后的RNA最初是以一種完全沒有活性的161?原核生物的rRNA

的加工?真核生物的rRNA

的加工?原核生物的tRNA的加工?原核生物的mRNA的加工?真核生物的mRNA的加工?原核生物的rRNA的加工162核糖體RNA（rRNA）前體和轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）前體的加工

1．原核生物的rRNA前體沉降系數(shù)是30S含有一個(gè)拷貝的5S，16S，23SrRNA和幾個(gè)tRNA前體。2．真核生物的rRNA前體沉降系數(shù)為35~47S，含有一個(gè)拷貝的5.8S，18S和28SrRNA。第四個(gè)真核rRNA即5SRNA只有一個(gè)單獨(dú)的前體。經(jīng)RNA酶切割前導(dǎo)序列成為成熟的核糖體RNA。3．原核和真核的tRNA的轉(zhuǎn)錄過程也是先合成大的前體。大多數(shù)真核tRNA前體在反密碼子附近有一個(gè)內(nèi)含子，并含有前導(dǎo)序列。經(jīng)專一的核酸酶連續(xù)作用將它們切除，用CCA-OH替代3?端UU后而成為成熟的tRNA。核糖體RNA（rRNA）前體和轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）前體的加163PrimaryTranscript.Cleavageofthistranscriptproduces5S,16S,and23SrRNAmoleculesandatRNA

molecule.Spacerregionsareshowninyellow.PrimaryTranscript.Cleavageo164中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成165中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成166中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成167酵母移去14個(gè)核苷酸前導(dǎo)序列酵母移去14個(gè)核苷酸前導(dǎo)序列168中農(nóng)生物化學(xué)課件第17章RNA的合成169TransferRNAPrecursorProcessing.TheconversionofayeasttRNAprecursorintoamaturetRNA

requirestheremovalofa14-nucleotideintron(yellow),thecleavageofa5leader(green),andtheremovalofUUand

theattachmentofCCAatthe3end(red).Inaddition,severalbasesaremodified.TransferRNAPrecursorProcess170★核酸酶核酸酶P是專一的核糖核酸酶。催化大多數(shù)tRNA前提產(chǎn)生分子的5′端（切除前導(dǎo)序列形成pG）。由-RNA分子（377核苷酸）和一個(gè)蛋白質(zhì)分子組成，保持完整的酶活性兩者都需要。但催化亞基是RNA而不是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)只起保持RNA正確折疊和最大的催化活性。核酸酶P（ribozyme）是一種具有工具酶一樣催化活性的核酸?！锖怂崦负怂崦窹是專一的核糖核酸酶。催化大多數(shù)tRNA前提171mRNA的加工1．原核mRNA不進(jìn)行加工，轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)同時(shí)進(jìn)行。2．真核生物mRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物要經(jīng)過剪接外顯子、戴帽、多聚腺苷酸化等加工過程。a.外顯子剪接許多真核基因是以不連續(xù)基因或割裂基因出現(xiàn)。有些序列戴有遺傳信息，為RNA節(jié)段編碼，稱為外顯子，有些序列不為RNA編碼，但含有某些調(diào)控成分，這種插入的序列稱為內(nèi)含子。內(nèi)含子將一個(gè)外顯子與另一個(gè)外顯子分隔開，mRNA前體中存在內(nèi)含子和外顯子的相應(yīng)序列。加工過程主要是切除內(nèi)含子后連接外顯子。它是由核內(nèi)小RNA（snRNA）和核內(nèi)小核糖核糖白（s