干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

王春芳干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!部分干細(xì)胞的概念干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!人體并不是由一種細(xì)胞構(gòu)成，而是由２００多種細(xì)胞構(gòu)成的，例如神經(jīng)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞等等。不同的細(xì)胞擔(dān)負(fù)著不同的功能，但是所有這些細(xì)胞，都是由一個(gè)細(xì)胞—受精卵發(fā)育而來的。“全能性”的受精卵在發(fā)育過程中，不僅不斷地分裂使細(xì)胞的數(shù)目增加，而且還不斷地分化使細(xì)胞的種類增加。所謂“干細(xì)胞”，就是指那些未分化、因而有可能分化成不同類型細(xì)胞的細(xì)胞。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!干細(xì)胞的概念及分類

干細(xì)胞（Stemcell）:

指存在于胚胎直至成體的具有增殖、自我更新（self-renewal）以及分化潛能的原始細(xì)胞。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!分類(按分化潛能分類）全能干細(xì)胞（totipotentstemcells）、多能干細(xì)胞（pluripotentstemcell）單能干細(xì)胞（monopotentstemcell）或稱為專能干細(xì)胞（mittedstemcell）。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!Fromeggtoblastocyte(human)干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!

多能干細(xì)胞是指那些分化潛能很“寬”，可分化為多種類型細(xì)胞的原始細(xì)胞.如胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES細(xì)胞）、胚胎生殖細(xì)胞（embryonicgermcell）、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bonemarrowstromalstemcell）、神經(jīng)干細(xì)胞.干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!按照生存階段分類：

胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞（adultstemcell；somaticstemcells），也稱為組織干細(xì)胞（tissuestemcells）。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!ES細(xì)胞的建系干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!成體干細(xì)胞指存在于各組織器官的未分化細(xì)胞。在體內(nèi)，它們具有終生自我更新（self-renewal）能力和分化潛能。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!成體干細(xì)胞根據(jù)來源分為：骨髓干細(xì)胞

神經(jīng)干細(xì)胞上皮干細(xì)胞肝干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞皮膚干細(xì)胞脂肪干細(xì)胞干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!造血細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分化干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!第二部分干細(xì)胞的基本特性

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!一、干細(xì)胞的基本特征（一）干細(xì)胞的形態(tài)和生化特征1．形態(tài)特征：干細(xì)胞通常呈圓形或橢圓形，體積較小，核質(zhì)比較大，胞內(nèi)細(xì)胞器稀少，細(xì)胞內(nèi)RNA含量低。根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征和存在位置、分子標(biāo)記可以辨認(rèn)不同的干細(xì)胞，目前有的干細(xì)胞位置已經(jīng)確定。例如神經(jīng)干細(xì)胞主要分布于室下帶、海馬、紋狀體、嗅球等區(qū)域。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!(二)干細(xì)胞的生物學(xué)特征1．干細(xì)胞的自我更新特征干細(xì)胞在體內(nèi)終生都具有自我更新能力，這與祖細(xì)胞（具有優(yōu)先更新能力）不同。其自我更新能力是通過不對稱分裂(asymmetrydivision)和對稱分裂(symmetrydivision)這兩種形式實(shí)現(xiàn)的。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!2．細(xì)胞的增殖特征1）干細(xì)胞增殖的緩慢性一般情況下,干細(xì)胞處于休眠或緩慢增殖狀態(tài),當(dāng)其接受刺激,分化時(shí)，首先要經(jīng)過一個(gè)短暫的增殖期，產(chǎn)生過渡放大細(xì)胞(transitamplifyingcell)或稱為“短暫擴(kuò)充細(xì)胞”,經(jīng)若干次分裂后產(chǎn)生分化細(xì)胞。過渡放大細(xì)胞的作用是可以通過較少干細(xì)胞產(chǎn)生較多的分化細(xì)胞,同時(shí)保護(hù)干細(xì)胞。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!維持自我穩(wěn)定性是通過多種形式來實(shí)現(xiàn)。首先，當(dāng)干細(xì)胞分裂時(shí)，無脊椎動(dòng)物的干細(xì)胞常以不對稱分裂來維持自身數(shù)目的恒定。哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞常常以對稱分裂和不對稱分列這兩種形式進(jìn)行，但對于群體而言仍然是不對稱分裂。通過這兩種分裂方式協(xié)調(diào)，保證干細(xì)胞數(shù)目相對衡定，同時(shí)更適應(yīng)組織再生的需要。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!

3．干細(xì)胞的分化特征1）干細(xì)胞的分化潛能干細(xì)胞的分化具有多潛能性，但不同的干細(xì)胞具有的分化潛能不同。

2）干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和去分化一種組織類型的干細(xì)胞在適當(dāng)條件下可以分化為另一種組織類型的細(xì)胞，稱為干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(transdifferentiation)或橫向分化。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!在干細(xì)胞的微環(huán)境中，對干細(xì)胞影響最大的主要包括以下三個(gè)方面：（一）分泌因子（二）細(xì)胞間相互作用（三）胞外基質(zhì)干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!四、世界各國對于干細(xì)胞研究的政策

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!2004年，英國成立了世界家政府性干細(xì)胞銀行，該銀行包括兩個(gè)“存儲”人類胚胎細(xì)胞的分支機(jī)構(gòu)。它們分別是英國的國王學(xué)院和紐卡斯?fàn)柕纳芯恐行?；布萊爾政府對干細(xì)胞研究也表示強(qiáng)烈支持，希望借此保障英國生物技術(shù)在歐洲的領(lǐng)先地位。此外，英國成功創(chuàng)建了英格蘭東部地區(qū)干細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，以加強(qiáng)該地區(qū)干細(xì)胞研究相關(guān)的學(xué)術(shù)、臨床與商業(yè)機(jī)構(gòu)的協(xié)作，促進(jìn)干細(xì)胞研究的創(chuàng)新及其應(yīng)用，并使該地區(qū)成為未來干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)發(fā)展的領(lǐng)導(dǎo)區(qū)域。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!2008年10月，英國議會下院以355票對129票的壓倒性多數(shù)票通過《人工授精與胚胎學(xué)法案》，允許以醫(yī)學(xué)研究為目的的人獸胚胎研究。這是首次表決通過完整的法案草案，意味英國20年來備受爭議的人獸胚胎研究有望首次獲得明確法律支持。這一法案的通過有利于英國奠定干細(xì)胞研究和無性繁殖領(lǐng)域的優(yōu)勢地位。此前的4月，紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)科學(xué)家4月初宣布，用人體皮膚細(xì)胞的細(xì)胞核和剔除了遺傳信息的牛卵細(xì)胞，成功培育出英國首個(gè)人與動(dòng)物的混合胚胎。這一胚胎存活3天，被用于醫(yī)學(xué)研究。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!在干細(xì)胞研究方面，美國一直處于世界領(lǐng)先地位。從最初的骨髓移植算起，干細(xì)胞研究在美國已有30多年的歷史。尤其是上世紀(jì)90年代末期，美國科學(xué)家成功實(shí)現(xiàn)人類胚胎干細(xì)胞在體外的生長和增殖，從而掀起了全世界干細(xì)胞工程研究的熱潮。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!奧巴馬3月9日在白宮簽署命令，解除對于用政府經(jīng)費(fèi)資助人類胚胎干細(xì)胞研究的限制。奧巴馬說，作為一個(gè)有信仰的人，我相信人類應(yīng)該盡其所能解除病人的痛苦。奧巴馬此舉將使國家衛(wèi)生總署得以考慮向科學(xué)家提供用于研究數(shù)百種干細(xì)胞株的經(jīng)費(fèi)。有關(guān)人士表示，此舉將有助于加快美國干細(xì)胞的研究步伐，從而早日為飽受糖尿病、帕金森綜合征等疑難病困擾的患者帶來福音。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!德國總理施羅德表示德國可以從鄰國進(jìn)口那些“在本國已被禁止，但鄰國依然允許”的東西。德國衛(wèi)生部長菲舍爾也立即表態(tài)，說德國可以進(jìn)口胚胎人類干細(xì)胞進(jìn)行科學(xué)研究。這意味著一個(gè)讓人啼笑皆非的局面——強(qiáng)烈反對英國克隆胚胎提取干細(xì)胞的德國將從英國人手中購買干細(xì)胞！

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!日本：

日本在2000年度啟動(dòng)的“千年世紀(jì)工程”中，把干細(xì)胞工程作為四大重點(diǎn)之一，并把干細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)視為生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域超過歐美的決好機(jī)遇。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!

韓國科學(xué)家黃禹錫在干細(xì)胞研究領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!黃禹錫認(rèn)為，對于我們的技術(shù)會被利用于復(fù)制人類的疑心是沒有根據(jù)的，我們所研究的是治療性克隆，是為了制造能夠用于治療的細(xì)胞，而不是復(fù)制人類的生殖性克隆，這兩種技術(shù)存在本質(zhì)不同。不要說別人偷走我們的技術(shù)，就是我自己現(xiàn)在想克隆人我都不會，技術(shù)上是不行的。那些說已經(jīng)克隆出人類的，都是謊話。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!此前以克隆羊多莉?yàn)殚_始，人們用體細(xì)胞核替換法克隆出老鼠、牛、豬、貓等10多種哺乳動(dòng)物，但是由于狗的卵子較為奇特，在克隆技術(shù)上的瓶頸一直未能突破。其他動(dòng)物在卵巢中能夠輕易提取出成熟的卵子，但是狗在排卵時(shí)出現(xiàn)的是未成熟的卵子，因此無法馬上用在克隆上。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!美國《科學(xué)》雜志１１日宣布，韓國和美國科學(xué)家成功克隆出了人類早期胚胎，并從中提取出胚胎干細(xì)胞。這是科學(xué)家首次利用克隆技術(shù)獲得人類胚胎干細(xì)胞。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!科學(xué)家們從這些胚囊中分離出２０個(gè)內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)，并在此基礎(chǔ)上最終獲得一個(gè)人類胚胎干細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)顯示，利用這種辦法獲得的胚胎干細(xì)胞具有多能性，可分化成骨骼細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和未成熟的腦細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!韓國研究人員表示，新成果給治療性克隆的應(yīng)用“打開了大門”?！犊茖W(xué)》雜志總編肯尼迪評論說，新成果確實(shí)令人鼓舞，但也應(yīng)該認(rèn)識到，胚胎干細(xì)胞技術(shù)可能還需幾年才能真正投入應(yīng)用。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!2004年2月,黃禹錫研究小組在美國《科學(xué)》雜志上發(fā)表論文,聲稱成功通過人類體細(xì)胞克隆早期胚胎而提取了干細(xì)胞,為世界首例。2005年5月,他的研究小組又在《科學(xué)》雜志上發(fā)表論文,聲稱培育出與患者的基因相匹配的胚胎干細(xì)胞,這被認(rèn)為是在治療疑難病癥方面取得的突破性進(jìn)展,因而引起國際科學(xué)界的轟動(dòng),也給韓國帶來巨大榮譽(yù)。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!盡管否定了黃禹錫兩篇論文，但調(diào)查委員會承認(rèn)，全球首條克隆狗“斯納皮”確系黃禹錫科研成果。這或許是調(diào)查報(bào)告唯一能令黃禹錫感到欣慰的一點(diǎn)。

調(diào)查委員會說,黃禹錫領(lǐng)導(dǎo)的科研小組能克隆出“斯納皮”,說明他們的確掌握了一定技巧,但是這項(xiàng)技術(shù)在克隆技術(shù)方面并不突出。鄭明熙說:“他們掌握的只是基礎(chǔ)技術(shù),畢竟他們沒有培育出與患者DNA匹配的胚胎干細(xì)胞系。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!這不由得令人又要想起韓國的克隆英雄黃禹錫。根據(jù)2006年1月10日首爾大學(xué)調(diào)查委員會公布的最終調(diào)查結(jié)果，雖然認(rèn)定黃禹錫2004年與2005年發(fā)表在美國《科學(xué)》周刊上的有關(guān)治療性克隆的干細(xì)胞研究成果屬于造假，但對他培育出首例克隆狗的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，科學(xué)界仍然沒有否認(rèn)。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!這一次，由哈佛大學(xué)教授達(dá)利（G.Daley）領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)在《細(xì)胞干細(xì)胞》雜志上的文章表明：2004年黃禹錫博士發(fā)表在《科學(xué)》上的成果，已被他們確認(rèn)，黃禹錫建立干細(xì)胞系的方法很可能是一項(xiàng)歷史性的創(chuàng)舉。達(dá)利教授表示，他們研究了黃禹錫論文中報(bào)道的那些干細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)其中有些不是來源于核移植體細(xì)胞克隆，而是通過另一條“單性生殖”技術(shù)路線產(chǎn)生的，也就是說是通過對未受精的卵細(xì)胞進(jìn)行單性培育得到的，它們的細(xì)胞遺傳特性與卵子提供者的細(xì)胞一致，與通過治療性克隆得到的干細(xì)胞一樣，可用于對供體的細(xì)胞移植。達(dá)利教授等人的論文正式確認(rèn)了這一獲取干細(xì)胞的新方法。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!中國

我國在干細(xì)胞研究方面已經(jīng)取得了和世界同步的發(fā)展。北京大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、上二醫(yī)和四川大學(xué)等高等院校和科研單位相繼成立了專門的干細(xì)胞研究機(jī)構(gòu)。2000年10月，國家干細(xì)胞基因工程產(chǎn)業(yè)化基地正式在天津華苑產(chǎn)業(yè)園區(qū)落成，將建設(shè)成為我國最大的干細(xì)胞庫、干細(xì)胞移植中心以及相關(guān)科研用基地及產(chǎn)業(yè)化基地。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!1.把一種組織的成體干細(xì)胞直接移植給相應(yīng)組織損傷的病人以期治療疾病。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!3.干細(xì)胞技術(shù)的理想階段就是希望在體外進(jìn)行“器官克隆”以供病人移植，雖然“器官克隆”的名詞已不再陌生，但真正在體外形成一個(gè)具有空間結(jié)構(gòu)和正常生理功能的人體器官，絕不是五、六年就能實(shí)現(xiàn)的，短期內(nèi)這只不過是一個(gè)“美好的愿望”。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!iPS細(xì)胞干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!干細(xì)胞是一種“原初”類型的細(xì)胞，具有分化成各種組織細(xì)胞的潛能，成體身上的各種細(xì)胞都是早期胚胎中的原初細(xì)胞不斷增殖和分化的結(jié)果。因此，一旦某些組織和器官出了問題，人們可以取出自己的體細(xì)胞，想辦法讓它們回復(fù)到胚胎時(shí)期的干細(xì)胞狀態(tài)，再輸入到病變組織，通過干細(xì)胞的增殖和分化重建病變組織，或在體外培養(yǎng)分化成實(shí)體器官再植入體內(nèi)。因最初的來源就是自己的細(xì)胞，不會出現(xiàn)排異反應(yīng)。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!逆轉(zhuǎn)錄病毒是基因治療中一種運(yùn)載基因的工具，它可以像病毒感染細(xì)胞一樣結(jié)合到細(xì)胞上，將攜帶的基因注入細(xì)胞。通過這個(gè)擺渡工具，那些具有調(diào)節(jié)作用的“返老還童”基因就進(jìn)入了細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞回復(fù)到原初狀態(tài)。這其實(shí)也是一種“基因治療”策略：一般的基因治療是將具有治療作用的基因?qū)爰?xì)胞進(jìn)行表達(dá)，而“雞尾酒”方法導(dǎo)入的則是“返老還童”基因。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!誘導(dǎo)性多功能干(inducedhumanpluripotentstem,iPS)細(xì)胞，也稱誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞。iPS是由一些多能遺傳基因?qū)肫つw等受體細(xì)胞中制造而成，然后進(jìn)一步進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，得到理想的細(xì)胞模型。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!Oct4

Oct4是POU家族的轉(zhuǎn)錄因子,維持細(xì)胞的多能性,是體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞所必須的基因。在小鼠和人的ES細(xì)胞中,Oct4表達(dá)的抑制將會導(dǎo)致自發(fā)性分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞。Niwa等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Oct-4能夠維持ES細(xì)胞未分化狀態(tài)并促進(jìn)其增殖,并認(rèn)為Oct-4的活化是重編程為多能干細(xì)胞的標(biāo)志。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!c-Myc和Klf4

c-Myc和Klf4不是iPS細(xì)胞形成所必須的基因,其作用是提高克隆形成的效率,當(dāng)同時(shí)將二者去除時(shí)iPS細(xì)胞將不能生成,因此c-Myc和Klf4在iPS細(xì)胞產(chǎn)生的過程中同樣重要。c-Myc是在人類癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的卟啉-原癌基因,盡管c-Myc可以提高iPS細(xì)胞克隆形成率,但其構(gòu)建的嵌合體小鼠約20%發(fā)生了腫瘤。所以如果將iPS細(xì)胞用于臨床治療,c-Myc基因的轉(zhuǎn)入必須慎重。Klf4即是抑癌基因又是原癌基因,一方面可以促進(jìn)ES細(xì)胞的自我更新,另一方面在體細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)可抑制DNA的復(fù)制,阻滯細(xì)胞周期于G1/S期,因此它在細(xì)胞增殖和分化之間起開關(guān)作用。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁!如果從這4種遺傳基因中排除導(dǎo)致細(xì)胞癌化的遺傳基因，只使用3種基因，過去的導(dǎo)入效率只有0.001％甚至低，而加入“巴爾普羅酸”之后，其效率也提高了約50倍。研究人員認(rèn)為，這很可能是因?yàn)椤鞍蜖柶樟_酸”可以促進(jìn)多能遺傳基因的活性。今后，研究人員將就添加化合物是否會使遺傳基因產(chǎn)生變異展開研究，以在提高制造效率的同時(shí)保證安全性。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁!iPS技術(shù)具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，利用iPS技術(shù)能夠獲得病人或者疾病特異的多能性干細(xì)胞，這樣可以避免移植過程中的免疫排斥問題，也繞開了人類胚胎干細(xì)胞研究所帶來的倫理問題。此外，掌握疾病特異性iPS細(xì)胞向相應(yīng)疾病中的功能細(xì)胞定向誘導(dǎo)的技術(shù)方法，以此作為模型研究這些疾病的發(fā)病機(jī)制，利用以上疾病模型，對現(xiàn)有藥物做出個(gè)體化的評估，并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和篩選新的藥物，將為這些重大性疾病的基礎(chǔ)和臨床研究開辟新的研究方法和技術(shù)平臺。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁!2008年４月，美國加利福尼亞大學(xué)科學(xué)家報(bào)告稱，他們將實(shí)驗(yàn)鼠皮膚細(xì)胞改造成iPS細(xì)胞，然后成功使其分化成心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及造血細(xì)胞。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁!2009年3月伊始，iPS細(xì)胞研究便相繼迎來兩項(xiàng)重大突破。英國和加拿大科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了不借助病毒、安全將普通皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞的方法；美國科學(xué)家則在《細(xì)胞》雜志上宣布，他們可以將iPS細(xì)胞中因轉(zhuǎn)化需要而植入的有害基因移除，且保證由此獲得的神經(jīng)元細(xì)胞的基本功能不受影響。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁!2010年7月27日，日本京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所中川誠人講師的研究小組發(fā)現(xiàn)，制取iPS細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄基因中某一基因?yàn)橐字掳┗?，?yīng)用目前的技術(shù)克隆出的活體小鼠中一年后的死亡率為７０％，而其中有半數(shù)為得癌而死。該研究小組用一種結(jié)構(gòu)相近的名為「Ｌ－Ｍｙｃ」的轉(zhuǎn)錄基因取代這一基因制取人體干細(xì)胞，得到的干細(xì)胞數(shù)量是之前的5倍，而且將這一技術(shù)應(yīng)用于克隆活體小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，活體小鼠的死亡率降到了１０％。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁!當(dāng)然，這種方法也有弊端：逆轉(zhuǎn)錄病毒這個(gè)運(yùn)載工具畢竟是病毒，萬一它們在細(xì)胞里進(jìn)行病毒復(fù)制，可能誘發(fā)腫瘤。但是，基因發(fā)揮調(diào)節(jié)功能一般都是通過相關(guān)的化學(xué)小分子實(shí)現(xiàn)的，因此可以預(yù)期，以目前這個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展速度，在不久的將來，科學(xué)家應(yīng)該可以對這種方法進(jìn)行改良：只需給細(xì)胞添加一些可誘導(dǎo)發(fā)育逆轉(zhuǎn)的小分子藥物，就能啟動(dòng)發(fā)育逆轉(zhuǎn)的開關(guān)，得到人們自己的干細(xì)胞。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁!胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)原理

胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)的原則是:在促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖的同時(shí)，維持其未分化二倍體狀態(tài)。胚胎干細(xì)胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍體正常核型的細(xì)胞則會大大降低形成嵌合體(chimera)的能力，特別是進(jìn)入種系形成生殖細(xì)胞的能力。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁!MEF和STO都能分泌促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖和抑制胚胎干細(xì)胞自主分化的因子。MEF和STO培養(yǎng)上清中抑制胚胎干細(xì)胞自主分化因子--白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor；LIF）含量在500～1000IU/ml（分泌型）,同時(shí)在MEF和STO基質(zhì)上還存在LIF（基質(zhì)型）。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第55頁!細(xì)胞可作為飼養(yǎng)層的細(xì)胞有二類:小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)和已建系的SIM小鼠成纖維細(xì)胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系STO細(xì)胞。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第56頁!胚胎干細(xì)胞有飼養(yǎng)層培養(yǎng)

1）用絲裂霉素-C或γ－射線處理后的飼養(yǎng)細(xì)胞種植到預(yù)先用明膠處理的φ1cm的培養(yǎng)孔內(nèi)，做成飼養(yǎng)單層。

2）將分散的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)小塊吸置飼養(yǎng)層上。一個(gè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞放置一個(gè)孔。37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第57頁!（2）胚胎采集

1）斷頸處死懷孕3.5d的母小鼠,在無菌條件下打開腹腔,暴露子宮。

2）鑷住近子宮頸端并剪斷,分離子宮系膜,在輸卵管端剪斷子宮角。

3）

取出子宮,在無菌濾紙上吸干血跡,置入無菌平皿內(nèi)。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第58頁!（3）胚胎培養(yǎng)

1）

取φ3.5cm平皿,用記號筆劃分四等分。在每等分內(nèi)加入胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液做成露滴狀液滴,每個(gè)液滴直徑為0.5～1cm。

2）向平皿內(nèi)加入透明石蠟油，以能覆蓋培養(yǎng)液滴為度。

3）將收集好的3.5d胚胎吸置培養(yǎng)液滴內(nèi)。37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天半量換液一次。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第59頁!4）將毛細(xì)吸管一端在火焰上拉細(xì)，用砂輪將末端切斷。準(zhǔn)備末端口徑比內(nèi)細(xì)胞團(tuán)稍大和稍小兩種。

5）

取φ3.5cm的平皿，在平皿內(nèi)做消化液小滴。每個(gè)消化液小滴φ0.3～0.5cm。每個(gè)平皿可做20個(gè)消化液小滴。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第60頁!8）將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)吸至另一消化液小滴，在室溫或37℃下作用約1～5min。改用末端口徑比內(nèi)細(xì)胞團(tuán)小的毛細(xì)吸管，輕輕吸吹內(nèi)細(xì)胞團(tuán)塊，使之分散至3～4個(gè)細(xì)胞在一起的小團(tuán)塊。

9）將分散的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)小塊吸至準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)單層上或條件培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)（見后）。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第61頁!胚胎干細(xì)胞的獲得獲得途徑主要有：從早期胚胎獲得2.從原始生殖細(xì)胞獲得3.從移植細(xì)胞(克隆細(xì)胞)獲得干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第62頁!2．從原始生殖細(xì)胞獲得gearhart小組：流產(chǎn)胎兒性腺嵴原始生殖細(xì)胞獲得5個(gè)多能干細(xì)胞系7個(gè)月不分化。

思路：原始生殖細(xì)胞是未分化細(xì)胞。分離培養(yǎng)培養(yǎng)干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第63頁!胚胎干細(xì)胞的主要特征干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第64頁!4.

干細(xì)胞表面免疫原性：一般表達(dá)胚胎早期的表面抗原，而且有種屬差異。如小鼠胚胎干細(xì)胞表達(dá)胚胎階段性特異抗原-1(SSEA-1)，不表達(dá)SSEA-3或SSEA-4；人胚胎干細(xì)胞表達(dá)SSEA-3或SSEA-4。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第65頁!胚胎干細(xì)胞的分化潛能胚胎干細(xì)胞是全能(多能)性干細(xì)胞，具有分化為各種組織細(xì)胞的潛能。移植實(shí)驗(yàn):人胚胎干細(xì)胞小鼠體內(nèi)畸胎瘤(良性)→有三個(gè)胚層產(chǎn)生的組織：胃上皮(內(nèi)胚層)骨、軟骨、平滑肌、橫紋肌等(中胚層)神經(jīng)表皮、神經(jīng)節(jié)復(fù)層磷狀上皮等(外胚層)干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第66頁!骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的有關(guān)基礎(chǔ)研究及應(yīng)用現(xiàn)狀

MSC具備干細(xì)胞的兩個(gè)重要特征:強(qiáng)的自我增殖能力和多分化潛能。具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉(心肌)及神經(jīng)細(xì)胞等組織分化的潛能。MSC起源于中胚層,理論上講,它應(yīng)可以向其它中胚層組織分化。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第67頁!1999年,Pittenger等用地塞米松、β-甘油磷酸等在體外培養(yǎng)條件下將其誘導(dǎo)分化成骨組織;在培養(yǎng)體系中加入ＴＧＦ-3即可促使ＭＳＣ向軟骨分化;用1-methyl-3-isobutylxanthine、地塞米松、胰島素及消炎痛處理,可成功誘導(dǎo)分化為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)富集的脂質(zhì)小泡的脂肪細(xì)胞。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第68頁!國內(nèi)項(xiàng)鵬等首次用硫代甘油和丹參注射液誘導(dǎo)人ＭＳＣ分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶、神經(jīng)絲蛋白。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第69頁!MSC的體外誘導(dǎo)分化亦印證了以上說法。Sanchez-Ramous發(fā)現(xiàn)表皮生長因子或腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可誘導(dǎo)人及小鼠的少數(shù)MSC分化為神經(jīng)元樣及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。Deng等研究證明，用能提高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的誘導(dǎo)劑，如異丁甲基黃嘌呤、二丁酰基cAMP等處理后6d,大約25%的MSC定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并且分化是不可逆的。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第70頁!MSCs在體外分化研究中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元的物質(zhì),包括一些抗氧化劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子以及損傷或正常的神經(jīng)組織勻漿上清液等。Woodbury等用二巰基乙醇(2-ME)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)和丁化羥基苯甲醚(butylatedhydroxyanisole,BHA)等一些抗氧化的物質(zhì)具有誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元作用,表達(dá)神經(jīng)元特有的標(biāo)記如NF、Neu、Tau和NSE等。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第71頁!Jin等應(yīng)用EGF、FGF-2、RA、NGF等不同組合,進(jìn)行誘導(dǎo)MSCs分化,分化細(xì)胞形成神經(jīng)元樣突起,表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物,但是,不同生長因子誘導(dǎo)所表達(dá)的標(biāo)志物在細(xì)胞內(nèi)的分布不同。Chen等發(fā)現(xiàn),用創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的腦提取物培養(yǎng)人的MSCs,則MSCs產(chǎn)生BDNF、NGF、VEGF、HGF顯著增加。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第72頁!MSCs在體內(nèi)分化為神經(jīng)細(xì)胞,其機(jī)制可能更為復(fù)雜。MSCs與宿主腦相互作用導(dǎo)致MSCs自分泌或旁分泌營養(yǎng)因子增加,可能有助于損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)。MSCs分泌巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)、干細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等,還產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(neuralcelladhesionmolecule,N-CAM)和神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)等,這些細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子是細(xì)胞得以存活、生長、分化的重要物質(zhì)。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第73頁!MSC的移植途徑：①直接側(cè)腦室注射，經(jīng)立體定位儀定位后進(jìn)行側(cè)腦室穿刺，將擴(kuò)增的MSC移植于側(cè)腦室，使之隨腦脊液到達(dá)病變部位；②腰穿椎管內(nèi)植入，將擴(kuò)增的MSC移植入蛛網(wǎng)膜下腔，使之隨腦脊液到達(dá)病變部位；③直接注射，符合外科適應(yīng)證的患者，在開顱后將擴(kuò)增的MSC直接注射到病變部位；④靜脈移植，開放血腦屏障，將擴(kuò)增的MSC靜脈輸入，使之通過血腦屏障到達(dá)病變部位。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第74頁!當(dāng)然，該領(lǐng)域的研究尚處于探索階段，目前還存在很多問題有待解決：(1)對MSC本身特性的研究，它的真正起源，實(shí)際利用希望得到純的干細(xì)胞成分，但實(shí)驗(yàn)證明體外的MSC均為各種細(xì)胞的混雜，如何能夠獲得純的MSC，尚需進(jìn)一步研究；（2）MSC的增殖、分化的控制需要合適的條件，如何使既控制增殖，避免發(fā)生腫瘤，又能在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候啟動(dòng)所需要的途徑進(jìn)行分化，有待于進(jìn)一步探索；干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第75頁!神經(jīng)干細(xì)胞干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第76頁!1989年，Temple等從13天大鼠胚胎腦隔區(qū)取出細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞發(fā)育成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。其后從成年鼠紋狀體、海馬齒狀回等處分離出能在體外不斷增殖，并具有向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化潛能的細(xì)胞群。20世紀(jì)90年代后，許多實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，人腦內(nèi)也同樣存在神經(jīng)干細(xì)胞。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第77頁!神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志

1990年，Lendahl的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白是神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白（nestin）.Nestin在神經(jīng)胚形成時(shí)開始表達(dá)，隨著神經(jīng)細(xì)胞的遷移和分化的完成，Nestin的表達(dá)量逐漸下降甚至完全停止。目前，Nestin已被用于神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第78頁!神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)從相應(yīng)的部位取出組織后，用機(jī)械吹打的方法或是胰酶消化的方法使之成為單細(xì)胞懸液，在含有EGF和/或bFGF的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一段時(shí)間以后，除干細(xì)胞外的其他細(xì)胞會逐漸死亡，而神經(jīng)干細(xì)胞則增殖形成克隆球。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第79頁!神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用

使損傷或病變的中樞神經(jīng)組織恢復(fù)相應(yīng)的功能，是人類多年來一直未能解決的治療難題。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)損傷和腦退行性變的治療提供了可能的途徑。目前，神經(jīng)干細(xì)胞在應(yīng)用方面的研究主要集中在以下兩方面：1.替代2.為損傷的細(xì)胞提供一種修復(fù)的微環(huán)境干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第80頁!2.為損傷的細(xì)胞提供修復(fù)的微環(huán)境

以神經(jīng)干細(xì)胞為載體的基因治療把中樞神經(jīng)系統(tǒng)的先祖細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞分離出來，導(dǎo)入外源性原癌基因，可以在體外建成細(xì)胞系，即形成所謂永生祖細(xì)胞系或干細(xì)胞系。永生化神經(jīng)干細(xì)胞系可在體外長期大量增殖，同時(shí)可被轉(zhuǎn)染并在宿主體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)外源基因，將這些細(xì)胞植入損傷的神經(jīng)系統(tǒng)可作為基因治療的新策略。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第81頁!干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第82頁!所有的干細(xì)胞都具有兩個(gè)最為顯著的特征：一是不斷增殖、自我更新;二是在適宜的環(huán)境條件下可分化并產(chǎn)生不同類型的細(xì)胞。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第83頁!哺乳類胚胎卵裂干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第84頁!

全能干細(xì)胞是指能發(fā)育成為一個(gè)完整個(gè)體的原始細(xì)胞。受精卵、人體8細(xì)胞以前的胚胎每一個(gè)卵裂球都能發(fā)育成為一個(gè)完整個(gè)體，是全能干細(xì)胞。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第85頁!

單能干細(xì)胞，只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型細(xì)胞分化，如表皮組織基底層的干細(xì)胞、肌肉中的成肌細(xì)胞或叫肌衛(wèi)星細(xì)胞（satellitecell），神經(jīng)元干細(xì)胞只能分化為神經(jīng)元，膠質(zhì)干細(xì)胞只能分化為膠質(zhì)細(xì)胞等。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第86頁!

胚胎干細(xì)胞，是存在于早期胚胎組織中，具有高度增殖能力和多向分化潛能，能分化為三個(gè)胚層所有細(xì)胞類型的原始細(xì)胞。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第87頁!Allofthebodytissuesarefromthe

inner

cellmass(內(nèi)細(xì)胞團(tuán))Blastocyste(胚泡)Innercellmass(內(nèi)細(xì)胞團(tuán))干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第88頁!

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第89頁!

根據(jù)胚胎干細(xì)胞來源不同，分為：ES細(xì)胞（embryonicstemcells）,來自囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。EC細(xì)胞(embryoniccarcinomacells)，由畸胎癌（teratocarcinorma)中分離、篩選出的具有增殖，自我更新能力的細(xì)胞。EG細(xì)胞（embryonicgermcells)，由原始生殖細(xì)胞（primordialgermcells)中分離獲得。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第90頁!EScellsEGcellsCarcinomacells干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第91頁!

成體干細(xì)胞具有可塑性（plasticity）或橫向分化的特性。這是指某種組織的成體干細(xì)胞可分化為另一種組織的特異細(xì)胞的能力。例如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等.

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第92頁!已知的成體干細(xì)胞干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第93頁!一、干細(xì)胞的基本特征（一）干細(xì)胞的形態(tài)和生化特征(二)干細(xì)胞的生物學(xué)特征二、干細(xì)胞生存的微環(huán)境三、干細(xì)胞的命運(yùn)四、世界各國對于干細(xì)胞研究的政策干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第94頁!2．生化特征：不同的干細(xì)胞具有不同的生化標(biāo)志，如角蛋白15是確定毛囊中表皮干細(xì)胞的標(biāo)志分子，nestin為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志分子。利用標(biāo)志分子確定干細(xì)胞位置、尋找和分離干細(xì)胞有重要意義。干細(xì)胞都具有較高的端粒酶活性，這與其增殖能力密切相關(guān)。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第95頁!對稱分裂如果產(chǎn)生的兩個(gè)子代細(xì)胞都是干細(xì)胞或都是分化細(xì)胞，稱為對稱分裂。不對稱分裂如果產(chǎn)生一個(gè)子代干細(xì)胞和一個(gè)子代分化細(xì)胞則稱為不對稱分裂。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第96頁!2）干細(xì)胞增殖的自穩(wěn)定性自我維持(self-maintenance)或自穩(wěn)定性是指干細(xì)胞可以在生物個(gè)體生命區(qū)間自我更新并維持其自身數(shù)目相對恒定性，這也是干細(xì)胞的基本特征之一。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第97頁!干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第98頁!

二、干細(xì)胞生存的微環(huán)境

干細(xì)胞在機(jī)體組織中的居所稱為干細(xì)胞巢(stemcellniche)。在干細(xì)胞巢中所有控制干細(xì)胞增殖與分化的外部信號構(gòu)成了干細(xì)胞生存的微環(huán)境。干細(xì)胞是處于靜息、休眠狀態(tài)，還是處于分化狀態(tài)，如處于分化狀態(tài)，又分化為何種類型的細(xì)胞，這主要由干細(xì)胞本身狀態(tài)和所處的微環(huán)境所決定。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第99頁!三、干細(xì)胞的命運(yùn)一般生理情況下處于靜止的G0期分裂的干細(xì)胞有5種發(fā)育途徑：自我更新、分化、程序性死亡、遷移和進(jìn)入休眠期，少數(shù)干細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第100頁!英國：

2001年1月，英國在經(jīng)過了包括科學(xué)界、宗教界、企業(yè)界、政界等人士，以及普通老百姓參與的、長達(dá)3年的爭論后，個(gè)將克隆研究合法化，允許科學(xué)家培養(yǎng)克隆胚胎以進(jìn)行干細(xì)胞研究，并將這一研究定性為“治療性克隆”?？茖W(xué)家可破壞被生育診所廢棄的胚胎用于干細(xì)胞和其他研究，也可通過試管內(nèi)受精培養(yǎng)研究用胚胎。2002年，倫敦大學(xué)國王學(xué)院干細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室主任斯蒂芬明格的研究小組獲得英國人工授精與胚胎學(xué)管理局頒發(fā)的兩份研究人類胚胎干細(xì)胞衍生許可證之一。之后，成功建立了英國個(gè)人體胚胎干細(xì)胞系。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第101頁!2005年3月，英國時(shí)任首相布萊爾宣布在3年內(nèi)向包括干細(xì)胞研究在內(nèi)的生物技術(shù)領(lǐng)域投資10億英鎊（約合19.2億美元），以維持英國在國際生物技術(shù)界的優(yōu)勢地位。同月，英國時(shí)任財(cái)政大臣戈登·布朗宣布，政府將在其10年發(fā)展計(jì)劃中建立一個(gè)全國性的干細(xì)胞研究網(wǎng)絡(luò)，以鞏固英國在該領(lǐng)域的領(lǐng)先地位；培育出克隆羊“多利”的英國科學(xué)家伊恩·威爾莫特也將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了干細(xì)胞研究領(lǐng)域。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第102頁!

美國

美國總統(tǒng)布什于2001年8月4日宣布政府批準(zhǔn)用政府經(jīng)費(fèi)進(jìn)行人體胚胎干細(xì)胞的研究，但是只能用于資助已有的人類胚胎干細(xì)胞系的研究，不資助開發(fā)和利用新的人類胚胎干細(xì)胞系。據(jù)說現(xiàn)在已有６０多個(gè)人類胚胎干細(xì)胞系，可以無限傳代，足夠科學(xué)家們研究了。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第103頁!長期以來，美國一些宗教界和保守派人士以有關(guān)實(shí)驗(yàn)可能破壞人類胚胎為由極力阻礙干細(xì)胞研究。2001年，布什下令禁止聯(lián)邦基金資助針對從人類胚胎中取得新的干細(xì)胞株的有關(guān)研究，只允許對其他21種干細(xì)胞株進(jìn)行研究。他還多次對國會支持干細(xì)胞研究的相關(guān)立法行使否決權(quán)。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第104頁!德國：德國聯(lián)邦議院于2001年1月30日通過法案，允許德國科學(xué)家在嚴(yán)格限制的條件下利用進(jìn)口的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行研究

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第105頁!加拿大：加拿大衛(wèi)生研究院于2001年3月4日公布對人類ES細(xì)胞研究實(shí)行“有限資助”的指導(dǎo)原則，包括對利用醫(yī)療機(jī)構(gòu)“剩余”的人類胚胎進(jìn)行干細(xì)胞的研究將提供資助，但是禁止政府資助在實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行純粹用于研究人類胚胎或者人類胚胎克隆的研究。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第106頁!韓國2005年5月19日，干細(xì)胞研究和克隆技術(shù)的領(lǐng)軍人物、韓國漢城大學(xué)教授黃禹錫的實(shí)驗(yàn)室宣布成功克隆出世界上首批與病人基因相符的胚胎干細(xì)胞系，這一成果被視為人類胚胎干細(xì)胞研究的重大突破。

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黃禹錫說，我們的下一目標(biāo)是研究如何讓干細(xì)胞發(fā)展為器官的一部分。這并不是短時(shí)間內(nèi)就能夠達(dá)成的，因此，現(xiàn)在要做的就是踏踏實(shí)實(shí)地分階段進(jìn)行研究。我們將同韓國、美國、歐洲、中國和日本等其它研究小組緊密合作，為使克隆技術(shù)早日實(shí)現(xiàn)實(shí)用化而努力。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第108頁!黃禹錫教授表示：“從阿富汗獵犬種公狗身上提取體細(xì)胞，將其與被除去細(xì)胞核的其他狗的卵子結(jié)合在一起，我們用這種‘體細(xì)胞核替換法’制造了克隆受精卵。然后，把該受精卵移植到代理母體內(nèi)，結(jié)果母狗于今年4月24日誕下小狗，小狗的遺傳特征與提供體細(xì)胞的公狗完全相同?！?/p>

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第109頁!黃禹錫表示：“我們正確掌握未成熟的卵子在體內(nèi)逐漸成熟的場所和時(shí)期，在提取適合于克隆的卵子上獲得了成功。通過在動(dòng)物克隆的最大難關(guān)——狗克隆上取得成功，我們研究組積累了在動(dòng)物克隆上最高的知識經(jīng)驗(yàn)。”

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第110頁!漢城國立大學(xué)和美國密歇根州立大學(xué)等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家參與了這項(xiàng)研究。１６名健康婦女為這項(xiàng)研究志愿捐獻(xiàn)了２４２個(gè)卵細(xì)胞以及被稱為卵丘細(xì)胞的體細(xì)胞?？茖W(xué)家們從卵丘細(xì)胞內(nèi)提取出細(xì)胞核，然后將其植入同一位婦女去除了細(xì)胞核的卵細(xì)胞內(nèi)，并采用化學(xué)手段刺激卵細(xì)胞分裂，共有３０個(gè)克隆細(xì)胞經(jīng)過約７天的時(shí)間發(fā)育到至少幾十個(gè)細(xì)胞組成的、被稱為胚囊的早期胚胎階段。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第111頁!

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第112頁!此前，美國先進(jìn)細(xì)胞技術(shù)公司曾宣布克隆出含十幾個(gè)細(xì)胞的人類早期胚胎，但一直未在學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表成果。而其他研究人員進(jìn)行的人類胚胎克隆和猴子克隆實(shí)驗(yàn)基本未獲成功，一些科學(xué)家甚至認(rèn)為現(xiàn)有克隆技術(shù)無法應(yīng)用于靈長類動(dòng)物。韓、美科學(xué)家指出，新成果證明，利用來自活體的體細(xì)胞克隆人類早期胚胎并從中獲取干細(xì)胞是可行的。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第113頁!但是,對黃禹錫研究成果的疑問接踵而來。先是黃禹錫違反科學(xué)倫理道德,使用該研究組研究員提供的卵子,并隱瞞獲取卵子數(shù)量的行為被揭發(fā);接著,人們又對黃禹錫2005年發(fā)表在《科學(xué)》雜志上的論文的真實(shí)性提出質(zhì)疑。黃禹錫則堅(jiān)稱有人調(diào)換了他培育出的與患者基因相匹配的胚胎干細(xì)胞,并聲稱他掌握了胚胎干細(xì)胞的核心技術(shù),要求調(diào)查委員會對他的研究成果進(jìn)行重新驗(yàn)證。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第114頁!2007年11月14日，英國著名的科學(xué)刊物《自然》周刊在其網(wǎng)站上發(fā)表了一篇來自美國的科學(xué)論文，不聲不響地爆出了一條為全球矚目的科學(xué)消息：美國科學(xué)家率先克隆出了人類的靈長動(dòng)物表兄弟猴子的早期胚胎。這意味著自克隆羊多利降生以來就令世人無限遐想的克隆人，已經(jīng)離我們越來越近了。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第115頁!但僅僅就在一年多時(shí)間之后的2007年8月2日，美國《時(shí)代》周刊科學(xué)專欄對當(dāng)天發(fā)表在《細(xì)胞干細(xì)胞》（CellStemCell）雜志的一篇論文，發(fā)出了及時(shí)的科學(xué)報(bào)道和評論：黃禹錫事件獲得意外進(jìn)展?！稌r(shí)代》周刊的美籍韓裔專欄記者愛麗絲·樸（AlicePark）一直在跟蹤報(bào)道該事件?！都?xì)胞干細(xì)胞》是頂級生物學(xué)雜志《細(xì)胞》2007年才創(chuàng)辦的子刊，也是國際干細(xì)胞學(xué)會的會刊。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第116頁!達(dá)利教授在自己的論文發(fā)表后曾不無惋惜地對記者表示，2005年，巔峰時(shí)期的黃禹錫還沒來得及認(rèn)識到自己科研內(nèi)容的價(jià)值，就已被搞得焦頭爛額，根本無法顧及科研數(shù)據(jù)的分析，制定下一步科研方向。而同時(shí)，許多西方學(xué)者卻已經(jīng)看到了一絲曙光。黃禹錫沒有想到，自己的干細(xì)胞竟然是卵子單性生殖的結(jié)果。只要在當(dāng)時(shí)認(rèn)識并報(bào)道了單性生殖獲取干細(xì)胞的成果，他的工作將遙遙領(lǐng)先，因?yàn)檫@是區(qū)別于體細(xì)胞克隆的一條全新的獲取干細(xì)胞的技術(shù)路線。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第117頁!

北京大學(xué)干細(xì)胞研究中心李凌松教授指出，人們開始嘗試用干細(xì)胞技術(shù)治療某些疾病僅僅只是開始,采用細(xì)胞技術(shù)治療疾病大概至少要經(jīng)歷三個(gè)階段：

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第118頁!2.如果掌握了干細(xì)胞向某種組織細(xì)胞分化的條件，就可以在體外對干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)使之“定向”分化成所需的細(xì)胞；對于某些遺傳性疾病，還可對干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。對經(jīng)過“定向分化”或“基因修飾”后的干細(xì)胞進(jìn)行篩選后，把“合格”的細(xì)胞移植給病人。前兩種方法都屬于細(xì)胞替代或者頂多稱其為“組織替代”，樂觀地估計(jì)大概需要3～5年可以用于治療糖尿病、帕金森氏癥等。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第119頁!我國衛(wèi)生部對胚胎干細(xì)胞及克隆技術(shù)的研究的態(tài)度：

（一）我國不贊成、不支持、不允許、不接受任何生殖性克隆試驗(yàn)；（二）我國贊成以預(yù)防、治療疾病為目的的人類胚胎干細(xì)胞研究，并使其在有效監(jiān)控的條件下有序發(fā)展；

（三）我國應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)立法、促進(jìn)克隆技術(shù)安全應(yīng)用和健康發(fā)展。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第120頁!就在人們還沉浸在對黃禹錫的惋惜中時(shí)，干細(xì)胞研究又產(chǎn)生了革命性的進(jìn)展。2007年11月21日，《科學(xué)》周刊和《細(xì)胞》雜志在自己的網(wǎng)站上，同時(shí)報(bào)道了美國和日本科學(xué)家相似的創(chuàng)新——用類似調(diào)制基因雞尾酒的方法，把幾種基因一起導(dǎo)入細(xì)胞，獲得了胚胎干細(xì)胞。這成為繼體細(xì)胞克隆、單性繁殖之后的第三種方法。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第121頁!不論是體細(xì)胞核移植還是單性繁殖，目的都是讓成體細(xì)胞回復(fù)到未分化狀態(tài)。這是一個(gè)發(fā)育逆轉(zhuǎn)的過程。相對于這兩種方法，那兩組調(diào)酒師科學(xué)家的方法要簡潔許多。他們從基因著手，各自選擇了四種可以刺激細(xì)胞基因組使之回復(fù)到原初狀態(tài)的“返老還童”基因，把它們組合調(diào)配在一起，導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒中。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第122頁!干細(xì)胞是人體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為各種器官和組織的細(xì)胞，過去只能從胚胎中獲得。2007年11月，美國和日本科學(xué)家分別宣布獨(dú)立發(fā)現(xiàn)將普通皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞的方法，得到的干細(xì)胞稱為誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞，又名iPS細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)分別被《自然》和《科學(xué)》雜志評為2007年和第二大科學(xué)進(jìn)展。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第123頁!誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells,iPScells）是利用病毒載體將四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc）的組合轉(zhuǎn)入分化的體細(xì)胞中，使其重編程為類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞類型。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第124頁!Sox2Sox2是胚胎干細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,其與Oct-4一樣均為體細(xì)胞重編程所必須的基因,除了可與Oct4協(xié)同調(diào)節(jié)維持細(xì)胞的多能性之外,還能促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)外胚層分化。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第125頁!制造方法IPS細(xì)胞是由一些多能遺傳基因?qū)肫つw等細(xì)胞中制造而成。在制造過程中，美國研究人員使用了4種遺傳基因，同時(shí)加入了7種包括可阻礙特定蛋白質(zhì)合成的物質(zhì)和酶在內(nèi)的化合物，以研究其各自的制造效率。研究結(jié)果顯示，沒有添加化合物時(shí)，遺傳基因的導(dǎo)入效率為0.01％—0.05％，而加入了叫“巴爾普羅酸”的蛋白質(zhì)合成阻礙劑之后，導(dǎo)入效率竟升至9.6％—14％。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第126頁!

iPS細(xì)胞同樣具有自我更新和分化的全能性，從日本科學(xué)家ShinyaYamanaka于2006年次發(fā)現(xiàn)這一技術(shù)到現(xiàn)在，科學(xué)家已經(jīng)成功從小鼠，大鼠，獼猴，豬和人的體細(xì)胞中誘導(dǎo)并獲得iPS細(xì)胞，而且誘導(dǎo)技術(shù)也產(chǎn)生了巨大的革新，減少外源轉(zhuǎn)錄因子，使用非整合病毒，質(zhì)粒法等等都能夠產(chǎn)生iPS細(xì)胞，最近，有報(bào)道稱利用純蛋白的方法也可以獲得iPS細(xì)胞。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第127頁!但是關(guān)于人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究還處于起步階段，所采用的供體細(xì)胞還僅僅局限在人包皮成纖維細(xì)胞，表皮細(xì)胞，毛囊細(xì)胞等少數(shù)細(xì)胞類型，更為棘手的是，這些細(xì)胞被重編程為iPS細(xì)胞所需要的時(shí)間比較長（16-35天），效率很低，這大大增加了在這個(gè)過程中細(xì)胞的變異風(fēng)險(xiǎn)。因此如何找到一種理想的人類體細(xì)胞來源是所有科學(xué)家都重點(diǎn)關(guān)注的問題。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第128頁!2009年2月，日本東京大學(xué)科學(xué)家宣布，成功利用人類皮膚細(xì)胞制成的iPS細(xì)胞培育出血小板，而且從技術(shù)上說用iPS細(xì)胞培育人類紅細(xì)胞和白細(xì)胞都是可能的；緊接著，日本慶應(yīng)大學(xué)科學(xué)家又宣布，成功用實(shí)驗(yàn)鼠的iPS細(xì)胞培育出鼠角膜上皮細(xì)胞。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第129頁!2009年7月，iPS細(xì)胞研究在臨床應(yīng)用道路上又邁出非常重要的一步。據(jù)英國《自然》雜志網(wǎng)站23日報(bào)道，中國科學(xué)家周琪和高紹榮等人利用iPS細(xì)胞克隆出活體實(shí)驗(yàn)鼠，首次證明iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞一樣具有全能性。該成果讓人們看到了iPS細(xì)胞具有實(shí)用性。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第130頁!2010年7月，巴西圣保羅大學(xué)醫(yī)療系的科研人員最近取得了利用改造皮膚基因獲取誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）的科研成果?？蒲腥藛T在研究過程中使用了SOX2、C-MYC和另一匿名基因修改人類成人皮膚細(xì)胞，成功將其改造成了iPS細(xì)胞，并避免了腫瘤的產(chǎn)生。目前該研究小組正在繼續(xù)努力以揭示出這些細(xì)胞擁有的其他特點(diǎn)以及其潛在的治療功能。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第131頁!胚胎干細(xì)胞干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第132頁!目前體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的方法歸納起來有二大類：有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法。有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法主要應(yīng)用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）和SIM小鼠成纖維細(xì)胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系STO細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞；經(jīng)絲裂霉素-C或γ-射線處理終止其分裂后制備成飼養(yǎng)單層(feederlayer)，將胚胎干細(xì)胞種植在這樣的單層上。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第133頁!無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法則是利用各種能分泌抑制分化因子的細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基，或在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入重組的LIF制備成條件培養(yǎng)基。如果使用這樣的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞，可以不使用飼養(yǎng)層細(xì)胞，能保證小鼠胚胎干細(xì)胞增殖的同時(shí)維持未分化二倍體狀態(tài)。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第134頁!飼養(yǎng)單層的制備一定劑量的絲裂霉素-C(mitomycin-C)和γ-射線能夠使細(xì)胞停止分裂，但不至于馬上死亡，可在體外存活一段時(shí)間，并保持分泌各種因子的功能。故使用絲裂霉素-C或γ-射線處理飼養(yǎng)細(xì)胞，使之終止分裂，同時(shí)仍分泌促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖和抑制其自主分化的因子，維持其未分化二倍體狀態(tài)。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第135頁!胚胎的準(zhǔn)備和培養(yǎng)（1）母小鼠超數(shù)排卵

1）

性成熟前期母小鼠于中午12：00～1：00或下午5：00～6：00腹腔注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）,每只小鼠5～10IU。

2）隔46～48hr腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），每只鼠5～10IU。同時(shí)以1：1比例與公鼠合籠。

3）第二天上午觀察母小鼠陰道栓，見栓當(dāng)天上午確定為懷孕0.5d，見栓第四天為懷孕3.5d。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第136頁!4）

用1ml無菌注射器吸入沖卵液。從子宮角端進(jìn)針，保證針頭進(jìn)入子宮腔內(nèi)，將沖卵液快速推入子宮腔。每側(cè)子宮注入沖卵液0.2～0.5ml,沖卵液會將胚胎沖出。

5）將毛細(xì)吸管在火焰上拉細(xì)，并用砂輪斷末端，制備吸卵針。

6）將盛有胚胎和沖卵液的平皿置于50～100倍的解剖顯微鏡下。用吸卵針收集胚胎。3.5d胚胎一般處于囊胚期，但也可能處于桑椹期，均可使用。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第137頁!胚胎干細(xì)胞的分離1）將囊腔充分?jǐn)U展的胚胎移置到制備好的飼養(yǎng)單層上，換上胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液；或移置到無飼養(yǎng)層但加有條件培養(yǎng)基的液滴內(nèi)（制備同前）。

2）繼續(xù)培養(yǎng)。天胚胎突破透明帶；48hr左右胚胎貼壁，滋胚層細(xì)胞舒展開并貼附著培養(yǎng)瓶（皿）表面生長，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（innercellmass，ICM）位于滋胚層細(xì)胞層的中央部位，向上隆起生長。

3）繼續(xù)培養(yǎng)2～4d，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)增大干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第138頁!6）

將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)生長良好的培養(yǎng)平皿置于解剖鏡下或顯微操作儀下，用50～100倍觀察并完成7)～9)的操作步驟。

7）用末端口徑比內(nèi)細(xì)胞團(tuán)塊稍大的毛細(xì)吸管挑起內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，吸置消化液小滴內(nèi)。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第139頁!胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)1）用0.1%明膠水溶液處理φ1cm的培養(yǎng)孔。

2）在培養(yǎng)孔內(nèi)加入條件培養(yǎng)基，每孔1ml。

3）將分散的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)小塊吸置于培養(yǎng)孔內(nèi)。一個(gè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞放置1個(gè)孔。

4）在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第140頁!1．從早期胚胎獲得美國Thompson研究小組是從囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中獲得胚胎干細(xì)胞：體外受精卵→囊胚期→去除滋養(yǎng)層→內(nèi)細(xì)胞團(tuán),得5株干細(xì)胞系32代(8個(gè)月)保持未分化狀態(tài)。發(fā)育免疫切除法培養(yǎng)

傳代干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第141頁!3．體細(xì)胞移植分化細(xì)胞核(乳腺、皮膚細(xì)胞)去核卵細(xì)胞→雜合細(xì)胞發(fā)育成囊胚胚胎干細(xì)胞成體(如多利羊)。

移植刺激分離發(fā)育干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第142頁!形態(tài)和生化特征1.形態(tài)：細(xì)胞體積小，核大，1~多個(gè)核仁。離體培養(yǎng)可產(chǎn)生密集的多細(xì)胞克隆。2.生化特征：端粒酶活性高。3.干細(xì)胞物理特性：如干細(xì)胞對Hoechst33324和Rhodamine123染料不著色。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第143頁!干細(xì)胞的分離與純化1.借助細(xì)胞的生化特征及物理特性，采用熒光細(xì)胞分離器從單細(xì)胞懸液中即可分離純化干細(xì)胞。2.干細(xì)胞的理化特征與其分化調(diào)控有關(guān)，如上皮干細(xì)胞高表達(dá)β1整合素，介導(dǎo)干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附，抑制干細(xì)胞分化。干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第144頁!骨髓干細(xì)胞干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第145頁!MSC的培養(yǎng)方法目前常用的分離MSC的方法有全骨髓法和密度梯度離心法，全骨髓法即根據(jù)干細(xì)胞貼壁特性，定期換液除去不貼壁細(xì)胞，從而達(dá)到純化MSC的目的。密度梯度離心法即根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分比重的不同，提取單核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。隨著對MSC表面抗原認(rèn)識的深入，有人利用免疫方法如流式細(xì)胞儀法、免疫磁珠法等對其進(jìn)行分離純化，但經(jīng)過流式或磁珠分選后的細(xì)胞出現(xiàn)了增殖緩慢等一些問題，加之耗費(fèi)較大和技術(shù)的難度，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應(yīng)用。

干細(xì)胞研究方法及進(jìn)展共161頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第146頁!Ｍakino等在小鼠骨髓細(xì)胞中加入5-aza