第14章細胞因子與細胞粘附因子測定

第十四章

細胞因子與細胞粘附因子的測定

是由活化的免疫細胞及某些基質(zhì)細胞表達并分泌的活性物質(zhì)，其主要生物學(xué)功能是介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)或多肽。細胞因子細胞粘附因子

是介導(dǎo)細胞間及細胞與細胞外基質(zhì)間粘附作用的分子，其化學(xué)本質(zhì)為糖蛋白，可以細胞膜表面表達和可溶性兩種形式存在。

第一節(jié)生物學(xué)測定方法

1.基于DNA檢測的分子生物學(xué)測定法：

DNA擴增法

RNA印跡法原位雜交法核酸酶保護分析

2.生物活性測定法

生物學(xué)測定法分類根據(jù)細胞因子特定的生物學(xué)活性,應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng),同時與標(biāo)準(zhǔn)品對比測定,從而得知樣品中細胞因子的活性水平,一般以活性單位(U/ml)表示生物活性測定法原理有助于細胞因子檢測的活性作用包括有助于細胞因子檢測的活性作用刺激細胞增殖或集落形成的活性維持細胞生長和存活的特性抑制細胞生長或破壞細胞的效應(yīng)促進細胞趨化或抗病毒作用敏感性較高特異性不高操作繁瑣易受干擾五、生物學(xué)活性測定方法學(xué)評價第二節(jié)免疫學(xué)測定法

細胞因子(或受體)與相應(yīng)的特異性抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)結(jié)合，通過同位素、熒光或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示，從而定性或定量顯示細胞因子(或受體)的水平。根據(jù)抗體性質(zhì)和特異性不同，夾心法ELISA可分為：1.PcAb與McAb夾心法2.McAb與PcAb夾心法3.雙McAb夾心法4.細胞、McAb夾心法一、ELISA方法ELISA法是應(yīng)用最為廣泛的非均相酶標(biāo)免疫分析技術(shù)，ELISA法不僅可以用于細胞因子檢測，也可用于可溶性細胞因子受體或可溶性粘附因子的測定敏感性偏低不能判斷細胞因子的生物學(xué)活性。ELISA特異、簡便易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點可同時檢測大量標(biāo)本且試驗廢棄物便于處理細胞因子測定的首選方法優(yōu)點缺點二、流式細胞分析法

流式細胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細胞儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細胞內(nèi)細胞因子和細胞表面粘附分子的檢測，通過特異性的熒光抗體染色，能簡單、快速地進行單個細胞水平的細胞因子或粘附因子的檢測，精確判斷不同細胞亞群細胞因子和膜分子的表達情況。1．分離和培養(yǎng)待檢細胞2．細胞固定3．封閉非特異性結(jié)合位點4．染色與分析基本步驟使用流式細胞分析法，可以：區(qū)分不同分泌特性的細胞亞群：

Th1細胞IFN-γTh2細胞IL-4細胞表面的粘附分子或細胞因子受體：單克隆抗體技術(shù)直接或間接熒光抗體染色無需作細胞固定和非特異性結(jié)合位點的封閉待測細胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細胞，保持良好狀態(tài)三、酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT或ElisaSpot)

在包被有待測細胞因子抗體的微孔板上，加入可分泌相應(yīng)細胞因子的待測細胞，經(jīng)在有或無刺激物存在的條件下培養(yǎng)，待測細胞分泌細胞因子于其周圍，并被板上的特異性抗體捕獲。后續(xù)的反應(yīng)如同ELISA，即在洗去細胞后視用于試驗的酶標(biāo)抗體為一抗或二抗，分別作直接或間接法。一個斑點代表一個細胞因子分泌細胞，斑點的顏色深淺程度與細胞分泌的細胞因子量相關(guān)基本原理四、免疫學(xué)測定方法學(xué)評價優(yōu)點：特異性高操作簡便、快速，無需依賴細胞株影響因素較少且易控制，重復(fù)性好，方法容易標(biāo)準(zhǔn)化。缺點：所測定的只是細胞因子的蛋白含量，與其生物活性不一定呈正比結(jié)果與所用的抗體來源及親和力有很大的關(guān)系敏感性相對較低標(biāo)本中細胞因子的可溶性受體，會影響特異性抗體對細胞因子的結(jié)合第三節(jié)

細胞因子與細胞粘附分子測定的臨床應(yīng)用細胞因子的測定主要應(yīng)用于：特定疾病的輔助診斷機體免疫狀態(tài)的評估臨床疾病治療效果的監(jiān)測和指導(dǎo)用藥疾病預(yù)防一、臨床應(yīng)用原則

細胞因子和粘附分子的異質(zhì)性、功能交叉性和多樣性、來源的復(fù)雜性和組織細胞的非特異性，決定了在進行這些分子檢測時，必須對方法選擇和結(jié)果判斷作出綜合考慮。細胞因子的檢測方法多種多樣，各有利弊。高敏感性方法：特異性的降低、廢棄物難處理活性測定方法：定性試驗基因分析法：利于細胞內(nèi)定位分析、操作煩瑣（一）方法的聯(lián)合應(yīng)用常用臨床標(biāo)本：抗凝全血，并分離獲得單個核細胞炎癥局部細胞因子的水平：局部分泌液細胞因子或粘附分子的細胞內(nèi)定位檢測：相應(yīng)細胞相應(yīng)細胞因子的基因和mRNA表達：相應(yīng)細胞療效觀察和預(yù)后判斷：疾病急性期和恢復(fù)期雙份標(biāo)本進行動態(tài)觀測免疫熒光染色和流式細胞分析：注意待檢細胞的活性和狀態(tài)，以保證結(jié)果的特異性（二）標(biāo)本的適當(dāng)選取意義：細胞因子具有網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的特點級聯(lián)效應(yīng)或相互抑制作用的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。有助于提供有效的疾病診斷和機體免疫狀態(tài)信息舉例：

T細胞、巨噬細胞和上皮樣細胞分泌相應(yīng)細胞因子的功能：IL-1、IL-2、IFN-γ和GM-CSFTh1/Th2細胞平衡狀態(tài)：IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ（三）細胞因子的聯(lián)合檢測二、特定疾病診斷的輔助指標(biāo)許多疾病過程均可出現(xiàn)粘附分子和細胞因子表達的異常改變，高表達、低表達或是缺陷均可與某些特定疾病密切關(guān)聯(lián)，同時還可反映疾病的進程（一）細胞因子檢測在特定疾病診斷中的意義（二）粘附分子檢測在特定疾病診斷中的意義粘附分子有可溶性和膜結(jié)合性兩種形式，均與機體的免疫狀態(tài)和疾病的發(fā)生有關(guān)，在炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移和器官移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。相關(guān)粘附分子的檢測有助于此類疾病的診斷。

三、評估機體的免疫狀態(tài)、判斷治療效果及預(yù)后機體免疫應(yīng)答的強弱可通過細胞因子或粘附分子的表達水平來反映，其過高或過低表達均系免疫調(diào)節(jié)異常的結(jié)果細胞因子和粘附分子的水平，作為觀察治療效果和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)接受治療的患者進行細胞因子水平的監(jiān)測，對保證治療效果具有指導(dǎo)意義。

1．細胞因子和細胞粘附分子的特性是什么？可分為幾類？2．基于促進細胞增殖生物學(xué)活性，檢測IL-1、IL-2、方法所使用的細胞依賴株與檢測原則是什么？3．細胞因子生物活性測定法的種類，各用于哪些細胞因子的檢測，主要優(yōu)缺點？4．ELISA法在細胞因子和粘附分子檢測可應(yīng)用于哪些方面，主要優(yōu)缺點？5．在臨床疾病診斷中，檢測細胞因子和粘附分子的意義是什么？應(yīng)用細胞因子檢測方法的原則有哪些？思