抗體的制備與應(yīng)用課件

抗體的制備與應(yīng)用抗體的制備與應(yīng)用1EmilvonBehring(1845-1917)antibody-In1890byvonBehringandKitasatodescribedanactivityinserumoftoxin-immunizedanimalsthatneutralizedtoxin.Transferofimmuneserumcouldprotectna?veanimalsfromdiphtheriaortetanus.HistoryEmilvonBehringantibody-In12Antibodies(Ab)

areproductsobtainedbyantigenstimulatingBlymphocytes,thenBcellswillproliferateintoplasmacellstoproducespecificantibodieswhichcanreactspecificallywithcorrespondingantigens.Immunoglobulins(Ig)

areallthoseglobulinswhichhavethefunctionorstructureofantibody.Twokindsofimmunoglobulins:

>secretedimmunoglobulins(sIg):Antibody >membraneimmunoglobulins(mIg):BCRAntibodies(Ab)areproductso3Day02468RestingBcellAntibodyformingcell(plasmacell)YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYDay0RestingBcellAntibodyYY4AntibodyStructureandFunctionAntibodyStructureandFunctio5StructureofimmunoglobulinsBasicstructureHeavychainandLightchain（重鏈和輕鏈）VariableregionandConstantregion（可變區(qū)和恒定區(qū)）OtherstructuresHingeregion（鉸鏈）Joiningchain（J鏈）Secretorycomponent(SC，分泌片)Domains（功能區(qū)）StructureofimmunoglobulinsBa6抗體的制備與應(yīng)用課件7peptidepeptideepitopebindingofHV(CDR)andepitopepeptidepeptideepitopebindingo8ThefunctionofIgV區(qū)的功能：特異性結(jié)合抗原（neutralization，中和作用）

抗體結(jié)合相應(yīng)抗原分子，發(fā)揮免疫效應(yīng)（生理與病理）；BCR特異性識別并結(jié)合抗原分子，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。ThefunctionofIgV區(qū)的功能：特異性結(jié)合抗9C區(qū)的功能

激活補(bǔ)體

Immunecomplex（IC）

激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑與細(xì)胞表面FcR結(jié)合

1）調(diào)理作用（opsonization)；IgG或IgM的Fc段與吞噬細(xì)胞表面FcR結(jié)合促吞噬；2）抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（Ab-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)3)介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)IgE的Fc段與肥大細(xì)胞表面FcR結(jié)合受體橋聯(lián)細(xì)胞活化

穿過胎盤和粘膜

IgG通過胎盤；sIgA穿過粘膜C區(qū)的功能10抗體的制備與應(yīng)用課件11

抗原是啟動機(jī)體免疫系統(tǒng)的先決條件Antigensaresubstancescapableofstimulatingimmunesystem,generatingantibodiesand/oreffectorlymphocytesandbindingspecificwiththeantibodyandeffectorlymphocytesinvivoorinvitro.抗原是啟動機(jī)體免疫系統(tǒng)的先決條件12

ImmunologicpropertiesofAgsImmunogenicity免疫原性antigenicity/immunoreactivity抗原性/反應(yīng)原性/免疫反應(yīng)性刺激免疫系統(tǒng)Immunologicproperties13抗原決定基-抗原特異性的分子基礎(chǔ)抗原決定基（antigenicdeterminant)指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。是被免疫細(xì)胞識別的靶結(jié)構(gòu)，也是免疫反應(yīng)具有特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。也稱為表位(epitope)?？乖瓫Q定基的位置、數(shù)目和空間結(jié)構(gòu)決定抗原特異性?？乖瓫Q定基-抗原特異性的分子基礎(chǔ)抗原決定基（antigeni14T細(xì)胞決定基（T細(xì)胞表位）：T細(xì)胞決定基主要位于抗原分子內(nèi)部，必須由APC將抗原加工處理為小分子多肽并與MHC分子結(jié)合，然后才能被TCR所識別。B細(xì)胞決定基（B細(xì)胞表位）：BCR能直接識別未經(jīng)APC加工的天然抗原，其識別的B細(xì)胞表位主要位于抗原分子的表面，與BCR具有易接近性。根據(jù)抗原決定基由TCR還是BCR識別分類T細(xì)胞決定基（T細(xì)胞表位）：T細(xì)胞決定基主要位于抗原分子內(nèi)部15主要內(nèi)容概述多克隆抗體的制備與應(yīng)用單克隆抗體的制備與應(yīng)用基因工程抗體的制備與應(yīng)用主要內(nèi)容概述16概述

第一代抗體：多克隆抗體(polyclonalantibody，PcAb)第二代抗體：單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)第三代抗體：基因工程抗體(geneticengineeringantibody，GeAb)概述

17第一節(jié)多克隆抗體的制備與應(yīng)用

（polyclonalantibody，PcAb)

概念：采用含有多種抗原決定基(B細(xì)胞表位)的抗原免疫動物，從而刺激多個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對多種抗原表位的不同抗體。因此，所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物，稱為多克隆抗體。制備流程：免疫原（佐劑）免疫動物，分離抗血清，鑒定，保存。第一節(jié)多克隆抗體的制備與應(yīng)用

（polyclonala18傳統(tǒng)抗血清（多克隆抗體）抗原(含多種表位)免疫123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞傳統(tǒng)抗血清抗原免疫123412341234脾臟淋巴結(jié)B19多克隆抗體的優(yōu)缺點優(yōu)點：制備流程簡便，操作技術(shù)要求低；制備周期短，一個月左右就能獲得目的抗體；缺點：制備的抗體是針對多種抗原決定基的混合物，特異性不高，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)；抗體來源于動物，應(yīng)用于人體會產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。應(yīng)用：主要用于免疫學(xué)檢測，被動免疫治療和緊急預(yù)防。其缺點限制了其在疾病診斷和治療中的應(yīng)用。

多克隆抗體的優(yōu)缺點優(yōu)點：20

抗A抗BABCrossreactionSameepitope抗AABCrossreactionSame21第二節(jié)單克隆抗體的制備與應(yīng)用

(monoclonalantibody，McAb)

概念：通過小鼠雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體技術(shù)生產(chǎn)的抗體。這種雜交瘤細(xì)胞既具有骨髓細(xì)胞能大量無限增殖的特性，又具有B細(xì)胞合成和分泌抗體的能力。每一個雜交瘤單克隆是用一個B細(xì)胞融合而產(chǎn)生的克隆，因此，由一個識別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體，稱為單克隆抗體。制備流程：免疫—融合—篩選第二節(jié)單克隆抗體的制備與應(yīng)用

(monoclonala22單克隆抗體制備流程單克隆抗體制備流程23雜交瘤技術(shù)的原理1.親本細(xì)胞的選擇

－小鼠骨髓瘤細(xì)胞：不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈；HGPRT-;TK-；與提供淋巴細(xì)胞的動物品系相同。能永生化。

備注：HGPRT:次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶TK:胸腺嘧啶激酶

－免疫脾細(xì)胞：經(jīng)抗原免疫的BALB/c小鼠的脾臟。不能永生化，但能分泌抗體，HGPRT+;TK+。雜交瘤技術(shù)的原理24

2.細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞

PEG

雜交瘤細(xì)胞

脾細(xì)胞融合后細(xì)胞的類型:

未融合的脾細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞未融合的瘤細(xì)胞

2.細(xì)胞融合253.雜交瘤細(xì)胞的篩選采用篩選培養(yǎng)基：HAT培養(yǎng)基H-次黃嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶只有融合成功的細(xì)胞（雜交瘤）才能在HAT培養(yǎng)基上長期生長，原因在于只有雜交瘤能成功合成DNA。

3.雜交瘤細(xì)胞的篩選采用篩選培養(yǎng)基：HAT培養(yǎng)基26DNA合成途徑內(nèi)源性途徑（主要途徑）利用谷氨酰胺（Gln）或單磷酸尿苷酸在二氫葉酸還原酶的催化下合成DNA

(氨基喋呤是二氫葉酸還原酶的抑制劑，因此能有效阻斷DNA的合成)。外源性途徑（補(bǔ)救途徑）利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）或TK（胸腺嘧啶激酶）的催化作用下補(bǔ)救合成DNADNA合成途徑內(nèi)源性途徑（主要途徑）27融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況脾細(xì)胞（HGPRT+,TK+,能生長，但不能永生化）骨髓瘤細(xì)胞（HGPRT-,TK-，不能生長）雜交瘤細(xì)胞（HGPRT+,TK+，能生長，且能永生化）融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況284、雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化

篩選：免疫熒光ELISA等

克隆化：有限稀釋法單個細(xì)胞顯微操作法軟瓊脂培養(yǎng)法4、雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化29配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇5.雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍306.單克隆抗體的生產(chǎn)

體內(nèi)：BALB/c小鼠體內(nèi)誘發(fā)含有單抗的腹水體外：無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)等7.單克隆抗體的純化

硫酸銨沉淀法離子交換層析A蛋白-Sepharose親和層析6.單克隆抗體的生產(chǎn)31抗體的制備與應(yīng)用課件32單克隆抗體（McAb）的優(yōu)缺點優(yōu)點：成分、結(jié)構(gòu)均一，特異性強(qiáng)。一種McAb分子的所有區(qū)域完全相同，只針對一種抗原決定基，避免了交叉反應(yīng)。效價高使用一種抗原免疫動物，可以獲得針對不同抗原決定基的不同特異性的McAb。雜交瘤細(xì)胞能在體內(nèi)外無限繁殖、傳代，因此產(chǎn)量高，可連續(xù)生產(chǎn)單克隆抗體（McAb）的優(yōu)缺點33缺點：制備McAb成本昂貴，制備流程長，操作煩瑣，技術(shù)要求較高。McAb為鼠源性，應(yīng)用于人體將產(chǎn)生人抗鼠抗體（Humananti-mouseantibody,HAMA）,治療中可能引起過敏反應(yīng)且療效大大降低?？贵w為全I(xiàn)g，相對分子量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達(dá)不到有效殺傷濃度。缺點：34單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用（一）用作診斷試劑

1.檢測淋巴細(xì)胞表面分子，區(qū)分不同分化階段的淋巴細(xì)胞，鑒別淋巴細(xì)胞。2.鑒定病原體，準(zhǔn)確診斷傳染病。3.用于腫瘤的診斷和分型4.激素類單抗用于測定體內(nèi)激素含量，判斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài)

單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用（一）用作診斷試劑35（二）用作研究工具純化抗原分析和探查抗原結(jié)構(gòu)分析抗原決定基的功能（三）用于疾病的治療抗細(xì)胞表面分子單抗，用于移植排斥反應(yīng)的防治抗細(xì)胞因子單抗用于自身免疫性疾病的治療抗腫瘤單抗用于腫瘤的導(dǎo)向治療（二）用作研究工具36單克隆抗體用于免疫治療存在的問題單克隆抗體的特異性由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對腫瘤有嚴(yán)格特異性的單抗，對正常組織有交叉反應(yīng)異種抗體反應(yīng)鼠源性單抗用于人體，導(dǎo)致超敏反應(yīng)生產(chǎn)成本高,技術(shù)要求高，穩(wěn)定性差，難于普及應(yīng)用單克隆抗體用于免疫治療存在的問題37第三節(jié)基因工程抗體的制備與應(yīng)用

(geneticengineeringantibody，GeAb)

概念：利用基因工程及蛋白工程技術(shù)，對抗體基因進(jìn)行改造，按人們需要重新組裝抗體或抗體基因片段，并轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后表達(dá)的規(guī)?；贵w?；驹恚豪梅肿由飳W(xué)技術(shù)分離純化抗體基因或基因片段，在最大限度保留其抗原結(jié)合活性，降低其異源性的原則指導(dǎo)下，按臨床或科研需要對抗體基因進(jìn)行拼接組裝，在轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞表達(dá)，制備具有不同大小和不同功能的抗體。第三節(jié)基因工程抗體的制備與應(yīng)用

(geneticeng38基因工程抗體產(chǎn)生的時代背景1、單克隆抗體的毒副作用2、人雜交瘤技術(shù)未獲真正突破:融合率低、建株難、不穩(wěn)定、產(chǎn)量低、人體不能隨意免疫3、現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的推動4、基因工程抗體的優(yōu)點基因工程抗體產(chǎn)生的時代背景39基因工程抗體的優(yōu)點：易于獲得稀有抗體;人抗鼠抗體反應(yīng)（Humananti－mouseantibodyreaciton,HAMAR）低;小分子抗體：滲透力強(qiáng)、HAMAR低、親和性高、靶向性高、組織非特結(jié)合少等?；蚬こ炭贵w的優(yōu)點：40基因工程抗體的分類1、全抗體（1）嵌和抗體（chimericantibody）（2）人源化抗體（humanizedantibody）2、小分子抗體（1）Fab（2）ScFv（3）單域抗體（4）分子識別單位基因工程抗體的分類413、其它抗體多價微型抗體雙鏈抗體（diabody）微型抗體(minibody)三鏈抗體(triabody)新型抗體分子新效能抗體雙特異性抗體（bispecificantibody,BsAb）胞內(nèi)抗體（intrabody）免疫黏連素（immunoadhesin）催化抗體（catalyticantibody）3、其它抗體多價微型抗體42抗體的制備與應(yīng)用課件43一、基因工程全抗體一、基因工程全抗體44基因工程全抗體研發(fā)的演變歷程鼠抗體100%鼠源鼠/人崁合抗體(66-75%人源)人源化抗體(90-95%人源)100%人源基因工程全抗體研發(fā)的演變歷程鼠抗體鼠/人崁合抗體人源化抗體145（一）嵌和抗體（chimericantibody)

1、概念指由兩種不同種系來源的基因所編碼的抗體。2、原理從鼠源的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分離并鑒定抗體V區(qū)基因，再通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)將其連接到人抗體C區(qū)基因上，構(gòu)建Vm（mouse）-Ch（human）嵌和基因，并轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞表達(dá)。（一）嵌和抗體（chimericantibody)46嵌合抗體嵌合抗體47抗體的制備與應(yīng)用課件483、嵌和抗體的優(yōu)缺點：優(yōu)點：特異性強(qiáng)親和性高具有全抗體的所有功能半衰期長、療效顯著缺點：有10－50%發(fā)生HAMA靶向性差3、嵌和抗體的優(yōu)缺點：49（二）人源化抗體（humanizedantibody）1、概念指利用基因工程技術(shù)，在嵌合抗體基礎(chǔ)上，針對嵌合抗體仍然具有較高的HAMA反應(yīng)的問題，進(jìn)一步對抗體進(jìn)行CDR及FR區(qū)域置換。通過這種方式獲得的抗體人源部分可達(dá)97%，又稱為CDR移植抗體（CDRgraftingantibody）。2、原理首先利用計算機(jī)模建技術(shù)，模擬抗體立體結(jié)構(gòu)。再根據(jù)同源性原理從人抗體基因庫中篩選人FR序列。通過分子模擬技術(shù)鑒別出與抗原結(jié)合位點密切相關(guān)的鼠單抗FR上氨基酸殘基，將這些殘基與CDR重組并一同移植到人FR上。（二）人源化抗體（humanizedantibody）50抗體的制備與應(yīng)用課件513、方法

在抗體可變區(qū)，具有較高變異的是位于超變區(qū)內(nèi)（互補(bǔ)決定區(qū)，CDR）少數(shù)核心氨基酸，它決定了抗體的特異性，而可變區(qū)中的“框架區(qū)（FR）”則決定了可變區(qū)的三維空間結(jié)構(gòu)。通過同源蛋白三維結(jié)構(gòu)模建技術(shù)預(yù)測抗體可變區(qū)三維結(jié)構(gòu)后，對鼠及人VH、VL表面容易引起較強(qiáng)免疫反應(yīng)的氨基酸進(jìn)行比較分析，進(jìn)行人源化分子設(shè)計。3、方法52二、基因工程小分子抗體二、基因工程小分子抗體53小分子抗體1．Fab抗體片段2．單鏈抗體（singlechainFv,ScFv）3．單域抗體（singledomainantibody）4．分子識別單位（molecularrecognizationunit,MRU）

小分子抗體1．Fab抗體片段54（一）Fab抗體

由V鏈的VH、CH1及完整的L鏈構(gòu)成（一）Fab抗體55優(yōu)點：分子小，HAMAR低親和性高靶向性高于McAb缺點：仍然有一定的HAMAR發(fā)生靶向性不如ScFv穩(wěn)定性差優(yōu)點：56（二）單鏈抗體（ScFv）概念是指通過特定的方法將抗體分子VH和VL連接在一起構(gòu)成的只有一條鏈的抗體。優(yōu)點：克服了HAMAR的問題分子量小、滲透性高，靶向性增加ScFv可保留較高活性在體內(nèi)半衰期長、穩(wěn)定性高沒有Fc段，非特異結(jié)合減少，在腫瘤導(dǎo)向治療及成像診斷中有特別的意義（二）單鏈抗體（ScFv）57類型（1）二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體(dsFv）（2）由連接肽連接的單鏈抗體（ScFv）類型581、dsFv（二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體）利用基因突變技術(shù)在VH和VL上加入半胱氨酸，利用兩者形成的二硫鍵將VH和VL連接在一起。突變部位的確定：由Jung等人在1994年用分子模建技術(shù)確定：VH44/VL100及VH105/VL43。1、dsFv（二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體）59抗體的制備與應(yīng)用課件602、ScFv（由連接肽連接的單鏈抗體）2、ScFv（由連接肽連接的單鏈抗體）61

Linker的設(shè)計原則長度和性質(zhì)以不干擾VH和VL的折疊和不影響抗原結(jié)合部位的功能為標(biāo)準(zhǔn)。過短的接頭會影響VH和VL之間的相互作用，過長的接頭會影響抗體與抗原的結(jié)合，而且易受酶水解，不穩(wěn)定。接頭中盡量不含疏水氨基酸。常采用3次重復(fù)出現(xiàn)的4個甘氨酸和1個絲氨酸即（Gly4Ser）3,的15氨基酸接頭。

Linker的設(shè)計原則62（三）單域抗體只有一個VH或VL的抗體，通常為VH（三）單域抗體只有一個VH或VL的抗體，通常為VH63（四）分子識別單位只有一個CDR，通常為CDR3（四）分子識別單位只有一個CDR，通常為CDR364三、其它基因工程抗體多價微型抗體雙鏈抗體（diabody）微型抗體(minibody)三鏈抗體(triabody)新型抗體分子新效能抗體雙特異性抗體（bispecificantibody,BsAb）胞內(nèi)抗體（intrabody）免疫黏連素（immunoadhesin）催化抗體（catalyticantibody）三、其它基因工程抗體多價微型抗體65（一）多價微型抗體1．雙鏈抗體（diabody）2．微型抗體(minibody)3．三鏈抗體(triabody)（一）多價微型抗體1．雙鏈抗體（diabody）661．雙鏈抗體（diabody）雙鏈抗體是通過化學(xué)鉸鏈、黏性蛋白結(jié)構(gòu)域融合法和接頭長度控制三種主要手段將兩個ScFv通過非共價鍵結(jié)合形成剛性、穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)。具有兩個抗原結(jié)合位點，分子量約60KD。具有穿透力強(qiáng)的優(yōu)勢，易于通過血管壁進(jìn)入實體瘤。與ScFv比較，其腎臟的清除速度減慢。具有更大的臨床應(yīng)用價值。

1．雙鏈抗體（diabody）雙鏈抗體是通過化學(xué)鉸鏈、黏性蛋672．微型抗體(minibody)

采用基因工程的手段，使用不同的接頭把單鏈抗體(VL-VH)的VH功能區(qū)與IgG的CH3功能區(qū)融合，構(gòu)成VL-VH-CH3的融合蛋白，稱之為微型抗體（minibody）。該抗體合成后通過CH3功能區(qū)形成穩(wěn)定的二聚體，發(fā)揮其雙價抗體的作用。微型抗體的分子量約為80KD，較雙鏈抗體(約60KD)的大，降低了體內(nèi)清除速度，增加了滯留時間。此抗體具有（Fab’）2的類似性質(zhì)，但沒有（Fab’）2需對完整抗體進(jìn)行酶切消化及二次純化的繁瑣過程，是一種較為理想的基因工程抗體形式。2．微型抗體(minibody)

采用基因工程的手段，使用不68抗體的制備與應(yīng)用課件693．三鏈抗體(triabody)

制備單鏈抗體時，把接頭的長度降2個或2個以下氨基酸殘基，或者直接把VH功能區(qū)的N末端與VL功能區(qū)的C末端相連，這樣可通過非共價鍵形成三聚體，稱為三鏈抗體。VH和VL直接連接構(gòu)成無連接肽（ScFv-0）三聚體的親和力高，其與抗原結(jié)合比較牢固，解離速度慢。3．三鏈抗體(triabody)

制備單鏈抗體時，把接頭的長70（二）新型抗體分子1．新效能抗體2．雙特異性抗體（bispecificantibody,BsAb）3．胞內(nèi)抗體（intrabody）4．免疫黏連素（immunoadhesin）5．催化抗體（catalyticantibody）

（二）新型抗體分子1．新效能抗體711．新效能抗體

通過基因拼接、化學(xué)交聯(lián)等多種方法，將抗體分子與酶、化學(xué)藥物、放射性核素、生物毒素、超抗原等相結(jié)合。通過抗體發(fā)揮導(dǎo)向或載體效應(yīng)，使抗體攜帶物靶向結(jié)合于特異細(xì)胞上，發(fā)揮抗體攜帶物的效應(yīng)功能。

1．新效能抗體

通過基因拼接、化學(xué)交聯(lián)等多種方法，將抗體分子722．雙特異性抗體（bispecificantibody,BsAb）又稱雙功能抗體（bifunctionalantibody,BFA），具有兩個能結(jié)合不同特異性抗原位點的抗體。具有小分子抗體低副作用，又能有效促進(jìn)細(xì)胞或分子聚合，介導(dǎo)高效生物學(xué)效應(yīng)，在腫瘤、病毒感染治療中具有較大優(yōu)勢。

2．雙特異性抗體（bispecificantibody,B733、胞內(nèi)抗體（intrabody)概念：

利用基因工程技術(shù)，在ScFv抗體基因的C端或N段加上先導(dǎo)序列，使抗體分子定向分布于非淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞漿或某些特定的細(xì)胞器中表達(dá)，從而特異性干擾或阻斷分布于該部位的生物大分子的加工、分泌或活性，引起胞內(nèi)一系列生物過程改變的抗體。3、胞內(nèi)抗體（intrabody)概念：74胞內(nèi)抗體的構(gòu)建首先獲得ScFv基因，再通過PCR技術(shù)在其N或C端插入胞內(nèi)定位信號序列。N端定位信號序列可引導(dǎo)抗體進(jìn)入相關(guān)的細(xì)胞部位。而C端信號序列可使抗體滯留在該細(xì)胞特定部位。常用的胞內(nèi)定位信號肽：核定位信號肽：PKKKPTV內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號肽：MWIWRILFVGAATGAAS內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽：KDEL胞內(nèi)抗體的構(gòu)建75胞內(nèi)抗體的作用機(jī)制抑制或穩(wěn)定大分子之間的相互作用，改變蛋白所在的區(qū)室。通過對配體的修飾使其功能喪失。通過調(diào)節(jié)酶或阻礙酶活性位點、隱蔽酶底物，使酶固定在活化或失活構(gòu)象。胞內(nèi)抗體的作用機(jī)制764．免疫黏連素（immunoadhesin）抗體C區(qū)和細(xì)胞膜表面受體或細(xì)胞黏附分子等細(xì)胞表面結(jié)合位點通過一定的方式連接后，在真核細(xì)胞表達(dá)出的抗體樣融合蛋白，稱為免疫黏連素。其不含抗體Fab段，與抗原特異性無關(guān)，但與表達(dá)相應(yīng)受體或黏附分子的靶細(xì)胞結(jié)合后可發(fā)揮抗體的部分效應(yīng)功能，如ADCC、CDC等功能。

4．免疫黏連素（immunoadhesin）抗體C區(qū)和細(xì)胞膜775．催化抗體（catalyticantibody）根據(jù)免疫學(xué)及有機(jī)化學(xué)的基本原理，利用基因工程技術(shù)制備的具有催化活性的抗體，不僅能與抗原特異性結(jié)合，還能促使其發(fā)生化學(xué)轉(zhuǎn)變。特點：能選擇性結(jié)合并降解病毒、腫瘤細(xì)胞及其它生理靶細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白及碳水化合物。其高效催化活性及位點特異性蛋白降解作用為臨床疾病的治療提供新的途徑，有可能成為腫瘤導(dǎo)向治療的新方法。5．催化抗體（catalyticantibody）根據(jù)免疫78四、基因工程抗體的應(yīng)用四、基因工程抗體的應(yīng)用79（一）腫瘤基因工程抗體由于分子量小，滲透能力強(qiáng)，容易進(jìn)入腫瘤組織局部等優(yōu)點，可將細(xì)胞毒素、酶、藥物或放射性同位素偶連在抗體上，通過抗體的導(dǎo)向作用，特異性殺傷腫瘤組織或顯像。對術(shù)后殘留灶、術(shù)后復(fù)發(fā)、晚期腫瘤、腫瘤轉(zhuǎn)移灶的診斷治療具有重要的意義。

（一）腫瘤基因工程抗體由于分子量小，滲透能力強(qiáng)，容易進(jìn)入腫瘤80（二）感染性疾病病毒感染細(xì)菌感染（二）感染性疾病病毒感染81（三）器官移植抗IL-2R人/鼠嵌合抗體已進(jìn)入預(yù)防和治療移植排斥反應(yīng)Ⅲ臨床實驗，結(jié)果顯示：能使腎移植排斥反應(yīng)的發(fā)生率降低29%。（三）器官移植抗IL-2R人/鼠嵌合抗體已進(jìn)入預(yù)防和治療移植82（四）自身免疫性疾病

美國已用抗腫瘤壞死因子的嵌合抗體治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，療效顯著。

（四）自身免疫性疾病

美國已用抗腫瘤壞死因子的嵌合抗體治療類83抗體的制備與應(yīng)用抗體的制備與應(yīng)用84EmilvonBehring(1845-1917)antibody-In1890byvonBehringandKitasatodescribedanactivityinserumoftoxin-immunizedanimalsthatneutralizedtoxin.Transferofimmuneserumcouldprotectna?veanimalsfromdiphtheriaortetanus.HistoryEmilvonBehringantibody-In185Antibodies(Ab)

areproductsobtainedbyantigenstimulatingBlymphocytes,thenBcellswillproliferateintoplasmacellstoproducespecificantibodieswhichcanreactspecificallywithcorrespondingantigens.Immunoglobulins(Ig)

areallthoseglobulinswhichhavethefunctionorstructureofantibody.Twokindsofimmunoglobulins:

>secretedimmunoglobulins(sIg):Antibody >membraneimmunoglobulins(mIg):BCRAntibodies(Ab)areproductso86Day02468RestingBcellAntibodyformingcell(plasmacell)YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYDay0RestingBcellAntibodyYY87AntibodyStructureandFunctionAntibodyStructureandFunctio88StructureofimmunoglobulinsBasicstructureHeavychainandLightchain（重鏈和輕鏈）VariableregionandConstantregion（可變區(qū)和恒定區(qū)）OtherstructuresHingeregion（鉸鏈）Joiningchain（J鏈）Secretorycomponent(SC，分泌片)Domains（功能區(qū)）StructureofimmunoglobulinsBa89抗體的制備與應(yīng)用課件90peptidepeptideepitopebindingofHV(CDR)andepitopepeptidepeptideepitopebindingo91ThefunctionofIgV區(qū)的功能：特異性結(jié)合抗原（neutralization，中和作用）

抗體結(jié)合相應(yīng)抗原分子，發(fā)揮免疫效應(yīng)（生理與病理）；BCR特異性識別并結(jié)合抗原分子，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。ThefunctionofIgV區(qū)的功能：特異性結(jié)合抗92C區(qū)的功能

激活補(bǔ)體

Immunecomplex（IC）

激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑與細(xì)胞表面FcR結(jié)合

1）調(diào)理作用（opsonization)；IgG或IgM的Fc段與吞噬細(xì)胞表面FcR結(jié)合促吞噬；2）抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（Ab-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)3)介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)IgE的Fc段與肥大細(xì)胞表面FcR結(jié)合受體橋聯(lián)細(xì)胞活化

穿過胎盤和粘膜

IgG通過胎盤；sIgA穿過粘膜C區(qū)的功能93抗體的制備與應(yīng)用課件94

抗原是啟動機(jī)體免疫系統(tǒng)的先決條件Antigensaresubstancescapableofstimulatingimmunesystem,generatingantibodiesand/oreffectorlymphocytesandbindingspecificwiththeantibodyandeffectorlymphocytesinvivoorinvitro.抗原是啟動機(jī)體免疫系統(tǒng)的先決條件95

ImmunologicpropertiesofAgsImmunogenicity免疫原性antigenicity/immunoreactivity抗原性/反應(yīng)原性/免疫反應(yīng)性刺激免疫系統(tǒng)Immunologicproperties96抗原決定基-抗原特異性的分子基礎(chǔ)抗原決定基（antigenicdeterminant)指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。是被免疫細(xì)胞識別的靶結(jié)構(gòu)，也是免疫反應(yīng)具有特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。也稱為表位(epitope)?？乖瓫Q定基的位置、數(shù)目和空間結(jié)構(gòu)決定抗原特異性。抗原決定基-抗原特異性的分子基礎(chǔ)抗原決定基（antigeni97T細(xì)胞決定基（T細(xì)胞表位）：T細(xì)胞決定基主要位于抗原分子內(nèi)部，必須由APC將抗原加工處理為小分子多肽并與MHC分子結(jié)合，然后才能被TCR所識別。B細(xì)胞決定基（B細(xì)胞表位）：BCR能直接識別未經(jīng)APC加工的天然抗原，其識別的B細(xì)胞表位主要位于抗原分子的表面，與BCR具有易接近性。根據(jù)抗原決定基由TCR還是BCR識別分類T細(xì)胞決定基（T細(xì)胞表位）：T細(xì)胞決定基主要位于抗原分子內(nèi)部98主要內(nèi)容概述多克隆抗體的制備與應(yīng)用單克隆抗體的制備與應(yīng)用基因工程抗體的制備與應(yīng)用主要內(nèi)容概述99概述

第一代抗體：多克隆抗體(polyclonalantibody，PcAb)第二代抗體：單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)第三代抗體：基因工程抗體(geneticengineeringantibody，GeAb)概述

100第一節(jié)多克隆抗體的制備與應(yīng)用

（polyclonalantibody，PcAb)

概念：采用含有多種抗原決定基(B細(xì)胞表位)的抗原免疫動物，從而刺激多個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對多種抗原表位的不同抗體。因此，所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物，稱為多克隆抗體。制備流程：免疫原（佐劑）免疫動物，分離抗血清，鑒定，保存。第一節(jié)多克隆抗體的制備與應(yīng)用

（polyclonala101傳統(tǒng)抗血清（多克隆抗體）抗原(含多種表位)免疫123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞傳統(tǒng)抗血清抗原免疫123412341234脾臟淋巴結(jié)B102多克隆抗體的優(yōu)缺點優(yōu)點：制備流程簡便，操作技術(shù)要求低；制備周期短，一個月左右就能獲得目的抗體；缺點：制備的抗體是針對多種抗原決定基的混合物，特異性不高，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)；抗體來源于動物，應(yīng)用于人體會產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。應(yīng)用：主要用于免疫學(xué)檢測，被動免疫治療和緊急預(yù)防。其缺點限制了其在疾病診斷和治療中的應(yīng)用。

多克隆抗體的優(yōu)缺點優(yōu)點：103

抗A抗BABCrossreactionSameepitope抗AABCrossreactionSame104第二節(jié)單克隆抗體的制備與應(yīng)用

(monoclonalantibody，McAb)

概念：通過小鼠雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體技術(shù)生產(chǎn)的抗體。這種雜交瘤細(xì)胞既具有骨髓細(xì)胞能大量無限增殖的特性，又具有B細(xì)胞合成和分泌抗體的能力。每一個雜交瘤單克隆是用一個B細(xì)胞融合而產(chǎn)生的克隆，因此，由一個識別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體，稱為單克隆抗體。制備流程：免疫—融合—篩選第二節(jié)單克隆抗體的制備與應(yīng)用

(monoclonala105單克隆抗體制備流程單克隆抗體制備流程106雜交瘤技術(shù)的原理1.親本細(xì)胞的選擇

－小鼠骨髓瘤細(xì)胞：不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈；HGPRT-;TK-；與提供淋巴細(xì)胞的動物品系相同。能永生化。

備注：HGPRT:次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶TK:胸腺嘧啶激酶

－免疫脾細(xì)胞：經(jīng)抗原免疫的BALB/c小鼠的脾臟。不能永生化，但能分泌抗體，HGPRT+;TK+。雜交瘤技術(shù)的原理107

2.細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞

PEG

雜交瘤細(xì)胞

脾細(xì)胞融合后細(xì)胞的類型:

未融合的脾細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞未融合的瘤細(xì)胞

2.細(xì)胞融合1083.雜交瘤細(xì)胞的篩選采用篩選培養(yǎng)基：HAT培養(yǎng)基H-次黃嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶只有融合成功的細(xì)胞（雜交瘤）才能在HAT培養(yǎng)基上長期生長，原因在于只有雜交瘤能成功合成DNA。

3.雜交瘤細(xì)胞的篩選采用篩選培養(yǎng)基：HAT培養(yǎng)基109DNA合成途徑內(nèi)源性途徑（主要途徑）利用谷氨酰胺（Gln）或單磷酸尿苷酸在二氫葉酸還原酶的催化下合成DNA

(氨基喋呤是二氫葉酸還原酶的抑制劑，因此能有效阻斷DNA的合成)。外源性途徑（補(bǔ)救途徑）利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）或TK（胸腺嘧啶激酶）的催化作用下補(bǔ)救合成DNADNA合成途徑內(nèi)源性途徑（主要途徑）110融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況脾細(xì)胞（HGPRT+,TK+,能生長，但不能永生化）骨髓瘤細(xì)胞（HGPRT-,TK-，不能生長）雜交瘤細(xì)胞（HGPRT+,TK+，能生長，且能永生化）融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況1114、雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化

篩選：免疫熒光ELISA等

克隆化：有限稀釋法單個細(xì)胞顯微操作法軟瓊脂培養(yǎng)法4、雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化112配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇5.雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍1136.單克隆抗體的生產(chǎn)

體內(nèi)：BALB/c小鼠體內(nèi)誘發(fā)含有單抗的腹水體外：無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)等7.單克隆抗體的純化

硫酸銨沉淀法離子交換層析A蛋白-Sepharose親和層析6.單克隆抗體的生產(chǎn)114抗體的制備與應(yīng)用課件115單克隆抗體（McAb）的優(yōu)缺點優(yōu)點：成分、結(jié)構(gòu)均一，特異性強(qiáng)。一種McAb分子的所有區(qū)域完全相同，只針對一種抗原決定基，避免了交叉反應(yīng)。效價高使用一種抗原免疫動物，可以獲得針對不同抗原決定基的不同特異性的McAb。雜交瘤細(xì)胞能在體內(nèi)外無限繁殖、傳代，因此產(chǎn)量高，可連續(xù)生產(chǎn)單克隆抗體（McAb）的優(yōu)缺點116缺點：制備McAb成本昂貴，制備流程長，操作煩瑣，技術(shù)要求較高。McAb為鼠源性，應(yīng)用于人體將產(chǎn)生人抗鼠抗體（Humananti-mouseantibody,HAMA）,治療中可能引起過敏反應(yīng)且療效大大降低?？贵w為全I(xiàn)g，相對分子量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達(dá)不到有效殺傷濃度。缺點：117單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用（一）用作診斷試劑

1.檢測淋巴細(xì)胞表面分子，區(qū)分不同分化階段的淋巴細(xì)胞，鑒別淋巴細(xì)胞。2.鑒定病原體，準(zhǔn)確診斷傳染病。3.用于腫瘤的診斷和分型4.激素類單抗用于測定體內(nèi)激素含量，判斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài)

單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用（一）用作診斷試劑118（二）用作研究工具純化抗原分析和探查抗原結(jié)構(gòu)分析抗原決定基的功能（三）用于疾病的治療抗細(xì)胞表面分子單抗，用于移植排斥反應(yīng)的防治抗細(xì)胞因子單抗用于自身免疫性疾病的治療抗腫瘤單抗用于腫瘤的導(dǎo)向治療（二）用作研究工具119單克隆抗體用于免疫治療存在的問題單克隆抗體的特異性由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對腫瘤有嚴(yán)格特異性的單抗，對正常組織有交叉反應(yīng)異種抗體反應(yīng)鼠源性單抗用于人體，導(dǎo)致超敏反應(yīng)生產(chǎn)成本高,技術(shù)要求高，穩(wěn)定性差，難于普及應(yīng)用單克隆抗體用于免疫治療存在的問題120第三節(jié)基因工程抗體的制備與應(yīng)用

(geneticengineeringantibody，GeAb)

概念：利用基因工程及蛋白工程技術(shù)，對抗體基因進(jìn)行改造，按人們需要重新組裝抗體或抗體基因片段，并轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后表達(dá)的規(guī)?；贵w?；驹恚豪梅肿由飳W(xué)技術(shù)分離純化抗體基因或基因片段，在最大限度保留其抗原結(jié)合活性，降低其異源性的原則指導(dǎo)下，按臨床或科研需要對抗體基因進(jìn)行拼接組裝，在轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞表達(dá)，制備具有不同大小和不同功能的抗體。第三節(jié)基因工程抗體的制備與應(yīng)用

(geneticeng121基因工程抗體產(chǎn)生的時代背景1、單克隆抗體的毒副作用2、人雜交瘤技術(shù)未獲真正突破:融合率低、建株難、不穩(wěn)定、產(chǎn)量低、人體不能隨意免疫3、現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的推動4、基因工程抗體的優(yōu)點基因工程抗體產(chǎn)生的時代背景122基因工程抗體的優(yōu)點：易于獲得稀有抗體;人抗鼠抗體反應(yīng)（Humananti－mouseantibodyreaciton,HAMAR）低;小分子抗體：滲透力強(qiáng)、HAMAR低、親和性高、靶向性高、組織非特結(jié)合少等?；蚬こ炭贵w的優(yōu)點：123基因工程抗體的分類1、全抗體（1）嵌和抗體（chimericantibody）（2）人源化抗體（humanizedantibody）2、小分子抗體（1）Fab（2）ScFv（3）單域抗體（4）分子識別單位基因工程抗體的分類1243、其它抗體多價微型抗體雙鏈抗體（diabody）微型抗體(minibody)三鏈抗體(triabody)新型抗體分子新效能抗體雙特異性抗體（bispecificantibody,BsAb）胞內(nèi)抗體（intrabody）免疫黏連素（immunoadhesin）催化抗體（catalyticantibody）3、其它抗體多價微型抗體125抗體的制備與應(yīng)用課件126一、基因工程全抗體一、基因工程全抗體127基因工程全抗體研發(fā)的演變歷程鼠抗體100%鼠源鼠/人崁合抗體(66-75%人源)人源化抗體(90-95%人源)100%人源基因工程全抗體研發(fā)的演變歷程鼠抗體鼠/人崁合抗體人源化抗體1128（一）嵌和抗體（chimericantibody)

1、概念指由兩種不同種系來源的基因所編碼的抗體。2、原理從鼠源的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分離并鑒定抗體V區(qū)基因，再通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)將其連接到人抗體C區(qū)基因上，構(gòu)建Vm（mouse）-Ch（human）嵌和基因，并轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞表達(dá)。（一）嵌和抗體（chimericantibody)129嵌合抗體嵌合抗體130抗體的制備與應(yīng)用課件1313、嵌和抗體的優(yōu)缺點：優(yōu)點：特異性強(qiáng)親和性高具有全抗體的所有功能半衰期長、療效顯著缺點：有10－50%發(fā)生HAMA靶向性差3、嵌和抗體的優(yōu)缺點：132（二）人源化抗體（humanizedantibody）1、概念指利用基因工程技術(shù)，在嵌合抗體基礎(chǔ)上，針對嵌合抗體仍然具有較高的HAMA反應(yīng)的問題，進(jìn)一步對抗體進(jìn)行CDR及FR區(qū)域置換。通過這種方式獲得的抗體人源部分可達(dá)97%，又稱為CDR移植抗體（CDRgraftingantibody）。2、原理首先利用計算機(jī)模建技術(shù)，模擬抗體立體結(jié)構(gòu)。再根據(jù)同源性原理從人抗體基因庫中篩選人FR序列。通過分子模擬技術(shù)鑒別出與抗原結(jié)合位點密切相關(guān)的鼠單抗FR上氨基酸殘基，將這些殘基與CDR重組并一同移植到人FR上。（二）人源化抗體（humanizedantibody）133抗體的制備與應(yīng)用課件1343、方法

在抗體可變區(qū)，具有較高變異的是位于超變區(qū)內(nèi)（互補(bǔ)決定區(qū)，CDR）少數(shù)核心氨基酸，它決定了抗體的特異性，而可變區(qū)中的“框架區(qū)（FR）”則決定了可變區(qū)的三維空間結(jié)構(gòu)。通過同源蛋白三維結(jié)構(gòu)模建技術(shù)預(yù)測抗體可變區(qū)三維結(jié)構(gòu)后，對鼠及人VH、VL表面容易引起較強(qiáng)免疫反應(yīng)的氨基酸進(jìn)行比較分析，進(jìn)行人源化分子設(shè)計。3、方法135二、基因工程小分子抗體二、基因工程小分子抗體136小分子抗體1．Fab抗體片段2．單鏈抗體（singlechainFv,ScFv）3．單域抗體（singledomainantibody）4．分子識別單位（molecularrecognizationunit,MRU）

小分子抗體1．Fab抗體片段137（一）Fab抗體

由V鏈的VH、CH1及完整的L鏈構(gòu)成（一）Fab抗體138優(yōu)點：分子小，HAMAR低親和性高靶向性高于McAb缺點：仍然有一定的HAMAR發(fā)生靶向性不如ScFv穩(wěn)定性差優(yōu)點：139（二）單鏈抗體（ScFv）概念是指通過特定的方法將抗體分子VH和VL連接在一起構(gòu)成的只有一條鏈的抗體。優(yōu)點：克服了HAMAR的問題分子量小、滲透性高，靶向性增加ScFv可保留較高活性在體內(nèi)半衰期長、穩(wěn)定性高沒有Fc段，非特異結(jié)合減少，在腫瘤導(dǎo)向治療及成像診斷中有特別的意義（二）單鏈抗體（ScFv）140類型（1）二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體(dsFv）（2）由連接肽連接的單鏈抗體（ScFv）類型1411、dsFv（二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體）利用基因突變技術(shù)在VH和VL上加入半胱氨酸，利用兩者形成的二硫鍵將VH和VL連接在一起。突變部位的確定：由Jung等人在1994年用分子模建技術(shù)確定：VH44/VL100及VH105/VL43。1、dsFv（二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體）142抗體的制備與應(yīng)用課件1432、ScFv（由連接肽連接的單鏈抗體）2、ScFv（由連接肽連接的單鏈抗體）144

Linker的設(shè)計原則長度和性質(zhì)以不干擾VH和VL的折疊和不影響抗原結(jié)合部位的功能為標(biāo)準(zhǔn)。過短的接頭會影響VH和VL之間的相互作用，過長的接頭會影響抗體與抗原的結(jié)合，而且易受酶水解，不穩(wěn)定。接頭中盡量不含疏水氨基酸。常采用3次重復(fù)出現(xiàn)的4個甘氨酸和1個絲氨酸即（Gly4Ser）3,的15氨基酸接頭。

Linker的設(shè)計原則145（三）單域抗體只有一個VH或VL的抗體，通常為VH（三）單域抗體只有一個VH或VL的抗體，通常為VH146（四）分子識別單位只有一個CDR，通常為CDR3（四）分子識別單位只有一個CDR，通常為CDR3147三、其它基因工程抗體多價微型抗體雙鏈抗體（diabody）微型抗體(minibody)三鏈抗體(triabody)新型抗體分子新效能抗體雙特異性抗體（bispecificantibody,BsAb）胞內(nèi)抗體（intrabody）免疫黏連素（immunoadhesin）催化抗體（catalyticantibody）三、其它基因工程抗體多價微型抗體148（一）多價微型抗體1．雙鏈抗體（diabody）2．微型抗體(minibody)3．三鏈抗體(triabody)（一）多價微型抗體1．雙鏈抗體（diabody）1491．雙鏈抗體（diabody）雙鏈抗體是通過化學(xué)鉸鏈、黏性蛋白結(jié)構(gòu)域融合法和接頭長度控制三種主要手段將兩個ScFv通過非共價鍵結(jié)合形成剛性、穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)。具有兩個抗原結(jié)合位點，分子量約60KD。具有穿透力強(qiáng)的優(yōu)勢，易于通過血管壁進(jìn)入實體瘤。與ScFv比較，其腎臟的清除速度減慢。具有更大的臨床應(yīng)用價值。

1．雙鏈抗體（diabod