生物化學課件第六章核酸化學代謝DNA合成

第七節(jié)DNA的生物合成（復制）

DNAReplicationP361

第七節(jié)DNA的生物合成（復制）

DNAReplica1

DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結構模型后，1958年Crick提出了“中心法則”(Centraldogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。DNARNA蛋白質(zhì)復制復制轉錄反轉錄翻譯遺傳信息傳遞的中心法則病毒

DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼192DNA的生物合成：細胞內(nèi)合成DNA的過程1、復制：以DNA作為模板指導的DNA合成，即將DNA攜帶的信息傳至子代DNA。

四種核苷酸（dATP\dTTP\dCTP\dGTP）

2、反轉錄：DNA合成也可以RNA為模扳指導合成作用，見于RNA病毒。3、修復合成：當各種因素引起DNA損傷時，損傷DNA可修復合成，校正錯誤，完成正確合成，以保持DNA結構的穩(wěn)定性和遺傳信息的準確性。DNA的生物合成：細胞內(nèi)合成DNA的過程31、DNA的半保留復制

DNA在復制時，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補的原則合成兩條與模板鏈互補的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈是新合成的，這種復制方式稱為半保留復制。一、DNA復制1、DNA的半保留復制

DNA在復制時，兩條4DNA的半保留復制實驗依據(jù)

1958年M.Meselson和F.W.Stahl用大腸桿菌為材料，在含15N和14N的NH4cl中培養(yǎng)證實，用同位素示蹤標記加密度梯度離心技術實驗,證明了DNA是采取半保留的方式進行復制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNADNA在離心管中的沉降位置P361培養(yǎng)12代培養(yǎng)1代培養(yǎng)2代DNA的半保留復制實驗依據(jù)1958年M.Mesels52、原核生物DNA聚合反應有關的酶類

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引發(fā)體primosome

：啟動RNA引物鏈的合成。

(3）DNA連接酶（DNAligas（4）DNA解鏈酶：ATP供能解開DNA雙鏈(5）單鏈結合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：結合在解開的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。

(6）拓撲異構酶(topoisomerase):兼具內(nèi)切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。能改變DNA空間構型的酶，合成后再引向超螺旋。機制：切開環(huán)狀一條鏈解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物2、原核生物DNA聚合反應有關的酶類

（1）DNA聚合酶(D6（1）DNA聚合酶催化的鏈延長反應5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′模板鏈只能加到已有核苷酸的游離3’羥基上，不能自身聚合，需引物p363（1）DNA聚合酶催化的鏈延長反應5′RNA引物子鏈3′3′7大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個細胞的酶分子統(tǒng)計數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用聚合速率（nt/s）DNA聚合酶Ⅰ109000單鏈多肽400+++16-20120000單鏈多肽100++-40400，000（10種亞基）10-20++-250-1000比較項目DNA聚合酶III切除引物,校對，修復修復復制功能

1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶和，它們涉及DNA的錯誤傾向修復（erroounerepair）P364大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA分子量DNA109000單8DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點（I、II、III）3′3′5′5′錯配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點（I、II、III）9DNA聚合酶5′-3′外切酶活力（I）

5′-3′核酸外切酶水解位點單鏈缺口5′切除引物,修復DNA聚合酶5′-3′外切酶活力（I）

5′-3′核酸外10大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結構和功能（10個亞基）延長因子DNA聚合酶Ⅲ兩個亞基夾住DNA核心酶校對引物的結合和識別促使核心酶二聚化組建核心酶P364大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結構和功能（10個亞基）11圖11-8DNAPolIII的二聚體作用生物化學課件第六章核酸化學代謝DNA合成12（2）連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP（噬菌體和動物）或NADH（細菌）AMP+PPiATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈DNA復制、損傷修復、重組P367（2）連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP（噬菌體和動物）AM133、原核細胞DNA的半不連續(xù)復制復制過程

semidiscontinuousreplication

P3683、原核細胞DNA的半不連續(xù)復制P36814（1）復制的起始點與方向

親代DNA開鏈，復制起始點呈叉型移動?！褟椭破鹗键c：DNA復制要從DNA分子的特定部位開始，此部位稱復制起始點。原核：僅含一個，約245bp,特殊的重復序列。真核：多個起始點例：酵母17號染色體含400個?！褟椭品较颍汉N機制一個起點2個叉，不同方向合成兩條鏈，此為常見方式。2個起點，2個叉，各合一條鏈（腺病毒）。一個起點一個叉，同方向合成兩條鏈（質(zhì)粒ColEI）--單向復制（1）復制的起始點與方向15DNA的雙向和單向復制----起始環(huán)狀

DNA復制時所形成的O結構起始點復制叉的推進復制叉起始點起始點起始點復制叉復制叉未復制DNA單向復制雙向復制DNA的雙向和單向復制----起始環(huán)狀DNA復制時所形成的16大腸桿菌復制起點成串排列的重復序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三個13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白結合位點四個9bp序列DnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復制起點在起始階段的結構模型DnaA識別起始點在復制起點特異部位解開雙鏈DNAP368大腸桿菌復制起點成串排列的重復序列

GATCTNTTNTTT17（2）原核細胞DNA的半不連續(xù)復制復制過程

復制叉的移動方向解旋酶解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導鏈隨后鏈3′5′復制的起始DNA鏈的延長DNA鏈終止5′RNA引物3′3′P369,393,274DNA聚合酶III切除引物、缺口填補、校對（2）原核細胞DNA的半不連續(xù)復制復制過程

復制叉的移動方向18聚合酶III核心酶大腸桿菌復制體結構示意圖聚合酶I聚合酶III核心酶滯后鏈前導鏈解螺旋酶引物合成酶RNA引物引發(fā)體拓撲異構酶II-夾子-聚體-夾子-復合物RNA引物單鏈結合蛋白（SSB）活化引物合成酶P370聚合酶III核心酶大腸桿菌復制體結構示意圖聚合酶I聚合酶II19復制叉處前導鏈和隨后鏈同時合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物體引物體解旋酶解旋酶引物合成酶DnaG蛋白前導鏈和隨后鏈被同一個DNA聚合酶III不對稱二聚體合成復制叉處前導鏈和隨后鏈同時合成的工作模型聚合酶III全酶引物20（3）大腸桿菌染色體復制的終止oric復制叉2復制叉1終止復制叉2終止復制叉1復制叉1復制叉2完成復制DNA拓撲異構酶連鎖體終止子位點連鎖體在細胞分裂前必須解開，否則導致細胞分裂失敗，細胞死亡。兩個復制叉從起始反向移動至約180O的對面終止區(qū)相遇（3）大腸桿菌染色體復制的終止oric復制叉2復制叉1終止21（4）復制的忠實性

DNA復制過程是一個高度精確的過程，據(jù)估計，大腸桿菌DNA復制5X109堿基對僅出現(xiàn)一個誤差，保證復制忠實性的原因主要有以下三點:

DNA聚合酶的高度專一性（嚴格遵循堿基配對原則，但錯配率為7

X10-6

）

DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3’-5’

外切酶切除）起始時以RNA作為引物P374（4）復制的忠實性DNA復制過程是一個高度精22DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配鹼基復制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯配核苷酸DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配鹼基復制方向正確核苷酸5′23

起始時以RNA作為引物的作用

DNA復制為什么要合成一個RNA引物，而后又把這個引物消除呢？這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有3’-5’外切酶功能校對復制過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時”的，當DNA開始聚合以后再以5’-3’外切酶的功能切除，以高忠實性的脫氧核苷酸取而代之，確保復制的忠實性。（RNA聚合酶無校對功能，不需引物，可以從頭合成）

起始時以RNA作為引物的作用

DNA復制為244、真核生物復制的特點（1）復制速度：是原核的1/10，但復制起始點多。（2）引物和岡琦片段小于原核，引物為10個，片段100~200；原核引物十幾~幾十，片段1000~2000。（3）復制需DNApol及多種因子參加，pol

pol在核內(nèi)起主要作用。（4）pol為線粒體復制酶。（5）DNA復制位于細胞周期的S期。4、真核生物復制的特點25真核細胞DNA復制的特點多個起點復制起點起點起點起點起點起點真核生物DNA聚合酶端粒（telemere）的復制真核細胞DNA復制的特點多個起點復制起點起點起點起點起點26真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶分子量亞基數(shù)細胞內(nèi)分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶110-23，000多個細胞核～80%無120，000二個細胞核和線粒體2～15%3-5外切酶400，000二個細胞核+10～25%3-5外切酶DNA聚合酶DNA聚合酶45，000一個細胞核10～15%無核DNA合成線粒體DNA合成引物合成

修復功能真核生物的DNA聚合酶DNA分子量DNA110-23，00027

真核生物DNA復制與核小體裝配同步進行，復制完成后隨即組合成染色體并從G2期過渡到M期。染色體DNA是線性結構。染色體兩端DNA子鏈上最后復制的RNA引物，去除后留下空隙。剩下的DNA單鏈母鏈如果不填補成雙鏈，就會被核內(nèi)Dnase酶解。某些低等生物染色體經(jīng)多次復制會越來越短。

真核生物DNA復制與核小體裝配同步進行，復制完成后28端粒端粒：真核生物線性染色體的兩個末端具有特殊結構稱為端粒。端粒由許多成串的短的重復序列組成。一條鏈上富含G，如人的端粒TTAGGG，原生動物四膜蟲為TTGGGG,植物

TTTAGGG。端粒的功能：穩(wěn)定染色體末端結構，防止末端染色體降解；防止染色體間末端連接。（原核生物染色體是環(huán)狀的，5′末端岡奇片段的RNA引物被除去后可借助另半圈DNA鏈向前延伸填補。）端粒29端粒酶（telomerase）DNA復制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機制在引物被降解后合成相應的片段.如果沒有特殊的機制合成末端序列，染色體就會在細胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清。

端粒酶是一種含RNA的蛋白復合物，實質(zhì)上是一種逆轉錄酶，它以自身攜帶的RNA為模板，催化互補鏈DNA片段的合成，使復制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

端粒酶含150個堿基RNA鏈。端粒酶結合到端粒的3′末端上，以RNA鏈5′末端識別DNA3′末端并合成互補鏈，端粒3′單鏈末端回折作為引物合成其互補鏈。端粒酶（telomerase）DNA復制需要引物30

缺乏端粒酶活性時，細胞分裂將端粒不斷縮短，引起細胞生長停止甚至死亡。腫瘤細胞端?；钚愿?，設想端粒酶作為抗癌治療的靶位點。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶

初步研究表明，人體中生殖細胞的端粒長度保持不變，而體細胞的端粒長度則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一個推論是：人的生殖細胞具端粒酶的活力，體細胞則否。這一問題的解決無疑會有助于對生命衰老的認識。

缺乏端粒酶活性時，細胞分裂將端粒不斷縮短，引起細胞生31

端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)歷程——記諾貝爾生理學或醫(yī)學獎諾貝爾獎主頁上介紹她/他們獲獎的原因是揭示了“howchromosomesareprotectedbytelomeresandtheenzymetelomerase”（染色體是如何被端粒和端粒酶保護的）

端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)歷程——記諾貝爾生理學或醫(yī)學獎諾貝爾獎主32

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p37333

34真核和原核DNA細胞復制比較

拓撲酶DNA復制后DNA超螺旋裝配成染色體真核和原核DNA細胞復制比較35小結：一、半不連續(xù)合成在DNA復制過程中，一條鏈是連續(xù)合成的，而另一條鏈是不連續(xù)合成。體內(nèi)僅含催化5’3’合成的DNA酶。60年代岡琦片段的發(fā)現(xiàn)解決了這個問題：合成5’3’前導鏈（leadingstrand）是連續(xù)的，方向與復制叉一致。合成3’

5’隨從鏈時，方向與叉相反，合成不連續(xù)，各片段連成一條鏈。小結：在DNA復制過程中，一條鏈是連續(xù)合成的，而另36二、復制過程和參與酶及因子（一）復制的起始（分兩步）1、螺旋的松弛與解鏈（1）拓撲異構酶---能改變DNA空間構型的酶作用：DNA復制時松弛超螺旋，以利復制叉的行進及DNA合成，合成后再引向超螺旋。功能：不清楚，可催化體外拓撲異構化反應，分兩型。二、復制過程和參與酶及因子37拓撲異構酶I

（topoisomerase--I）作用：松弛超螺旋，不需ATP,

機制：切開環(huán)狀一條鏈打結與解結環(huán)狀雙鏈DNA的合成環(huán)連與解環(huán)連原核：對負超螺旋正真核：對正、負均有作用。拓撲異構酶II----旋轉酶（gyrase）作用：松弛超螺旋松+ATP

超（-）切開環(huán)狀兩條鏈打結與解結環(huán)連與解環(huán)連拓撲異構酶I（topoisomerase--I）作38（2）解鏈酶（helicase）------復制蛋白rep作用：ATP供能時，解開DNA雙鏈。原核：編碼解鏈酶的基因是dnaB,DnaB表示蛋白產(chǎn)物。前導鏈結合rep蛋白，隨從鏈結合解鏈酶IIⅢ。（3）單鏈結合蛋白-singlestrandbindingprotein-SSB作用：SSB與解開DNA單鏈結合，保護穩(wěn)定DNA。與新復制DNA單鏈結合，以防降解。超螺旋DNA拓撲酶松弛解鏈酶解開雙鏈

SSB復制開始生物化學課件第六章核酸化學代謝DNA合成392、引發(fā)（需引發(fā)酶及引發(fā)前體參與）（1）引物酶（primase）作用：以DNA為模板，自5’3’合成RNA小片段,3’末端為-OH，長短：十幾到幾十個核苷酸。原核：dnaG基因編碼DnaG蛋白即引物酶。（2）引發(fā)前體（preprimosome）由多種蛋白因子組成復合物。作用：合成RNA引物，沿隨從鏈復制叉的行進方向移動，在不同部位，合成RNA引物?？偨Y：合成RNA引物，在引物3’-OH末段進行DNA片段合成。（二）DNA鏈的延長反應體系：DNA模板，DNA聚合酶，

dNTP，引物，Mg2+離子

2、引發(fā)（需引發(fā)酶及引發(fā)前體參與）40過程：引物3’-OHdNTPppi引物-dNMP反應式：DNA+dNTP（DNA）n+1+ppi反應機理：磷親核攻擊。真核與原核中DNA聚合酶有幾種類型，作用方式相同，但各具特性及功能。1、大腸桿菌DNA聚合酶（3種）（1）pol：催化5’3’的聚合作用，合成20個核苷酸即離開模板，填充空隙。有3’5’外切酶活性，去除錯誤堿基的校對作用。有5’3’外切酶活性，去除RNA引物及修正錯誤堿基。（2）pol：5’3’DNA合成及3’5’外切酶活性，體內(nèi)功能不清楚。（3）polⅢ:DNA鏈延長起主要作用，細菌中1000個dNTP/秒加入。3’5’外切酶活性，校對作用，與pol配合錯誤率降至10-6。（4）DNA復制的保真性：過程：引物3’-OHdNTPppi引物-41Pol:與引發(fā)酶配合，參與隨從鏈的合成。RFA(replicationfactorA):DNA延長中RFA與單鏈結合起到SSB的作用。（三）終止

連接酶：作用--使相鄰的DNA片段,以3’5’磷酸二酯鍵相連，需ATP。

前導鏈是連續(xù)合成的，隨從鏈在連接酶作用下連成一條鏈。

拓撲酶DNA復制后DNA超螺旋裝配成染色體2、真核生物DNApol特性與大腸桿菌相似，共五種：pol：催化前導鏈及隨從連的合成，需增殖細胞核抗原蛋白PCNA（proliferatatingcellnucleusantigen-PCNA）的參與。Pol:與引發(fā)酶配合，參與隨從鏈的合成。42二、

逆轉錄作用1、概念2、逆轉錄酶3、逆轉錄的生物學意義擴充了中心法則有助于對病毒致癌機制的了解與真核細胞分裂和胚胎發(fā)育有關逆轉錄酶是分子生物學重要工具酶三種功能依賴RNA的DNA聚合酶活力

以RNA為模板合成DNA，這與通常轉錄過程中遺傳信息從DNA到RNA的方向相反，故稱為逆轉錄作用。P276核糖核酸酶H活力：水解RNA-DNA分子中RNA；具有

3’--5’和5’--3’核酸外切酶作用依賴DNA指導下的DNA聚合酶活力二、逆轉錄作用1、概念2、逆轉錄酶3、逆轉錄的生物43逆轉錄過程中cDNA的合成

依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力水解RNA依賴DNA的DNA聚合酶逆轉錄過程中cDNA的合成

依賴RNA的DNA聚合酶核糖核44

反轉錄酶病毒（retrovirus）

性質(zhì)：一類RNA病毒，含反轉錄酶，因致癌又稱RNA腫瘤病毒。

組成：核心RNA，蛋白外殼。

病毒生活周期：早、晚兩期早期：進入細胞后放出病毒RNADNA整合進宿主染色體。晚期：轉錄和翻譯。HIV-人類免疫缺陷病毒：感染人T4淋巴細胞,使病人喪失免疫能力,死于感染。不與外界接觸的胸腺、骨髓、脾臟、扁桃腺及淋巴結等稱內(nèi)分泌淋巴系統(tǒng)。胸腺位于胸骨后，能生產(chǎn)淋巴細胞（T細胞），能誘導細胞免疫，調(diào)動吞噬細胞等包圍、吞噬并將病原菌消滅。

反轉錄酶病毒（retrovirus）45逆逆轉錄病毒的生活周期生活周期RNA衣殼被膜逆轉錄酶轉錄轉譯整合入宿主細胞染色體DNA進入細胞丟失被膜丟失衣殼逆轉錄RNARNAcDNA衣殼蛋白被膜蛋白逆轉錄酶逆逆轉錄病毒的生活周期生活周期RNA衣殼被膜逆轉錄酶轉錄轉譯46三、

DNA的損傷與修復

某些物理化學因子，如紫外線、電離輻射和化學誘變劑等，都有引起生物突變和致死的作用，其機理是作用于DNA，造成DNA結構和功能的破壞，稱為DNA的損傷.DNA的修復主要有以下類型:暗修復1、光裂合酶修復2、切除修復3、重組修復三、DNA的損傷與修復某些物理化學因47DNA紫外線損傷的光裂合酶修復1、形成嘧啶二聚體2、光復合酶結合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復后酶被釋放DNA紫外線損傷的光裂合酶修復1、形成嘧啶二聚體2、光復合酶48DNA的損傷和切除修復堿基丟失堿基缺陷或錯配結構缺陷切開核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切開切除修復連接糖苷酶插入酶堿基取代DNA的損傷和切除修復堿基丟失堿基缺陷或錯配結構缺陷切開核酸49DNA的重組修復胸腺嘧啶二聚體復制核酸酶及重組蛋白修復復制DNA聚合酶DNA連接酶重組DNA的重組修復胸腺嘧啶二聚體復制核酸酶及重組蛋白修復復制D50

四、DNA的突變

DNA分子中的核苷酸序列發(fā)生突然而穩(wěn)定的改變，從而導致DNA的復制以及后來的轉錄和翻譯產(chǎn)物隨之發(fā)生變化，表現(xiàn)出異常的遺傳特性，稱為DNA的突變。它包括由于DNA損傷和錯配得不到修復而引起的突變，以及由于不同DNA分子之間的交換而引起的遺傳重組。（一）突變的類型

堿基對的置換(substitution)

移碼突變(framesshiftmutation)四、DNA的突變

DNA分子中的核苷酸序列51

DNA突變的類型

-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-轉換野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對的置換(substitution)移碼突變(framesshiftmutation)

-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失AT嘧啶間、嘌呤間嘧啶與嘌呤間DNA突變的類型

-T-C-T-G-C-T-G-T-A-52

（二）突變的意義1、進化、分化的分子基礎。2、基因型改變。（表型不變）3、致死性的突變。（消滅病原體）4、某些疾病的發(fā)病基礎。（三）誘變劑堿基類似物(baseanalog)

堿基修飾劑(basemodifier)嵌入染料(intercalationdye)

紫外線(ultraviolet)和電離輻射(ionizingradiation)

（二）突變的意義（三）誘變劑53

54

55

第七節(jié)DNA的生物合成（復制）

DNAReplicationP361

第七節(jié)DNA的生物合成（復制）

DNAReplica56

DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結構模型后，1958年Crick提出了“中心法則”(Centraldogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。DNARNA蛋白質(zhì)復制復制轉錄反轉錄翻譯遺傳信息傳遞的中心法則病毒

DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1957DNA的生物合成：細胞內(nèi)合成DNA的過程1、復制：以DNA作為模板指導的DNA合成，即將DNA攜帶的信息傳至子代DNA。

四種核苷酸（dATP\dTTP\dCTP\dGTP）

2、反轉錄：DNA合成也可以RNA為模扳指導合成作用，見于RNA病毒。3、修復合成：當各種因素引起DNA損傷時，損傷DNA可修復合成，校正錯誤，完成正確合成，以保持DNA結構的穩(wěn)定性和遺傳信息的準確性。DNA的生物合成：細胞內(nèi)合成DNA的過程581、DNA的半保留復制

DNA在復制時，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補的原則合成兩條與模板鏈互補的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈是新合成的，這種復制方式稱為半保留復制。一、DNA復制1、DNA的半保留復制

DNA在復制時，兩條59DNA的半保留復制實驗依據(jù)

1958年M.Meselson和F.W.Stahl用大腸桿菌為材料，在含15N和14N的NH4cl中培養(yǎng)證實，用同位素示蹤標記加密度梯度離心技術實驗,證明了DNA是采取半保留的方式進行復制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNADNA在離心管中的沉降位置P361培養(yǎng)12代培養(yǎng)1代培養(yǎng)2代DNA的半保留復制實驗依據(jù)1958年M.Mesels602、原核生物DNA聚合反應有關的酶類

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引發(fā)體primosome

：啟動RNA引物鏈的合成。

(3）DNA連接酶（DNAligas（4）DNA解鏈酶：ATP供能解開DNA雙鏈(5）單鏈結合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：結合在解開的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。

(6）拓撲異構酶(topoisomerase):兼具內(nèi)切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。能改變DNA空間構型的酶，合成后再引向超螺旋。機制：切開環(huán)狀一條鏈解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物2、原核生物DNA聚合反應有關的酶類

（1）DNA聚合酶(D61（1）DNA聚合酶催化的鏈延長反應5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′模板鏈只能加到已有核苷酸的游離3’羥基上，不能自身聚合，需引物p363（1）DNA聚合酶催化的鏈延長反應5′RNA引物子鏈3′3′62大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個細胞的酶分子統(tǒng)計數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用聚合速率（nt/s）DNA聚合酶Ⅰ109000單鏈多肽400+++16-20120000單鏈多肽100++-40400，000（10種亞基）10-20++-250-1000比較項目DNA聚合酶III切除引物,校對，修復修復復制功能

1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶和，它們涉及DNA的錯誤傾向修復（erroounerepair）P364大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA分子量DNA109000單63DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點（I、II、III）3′3′5′5′錯配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點（I、II、III）64DNA聚合酶5′-3′外切酶活力（I）

5′-3′核酸外切酶水解位點單鏈缺口5′切除引物,修復DNA聚合酶5′-3′外切酶活力（I）

5′-3′核酸外65大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結構和功能（10個亞基）延長因子DNA聚合酶Ⅲ兩個亞基夾住DNA核心酶校對引物的結合和識別促使核心酶二聚化組建核心酶P364大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結構和功能（10個亞基）66圖11-8DNAPolIII的二聚體作用生物化學課件第六章核酸化學代謝DNA合成67（2）連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP（噬菌體和動物）或NADH（細菌）AMP+PPiATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈DNA復制、損傷修復、重組P367（2）連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP（噬菌體和動物）AM683、原核細胞DNA的半不連續(xù)復制復制過程

semidiscontinuousreplication

P3683、原核細胞DNA的半不連續(xù)復制P36869（1）復制的起始點與方向

親代DNA開鏈，復制起始點呈叉型移動。⊙復制起始點：DNA復制要從DNA分子的特定部位開始，此部位稱復制起始點。原核：僅含一個，約245bp,特殊的重復序列。真核：多個起始點例：酵母17號染色體含400個。⊙復制方向：含三種機制一個起點2個叉，不同方向合成兩條鏈，此為常見方式。2個起點，2個叉，各合一條鏈（腺病毒）。一個起點一個叉，同方向合成兩條鏈（質(zhì)粒ColEI）--單向復制（1）復制的起始點與方向70DNA的雙向和單向復制----起始環(huán)狀

DNA復制時所形成的O結構起始點復制叉的推進復制叉起始點起始點起始點復制叉復制叉未復制DNA單向復制雙向復制DNA的雙向和單向復制----起始環(huán)狀DNA復制時所形成的71大腸桿菌復制起點成串排列的重復序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三個13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白結合位點四個9bp序列DnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復制起點在起始階段的結構模型DnaA識別起始點在復制起點特異部位解開雙鏈DNAP368大腸桿菌復制起點成串排列的重復序列

GATCTNTTNTTT72（2）原核細胞DNA的半不連續(xù)復制復制過程

復制叉的移動方向解旋酶解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導鏈隨后鏈3′5′復制的起始DNA鏈的延長DNA鏈終止5′RNA引物3′3′P369,393,274DNA聚合酶III切除引物、缺口填補、校對（2）原核細胞DNA的半不連續(xù)復制復制過程

復制叉的移動方向73聚合酶III核心酶大腸桿菌復制體結構示意圖聚合酶I聚合酶III核心酶滯后鏈前導鏈解螺旋酶引物合成酶RNA引物引發(fā)體拓撲異構酶II-夾子-聚體-夾子-復合物RNA引物單鏈結合蛋白（SSB）活化引物合成酶P370聚合酶III核心酶大腸桿菌復制體結構示意圖聚合酶I聚合酶II74復制叉處前導鏈和隨后鏈同時合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物體引物體解旋酶解旋酶引物合成酶DnaG蛋白前導鏈和隨后鏈被同一個DNA聚合酶III不對稱二聚體合成復制叉處前導鏈和隨后鏈同時合成的工作模型聚合酶III全酶引物75（3）大腸桿菌染色體復制的終止oric復制叉2復制叉1終止復制叉2終止復制叉1復制叉1復制叉2完成復制DNA拓撲異構酶連鎖體終止子位點連鎖體在細胞分裂前必須解開，否則導致細胞分裂失敗，細胞死亡。兩個復制叉從起始反向移動至約180O的對面終止區(qū)相遇（3）大腸桿菌染色體復制的終止oric復制叉2復制叉1終止76（4）復制的忠實性

DNA復制過程是一個高度精確的過程，據(jù)估計，大腸桿菌DNA復制5X109堿基對僅出現(xiàn)一個誤差，保證復制忠實性的原因主要有以下三點:

DNA聚合酶的高度專一性（嚴格遵循堿基配對原則，但錯配率為7

X10-6

）

DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3’-5’

外切酶切除）起始時以RNA作為引物P374（4）復制的忠實性DNA復制過程是一個高度精77DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配鹼基復制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯配核苷酸DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配鹼基復制方向正確核苷酸5′78

起始時以RNA作為引物的作用

DNA復制為什么要合成一個RNA引物，而后又把這個引物消除呢？這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有3’-5’外切酶功能校對復制過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時”的，當DNA開始聚合以后再以5’-3’外切酶的功能切除，以高忠實性的脫氧核苷酸取而代之，確保復制的忠實性。（RNA聚合酶無校對功能，不需引物，可以從頭合成）

起始時以RNA作為引物的作用

DNA復制為794、真核生物復制的特點（1）復制速度：是原核的1/10，但復制起始點多。（2）引物和岡琦片段小于原核，引物為10個，片段100~200；原核引物十幾~幾十，片段1000~2000。（3）復制需DNApol及多種因子參加，pol

pol在核內(nèi)起主要作用。（4）pol為線粒體復制酶。（5）DNA復制位于細胞周期的S期。4、真核生物復制的特點80真核細胞DNA復制的特點多個起點復制起點起點起點起點起點起點真核生物DNA聚合酶端粒（telemere）的復制真核細胞DNA復制的特點多個起點復制起點起點起點起點起點81真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶分子量亞基數(shù)細胞內(nèi)分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶110-23，000多個細胞核～80%無120，000二個細胞核和線粒體2～15%3-5外切酶400，000二個細胞核+10～25%3-5外切酶DNA聚合酶DNA聚合酶45，000一個細胞核10～15%無核DNA合成線粒體DNA合成引物合成

修復功能真核生物的DNA聚合酶DNA分子量DNA110-23，00082

真核生物DNA復制與核小體裝配同步進行，復制完成后隨即組合成染色體并從G2期過渡到M期。染色體DNA是線性結構。染色體兩端DNA子鏈上最后復制的RNA引物，去除后留下空隙。剩下的DNA單鏈母鏈如果不填補成雙鏈，就會被核內(nèi)Dnase酶解。某些低等生物染色體經(jīng)多次復制會越來越短。

真核生物DNA復制與核小體裝配同步進行，復制完成后83端粒端粒：真核生物線性染色體的兩個末端具有特殊結構稱為端粒。端粒由許多成串的短的重復序列組成。一條鏈上富含G，如人的端粒TTAGGG，原生動物四膜蟲為TTGGGG,植物

TTTAGGG。端粒的功能：穩(wěn)定染色體末端結構，防止末端染色體降解；防止染色體間末端連接。（原核生物染色體是環(huán)狀的，5′末端岡奇片段的RNA引物被除去后可借助另半圈DNA鏈向前延伸填補。）端粒84端粒酶（telomerase）DNA復制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機制在引物被降解后合成相應的片段.如果沒有特殊的機制合成末端序列，染色體就會在細胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清。

端粒酶是一種含RNA的蛋白復合物，實質(zhì)上是一種逆轉錄酶，它以自身攜帶的RNA為模板，催化互補鏈DNA片段的合成，使復制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

端粒酶含150個堿基RNA鏈。端粒酶結合到端粒的3′末端上，以RNA鏈5′末端識別DNA3′末端并合成互補鏈，端粒3′單鏈末端回折作為引物合成其互補鏈。端粒酶（telomerase）DNA復制需要引物85

缺乏端粒酶活性時，細胞分裂將端粒不斷縮短，引起細胞生長停止甚至死亡。腫瘤細胞端粒活性高，設想端粒酶作為抗癌治療的靶位點。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶

初步研究表明，人體中生殖細胞的端粒長度保持不變，而體細胞的端粒長度則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一個推論是：人的生殖細胞具端粒酶的活力，體細胞則否。這一問題的解決無疑會有助于對生命衰老的認識。

缺乏端粒酶活性時，細胞分裂將端粒不斷縮短，引起細胞生86

端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)歷程——記諾貝爾生理學或醫(yī)學獎諾貝爾獎主頁上介紹她/他們獲獎的原因是揭示了“howchromosomesareprotectedbytelomeresandtheenzymetelomerase”（染色體是如何被端粒和端粒酶保護的）

端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)歷程——記諾貝爾生理學或醫(yī)學獎諾貝爾獎主87

p373

p37388

89真核和原核DNA細胞復制比較

拓撲酶DNA復制后DNA超螺旋裝配成染色體真核和原核DNA細胞復制比較90小結：一、半不連續(xù)合成在DNA復制過程中，一條鏈是連續(xù)合成的，而另一條鏈是不連續(xù)合成。體內(nèi)僅含催化5’3’合成的DNA酶。60年代岡琦片段的發(fā)現(xiàn)解決了這個問題：合成5’3’前導鏈（leadingstrand）是連續(xù)的，方向與復制叉一致。合成3’

5’隨從鏈時，方向與叉相反，合成不連續(xù)，各片段連成一條鏈。小結：在DNA復制過程中，一條鏈是連續(xù)合成的，而另91二、復制過程和參與酶及因子（一）復制的起始（分兩步）1、螺旋的松弛與解鏈（1）拓撲異構酶---能改變DNA空間構型的酶作用：DNA復制時松弛超螺旋，以利復制叉的行進及DNA合成，合成后再引向超螺旋。功能：不清楚，可催化體外拓撲異構化反應，分兩型。二、復制過程和參與酶及因子92拓撲異構酶I

（topoisomerase--I）作用：松弛超螺旋，不需ATP,

機制：切開環(huán)狀一條鏈打結與解結環(huán)狀雙鏈DNA的合成環(huán)連與解環(huán)連原核：對負超螺旋正真核：對正、負均有作用。拓撲異構酶II----旋轉酶（gyrase）作用：松弛超螺旋松+ATP

超（-）切開環(huán)狀兩條鏈打結與解結環(huán)連與解環(huán)連拓撲異構酶I（topoisomerase--I）作93（2）解鏈酶（helicase）------復制蛋白rep作用：ATP供能時，解開DNA雙鏈。原核：編碼解鏈酶的基因是dnaB,DnaB表示蛋白產(chǎn)物。前導鏈結合rep蛋白，隨從鏈結合解鏈酶IIⅢ。（3）單鏈結合蛋白-singlestrandbindingprotein-SSB作用：SSB與解開DNA單鏈結合，保護穩(wěn)定DNA。與新復制DNA單鏈結合，以防降解。超螺旋DNA拓撲酶松弛解鏈酶解開雙鏈

SSB復制開始生物化學課件第六章核酸化學代謝DNA合成942、引發(fā)（需引發(fā)酶及引發(fā)前體參與）（1）引物酶（primase）作用：以DNA為模板，自5’3’合成RNA小片段,3’末端為-OH，長短：十幾到幾十個核苷酸。原核：dnaG基因編碼DnaG蛋白即引物酶。（2）引發(fā)前體（preprimosome）由多種蛋白因子組成復合物。作用：合成RNA引物，沿隨從鏈復制叉的行進方向移動，在不同部位，合成RNA引物?？偨Y：合成RNA引物，在引物3’-OH末段進行DNA片段合成。（二）DNA鏈的延長反應體系：DNA模板，DNA聚合酶，

dNTP，引物，Mg2+離子

2、引發(fā)（需引發(fā)酶及引發(fā)前體參與）95過程：引物3’-OHdNTPppi引物-dNMP反應式：DNA+dNTP（DNA）n+1+ppi反應機理：磷親核攻擊。真核與原核中DNA聚合酶有幾種類型，作用方式相同，但各具特性及功能。1、大腸桿菌DNA聚合酶（3種）（1）pol：催化5’3’的聚合作用，合成20個核苷酸即離開模板，填充空隙。有3’5’外切酶活性，去除錯誤堿基的校對作用。有5’3’外切酶活性，去除RNA引物及修正錯誤堿基。（2）pol：5’3’DNA合成及3’5’外切酶活性，體內(nèi)功能不清楚。（3）polⅢ:DNA鏈延長起主要作用，細菌中1000個dNTP/秒加入。3’5’外切酶活性，校對作用，與pol配合錯誤率降至10-6。（4）DNA復制的保真性：過程：引物3’-OHdNTPppi引物-96Pol:與引發(fā)酶配合，參與隨從鏈的合成。RFA(replicationfactorA):DNA延長中RFA與單鏈結合起到SSB的作用。（三）終止

連接酶：作用--使相鄰的DNA片段,以3’5’磷酸二酯鍵相連，需ATP。

前導鏈是連續(xù)合成的，隨從鏈在連接酶作用下連成一條鏈。

拓撲酶DNA復制后DNA超螺旋裝配成染色體2、真核生物DNApol特性與大腸桿菌相似，共五種：pol：催化前導鏈及隨從連的合成，需增殖細胞核抗原蛋白PCNA（proliferatatingcellnucleusantigen-PCNA）的參與。Pol:與引發(fā)酶配合，參與隨從鏈的合成。97二、

逆轉錄作用1、概念2、逆轉錄酶3、逆轉