DNA的復(fù)制與重組課程課件

DNA的復(fù)制與重組DNA一，DNA的復(fù)制一，DNA的復(fù)制*WastonandCrick,1953*WastonandCrick,1953

現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的一個最基本的觀點——

在生命有機體中，基因是唯一能夠復(fù)制，并且能永遠存在的單位，而其意義最終須通過蛋白質(zhì)才體現(xiàn)出來。

從DNA到蛋白質(zhì)，遺傳信息的流動遵循著中心法則。1中心法則現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的一個最基本的觀點——在2DNA的半保留復(fù)制半保留復(fù)制（semiconservativereplication）即新的雙鏈DNA中，一股鏈來自模板，一股鏈為新合成的。半保留復(fù)制的意義復(fù)制的這種方式可保證親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，體現(xiàn)了遺傳的保守性。2DNA的半保留復(fù)制半保留復(fù)制（semiconser

半保留復(fù)制實驗依據(jù)

1958年M.Messelson等用實驗予以了證實

雙螺旋結(jié)構(gòu)是半保留復(fù)制的分子基礎(chǔ)

半保留復(fù)制實驗依據(jù)3DNA的半不連續(xù)復(fù)制前導(dǎo)鏈（leadingstrain）:為連續(xù)合成，合成方向與解鏈方向一致，它的模板DNA鏈是5’～3’鏈。隨從鏈（laggingstrain）：不連續(xù)合成，在RNA引物基礎(chǔ)上分段合成DNA小片段（岡崎片段），方向與解鏈方向相反，它的模板DNA是3’～5’鏈。3DNA的半不連續(xù)復(fù)制前導(dǎo)鏈（leadingstra（以原核生物大腸桿菌為例）1.原料：dNTP，Mg++2.雙鏈DNA模板3.引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游離的3’OH。4.引物酶（primase，DnaG），用于合成復(fù)制所必需的RNA引物5.解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC協(xié)助在復(fù)制的起始點（OriC）上解開雙螺旋。4DNA的復(fù)制過程4.1與復(fù)制有關(guān)的酶和因子（以原核生物大腸桿菌為例）4DNA的復(fù)制過程4.1與單鏈結(jié)合蛋白（SSB，singlestrandedbindingprotein）穩(wěn)定已經(jīng)解開成兩股的DNA單鏈，防止其退火復(fù)性。7.拓撲異構(gòu)酶(DNAtopoisomerase)DNA分子中存在打結(jié)，纏繞、連環(huán)的超螺旋現(xiàn)象。

I型酶：切開雙鏈中的一股，使DNA不致打結(jié)，切口的3’端可通過自由轉(zhuǎn)動一周再與5’端磷酸連接，不需ATP。

II型酶：切斷處于超螺旋狀態(tài)中雙股鏈中的某個部位，通過切口使超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢復(fù)復(fù)制所要求的負超螺旋狀態(tài)。

(注:拓撲一詞的含義是指物體或圖象作彈性移位而又保持物體不變的性質(zhì)。)DNA的復(fù)制與重組課程課件8.DNA聚合酶（DNApolymerase）聚合酶III——主要的復(fù)制酶，兼有校讀、糾錯的功能

有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性，有模板依賴性，其延伸的方式是依據(jù)堿基互補配對的原則，將原料dNTP與末端核苷酸游離的3’OH以3’,5’磷酸二酯鍵連接，同時釋出一個PPi。DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈的方向總是5’3’

有從3’——5’外切酶的活性，以切除可能錯配的核苷酸8.DNA聚合酶（DNApolymerase）聚合聚合酶I用于切除引物RNA,并填補留下的空隙

有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶的活性；有從3’——5’外切酶的活性，以切除可能錯配的核苷酸；有從5’——3’外切酶的活性，其作用是切除引物聚合酶II活性弱,作用與聚合酶III相似

有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性；有從3’——5’外切酶的活性聚合酶I用于切除引物RNA,并填補留下的空隙

真核的DNA聚合酶

真核DNA的復(fù)制至少涉及5種復(fù)制酶α、β、γ、δ和ε，其中α、δ、ε參與染色體DNA的復(fù)制。

α有引物要求；

β負責(zé)DNA的修復(fù)；

γ的功能是線粒體DNA的復(fù)制。真核的DNA聚合酶9.DNA連接酶（ligase）

將不連續(xù)的DNA片段以3’，5’磷酸二酯鍵連接起來，原核生物通過分解NAD為NMN和Pi提供能量，真核生物則消耗ATP9.DNA連接酶（ligase）將不連續(xù)的DNA片段以5原核生物DNA的復(fù)制5原核生物DNA的復(fù)制In1963,JohnCairns’

Technique:GrewE.coliin3HthymidineWaitedtillcellswereinthemiddleofreplicationLysedthecellsveryverygentlySpreadthelysateonanEMgridExposedthegridtoX-rayfilmforTWOmonths.ReplicationoftheE.colichromosomeIn1963,JohnCairns’TechniquWhatCairns’experiment(1963)showed:E.colihasacircularchromosome.E.colihasasingleoriginofreplication.InE.coli,replicationandunwindingaresimultaneous.WhatCairns’experiment(1963)大腸桿菌(E.coli)的OriC

復(fù)制原點大腸桿菌基因組的復(fù)制原點位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操縱子之間，全長245bp,稱為oriC。大腸桿菌(E.coli)的OriC復(fù)制原點大腸桿菌基因復(fù)制的起始復(fù)制的起始大腸桿菌DNA復(fù)制的步驟大腸桿菌DNA復(fù)制的步驟復(fù)制的延伸復(fù)制的延伸復(fù)制的終止復(fù)制的終止6真核生物DNA的復(fù)制6真核生物DNA的復(fù)制真核生物DNA的復(fù)制特點有多處復(fù)制起始點；在全部完成復(fù)制之前，各個起始點上DNA的復(fù)制不能再開始；DNA復(fù)制只在S期進行。復(fù)制子相對較小，為40-100千堿基對。真核生物DNA的復(fù)制特點有多處復(fù)制起始點；真核生物DNA的復(fù)制子被稱為ARS(autonomouslyreplicatingsequences)，長約150bp左右，包括數(shù)個復(fù)制起始必需的保守區(qū)。真核生物DNA復(fù)制的起始需要起始點識別復(fù)合物（originrecognitioncomplex，ORC）參與，ORC結(jié)合于ARS，它是由6種蛋白質(zhì)組成的啟動復(fù)合物。真核生物DNA的復(fù)制子被稱為ARS(autonomousl真核生物DNA復(fù)制叉的移動速度大約只有50bp/秒。因此，人類DNA中每隔30,000-300,000bp就有一個復(fù)制起始位點。真核生物DNA復(fù)制叉的移動速度大約只有50bp/秒。已發(fā)現(xiàn)的真核生物DNA聚合酶有15種以上。在哺乳動物細胞中主要有5種DNA聚合酶，分別稱為DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε。已發(fā)現(xiàn)的真核生物DNA聚合酶有15種以上。真核生物DNA聚合酶的特性比較性質(zhì)DNA聚合酶αDNA聚合酶βDNA聚合酶γDNA聚合酶δDNA聚合酶ε亞基數(shù)4122-3≥1在細胞內(nèi)分布核內(nèi)核內(nèi)線粒體核內(nèi)核內(nèi)(?)功能DNA引物合成損傷修復(fù)線粒體DNA復(fù)制主要DNA復(fù)制酶DNA復(fù)制(?)3'→5'外切無無有有有5'→3'外切無無無無無

真核生物DNA聚合酶的特性比較性質(zhì)DNADNADNADNADDNA聚合酶α主要參與引物合成。DNA聚合酶β活性水平穩(wěn)定，主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。DNA聚合酶δ主要負責(zé)DNA的復(fù)制。DNA聚合酶ε與后隨鏈合成有關(guān)，在DNA合成過程中核苷切除以及堿基的切除修復(fù)中起著重要的作用。DNA聚合酶在線粒體DNA的復(fù)制中發(fā)揮作用。DNA聚合酶α主要參與引物合成。DNA聚合酶β活性水平穩(wěn)定，DNA的復(fù)制與重組課程課件DNA的復(fù)制與重組課程課件DNA的復(fù)制與重組課程課件DNA的復(fù)制與重組課程課件RF-Cisafive-subunitcomplexAllsubunitsarerelatedinsequenceandhaveATPbindingmotifsATPhydrolysisbyRF-CisassociatedwiththeloadingofPCNARF-Cisthefunctionalhomologoftheclamp-loadergcomplexRF-Cisafive-subunitcomplexDNA的復(fù)制與重組課程課件Polymeraseswitchingoccursevenonlaggingstrands;polddoesmostofDNAsynthesisPolymeraseswitchingoccursevDNA的復(fù)制與重組課程課件DNA的復(fù)制與重組課程課件二，DNA的重組二，DNA的重組第一節(jié)概述一、DNA重組（recombination）1、概念：DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合，稱為遺傳重組（geneticrecombination）,或者基因重排(generearrangement)。2、意義：重組是遺傳學(xué)的靈魂，沒有重組就沒有生物的進化；沒有重組也就沒有現(xiàn)代的分子克隆技術(shù)第一節(jié)概述一、DNA重組（recombination）二、DNA重組的類型1、同源重組（HomologousRecombination）2、位點特異性重組（Site-specificRecombination）3、DNA的轉(zhuǎn)座（transposition）二、DNA重組的類型第二節(jié)

同源重組

一、概述1、定義：兩個DNA分子同源序列之間進行的重組2、條件：（1）兩個DNA分子有同源序列（相關(guān)的酶可以用任何一對同源序列為底物）（2）兩個DNA分子必須緊密接觸

3、發(fā)生：真核生物:非姐妹染色單體交換相對應(yīng)的區(qū)域。原核生物:依賴recA蛋白，并形成Holliday結(jié)構(gòu)

Holiday模型（1964年）第二節(jié)同源重組一、概述二、大腸桿菌同源重組的分子基礎(chǔ)（一）RecA

1、作用：可促進單鏈同化或單鏈吸收

RecA具有使DNA單鏈置換雙鏈中同源鏈的能力二、大腸桿菌同源重組的分子基礎(chǔ)

特異地識別單鏈DNA，并能將之與同源DNA中的互補順序“退火”，同時將另一條鏈排擠出去（取代），形成雜種分子

2、單鏈同化發(fā)生的三個條件（1）其中一個DNA必須存在單鏈區(qū)（2）其中一個DNA必須有一個自由3’末端（3）此單鏈區(qū)和3’末端必須位于兩分子之間互補的區(qū)域內(nèi)特異地識別單鏈DNA，并能將之與同源DNA中的互補（二）RecBCD復(fù)合體

1、酶的活性：

（1）核酸外切酶

（2）核酸內(nèi)切酶

（3）解旋酶2、作用：

在Chi位點處產(chǎn)生含3ˊ游離未端單鏈.（二）RecBCD復(fù)合體（三）Chi位點---RecBCD識別的靶位點

5'GCTGGTGG3'3'CGACCACC5'

是重組頻率較高的部位

E.coli中每隔約5~10kb有一個拷貝，

DNA的復(fù)制與重組課程課件斷裂和重連產(chǎn)生異源雙鏈DNA1.同源序列排列在一起；2.酶切。通過核酸酶和RecBCD蛋白復(fù)合體的作用在一對同源DNA上產(chǎn)生切口；3.入侵。含有3’端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA細絲；RecA-ssDNA細絲尋找相對的DNA雙螺旋上的相應(yīng)序列。三、Holiday重組模型斷裂和重連產(chǎn)生異源雙鏈DNA三、Holiday重組模型4.游離端交叉連接，形成Holliday

結(jié)構(gòu)5.通過分支遷移產(chǎn)生異源雙鏈DNA。十字形結(jié)構(gòu)4.游離端交叉連接，形成Holliday結(jié)構(gòu)十字形結(jié)構(gòu)6.空間重排。十字型兩臂旋轉(zhuǎn)180度7.解離(兩種不同方式)8.修補連接6.空間重排。十字型兩臂旋轉(zhuǎn)180度附：基因敲除(Geneknockout)是80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)是指對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計實驗，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測相應(yīng)基因的功能。

基因敲除的技術(shù)路線如下：

（1）構(gòu)建重組基因載體﹔

（2）用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞核內(nèi),基因敲除的靶細胞目前最常用的是小鼠ES細胞（3）用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細胞﹔

（4）轉(zhuǎn)入假孕母鼠使其生長成為轉(zhuǎn)基因動物，對轉(zhuǎn)基因動物進行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測。附：基因敲除(Geneknockout)是80年代后半期四細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組3種形式：1）轉(zhuǎn)化2）轉(zhuǎn)導(dǎo)3）接合

四細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組3種形式：1）轉(zhuǎn)化1轉(zhuǎn)化（transformation）定義：細菌品系由于吸收了外源DNA（轉(zhuǎn)化因子）而發(fā)生遺傳性狀的改變現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化子（transformant）：經(jīng)轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了供體性狀的受體細胞稱為轉(zhuǎn)化子，即轉(zhuǎn)化成功的菌落。

目前已知有二十多個種的G+和G-細菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力此過程可以發(fā)生在土壤和海洋環(huán)境中，可能是自然界遺傳交換的重要方式。1轉(zhuǎn)化（transformation）定義：細菌品系由于（1）轉(zhuǎn)化因子

本質(zhì)是離體的DNA片斷或質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)化因子進入細胞前還會被酶解成更小的片段，約8kb。在不同的微生物中，轉(zhuǎn)化因子的形式不同，dsDNA,ssDNA.但不管何種情況，最易與細胞表面結(jié)合的仍是dsDNA。由于每個細胞表面能與轉(zhuǎn)化因子相結(jié)合的位點有限（如肺炎鏈球菌約10個），因此，從外界加入無關(guān)的dsDNA就可競爭并干擾轉(zhuǎn)化作用。質(zhì)粒DNA也是良好的轉(zhuǎn)化因子，但它們通常并不能與核染色體組發(fā)生重組。

轉(zhuǎn)化的頻率通常為0.1％～1％，最高為20％。（1）轉(zhuǎn)化因子（2）人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細胞，PEG介導(dǎo)、電穿孔、基因槍法等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段（使細胞膜更易于透過DNA）。在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項細菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。用多種不同的技術(shù)處理受體細胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高（不像線型DNA那樣易于降解，而且還能在宿主中復(fù)制。任何來源的DNA將其連接到質(zhì)粒上都能進入受體細胞）.（2）人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細胞，PEG介導(dǎo)、電穿孔、基因定義：噬菌體DNA被感受態(tài)細胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒。（3）轉(zhuǎn)染(transfection)：現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動物細胞的過程也稱轉(zhuǎn)染提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進入微生物細胞并表達后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。特點：定義：噬菌體DNA被感受態(tài)細胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒。（2轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）轉(zhuǎn)導(dǎo)：利用完全或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細胞的小片段DNA攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。

由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得供體細胞部分遺傳性狀的重組受體細胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）

攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA片段）的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。細菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)2轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）轉(zhuǎn)導(dǎo)：利用完全或部分缺（1）、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對供體菌基因組上任何小片段DNA進行誤包，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。（1）、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduc轉(zhuǎn)導(dǎo)模型轉(zhuǎn)導(dǎo)模型（2）.局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（restrictedtransduction）

定義：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。

媒介：

部分缺陷噬菌體（丟失自身一部分基因，并被同等長度的宿主基因所取代）

只能轉(zhuǎn)導(dǎo)個別特定基因

（2）.局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（restrictedtransduct大腸桿菌中λ噬菌體的正常裂解及半乳糖基因轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成過程大腸桿菌中λ噬菌體的正常裂解及半乳糖基因轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成過程3、

接合(conjugation)通過細胞與細胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程（1）.接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Tatum細菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實驗3、接合(conjugation)通過細胞與細胞的直接接中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！為了減少所培養(yǎng)的結(jié)果是回復(fù)突變的機會，采用了雙重或三重營養(yǎng)缺陷型。該實驗是建立在不大可能同時發(fā)生兩種或三種回復(fù)突變的設(shè)想上的。中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落為了減少所培養(yǎng)的結(jié)果是回復(fù)證實接合過程需要細胞間的直接接觸的“U”型管實驗（BernardDavis，1950）證實接合過程需要細胞間的直接接觸的大腸桿菌的接合型與接合F＋菌株大腸桿菌的接合型與接合F＋菌株第三節(jié)位點特異性重組一、定義：不依賴于DNA順序的同源性，而依賴于能與某些酶相結(jié)合的特異的DNA序列的存在。

二、噬菌體λ對E.coliDNA的整合

（一）λDNA存在兩種形式裂解狀態(tài)溶源狀態(tài)（二）通過位點特異性重組實現(xiàn)兩種類型間的轉(zhuǎn)換

λDNA整合到宿主DNA進入溶源狀態(tài)

λDNA從宿主DNA中切離進入裂解狀態(tài)第三節(jié)位點特異性重組一、定義：（三）催化重組的酶

1、整合酶Int(integrase)：有拓撲異構(gòu)酶活性

2、整合宿主因子（IHF，integrationhostfactor）

3、切除酶（excisionase）/終止重組（四）重組位點：附著位點（attachmentsite）

attP（POP’）和attB（BOB’）有15bp核心序列配對（五）重組過程：

1、整合：POP’+BOB’→BOP’—POB2、切離：BOP’—POB’→POP’+BOB’（三）催化重組的酶attPattBattPattBDNA的復(fù)制與重組課程課件attPattBattPattB第四節(jié)DNA的轉(zhuǎn)座一、轉(zhuǎn)座子（transposon）的定義：

存在于染色體DNA上可自主轉(zhuǎn)移座位的基本單位

二、轉(zhuǎn)座子發(fā)現(xiàn)：

McClintockB：1938年，提出轉(zhuǎn)座基因概念

1983年，獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎

J.Shapiro等：1980年，證實了可移位的遺傳基因存在

第四節(jié)DNA的轉(zhuǎn)座一、轉(zhuǎn)座子（transposon）三、轉(zhuǎn)座子的類型1、IS（插入序列,insertionsequences）特點（1）比較小，0.75~1.5kb;

（2）只有轉(zhuǎn)座酶基因（3）兩端有反向重復(fù)序列;

IR（invertedrepeat）ISTransposaseIR三、轉(zhuǎn)座子的類型1、IS（插入序列,insertion

插入序列的基本結(jié)構(gòu)特點

a、自身攜帶有轉(zhuǎn)座酶基因

b、末端有反向重復(fù)序列（IR）

c、轉(zhuǎn)座后兩端有正向重復(fù)序列（DR）ATGCA12345678TACGT1234567887654321ATGCA87654321TACGT轉(zhuǎn)座酶基因插入序列（insertionsequences，IS）插入序列的基本結(jié)構(gòu)特點ATGCA12345678872、Tn（復(fù)合轉(zhuǎn)座子,compositetransposons）特點：（1）2-10kb;;（2）兩端有兩個相同或高度同源IS序列（3）含轉(zhuǎn)座酶基因/抗生素基因TransposonmakersTnISIS2、Tn（復(fù)合轉(zhuǎn)座子,compositetranspo3、TnA（TnAfamily）特點：（1）5~25kb;（2）兩端IR（30~40bp）相似或相同；兩端無IS組件;（3）轉(zhuǎn)座酶基因/解離酶基因/抗生素基因

TnATransposaseResolvaseAmprIRIR3、TnA（TnAfamily）TnATransposa

四，跟據(jù)轉(zhuǎn)座子的移動機制，可分為：◆復(fù)制型轉(zhuǎn)座（replicativetransposition）◆非復(fù)制型轉(zhuǎn)座（nonreplicativetransposition）四，跟據(jù)轉(zhuǎn)座子的移動機制，可分為：五

轉(zhuǎn)座引起的遺傳學(xué)效應(yīng)（1）引起插入突變（2）產(chǎn)生新的基因（3）引起染色體畸變（4）引起生物進化五轉(zhuǎn)座引起的遺傳學(xué)效應(yīng)（1）引起插入突變ReplicativetranspositionReplicativetranspositionNonreplicativetranspositionNonreplicativetranspositionDNA的復(fù)制與重組課程課件演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！DNA的復(fù)制與重組DNA一，DNA的復(fù)制一，DNA的復(fù)制*WastonandCrick,1953*WastonandCrick,1953

現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的一個最基本的觀點——

在生命有機體中，基因是唯一能夠復(fù)制，并且能永遠存在的單位，而其意義最終須通過蛋白質(zhì)才體現(xiàn)出來。

從DNA到蛋白質(zhì)，遺傳信息的流動遵循著中心法則。1中心法則現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)的一個最基本的觀點——在2DNA的半保留復(fù)制半保留復(fù)制（semiconservativereplication）即新的雙鏈DNA中，一股鏈來自模板，一股鏈為新合成的。半保留復(fù)制的意義復(fù)制的這種方式可保證親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，體現(xiàn)了遺傳的保守性。2DNA的半保留復(fù)制半保留復(fù)制（semiconser

半保留復(fù)制實驗依據(jù)

1958年M.Messelson等用實驗予以了證實

雙螺旋結(jié)構(gòu)是半保留復(fù)制的分子基礎(chǔ)

半保留復(fù)制實驗依據(jù)3DNA的半不連續(xù)復(fù)制前導(dǎo)鏈（leadingstrain）:為連續(xù)合成，合成方向與解鏈方向一致，它的模板DNA鏈是5’～3’鏈。隨從鏈（laggingstrain）：不連續(xù)合成，在RNA引物基礎(chǔ)上分段合成DNA小片段（岡崎片段），方向與解鏈方向相反，它的模板DNA是3’～5’鏈。3DNA的半不連續(xù)復(fù)制前導(dǎo)鏈（leadingstra（以原核生物大腸桿菌為例）1.原料：dNTP，Mg++2.雙鏈DNA模板3.引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游離的3’OH。4.引物酶（primase，DnaG），用于合成復(fù)制所必需的RNA引物5.解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC協(xié)助在復(fù)制的起始點（OriC）上解開雙螺旋。4DNA的復(fù)制過程4.1與復(fù)制有關(guān)的酶和因子（以原核生物大腸桿菌為例）4DNA的復(fù)制過程4.1與單鏈結(jié)合蛋白（SSB，singlestrandedbindingprotein）穩(wěn)定已經(jīng)解開成兩股的DNA單鏈，防止其退火復(fù)性。7.拓撲異構(gòu)酶(DNAtopoisomerase)DNA分子中存在打結(jié)，纏繞、連環(huán)的超螺旋現(xiàn)象。

I型酶：切開雙鏈中的一股，使DNA不致打結(jié)，切口的3’端可通過自由轉(zhuǎn)動一周再與5’端磷酸連接，不需ATP。

II型酶：切斷處于超螺旋狀態(tài)中雙股鏈中的某個部位，通過切口使超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢復(fù)復(fù)制所要求的負超螺旋狀態(tài)。

(注:拓撲一詞的含義是指物體或圖象作彈性移位而又保持物體不變的性質(zhì)。)DNA的復(fù)制與重組課程課件8.DNA聚合酶（DNApolymerase）聚合酶III——主要的復(fù)制酶，兼有校讀、糾錯的功能

有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性，有模板依賴性，其延伸的方式是依據(jù)堿基互補配對的原則，將原料dNTP與末端核苷酸游離的3’OH以3’,5’磷酸二酯鍵連接，同時釋出一個PPi。DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈的方向總是5’3’

有從3’——5’外切酶的活性，以切除可能錯配的核苷酸8.DNA聚合酶（DNApolymerase）聚合聚合酶I用于切除引物RNA,并填補留下的空隙

有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶的活性；有從3’——5’外切酶的活性，以切除可能錯配的核苷酸；有從5’——3’外切酶的活性，其作用是切除引物聚合酶II活性弱,作用與聚合酶III相似

有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性；有從3’——5’外切酶的活性聚合酶I用于切除引物RNA,并填補留下的空隙

真核的DNA聚合酶

真核DNA的復(fù)制至少涉及5種復(fù)制酶α、β、γ、δ和ε，其中α、δ、ε參與染色體DNA的復(fù)制。

α有引物要求；

β負責(zé)DNA的修復(fù)；

γ的功能是線粒體DNA的復(fù)制。真核的DNA聚合酶9.DNA連接酶（ligase）

將不連續(xù)的DNA片段以3’，5’磷酸二酯鍵連接起來，原核生物通過分解NAD為NMN和Pi提供能量，真核生物則消耗ATP9.DNA連接酶（ligase）將不連續(xù)的DNA片段以5原核生物DNA的復(fù)制5原核生物DNA的復(fù)制In1963,JohnCairns’

Technique:GrewE.coliin3HthymidineWaitedtillcellswereinthemiddleofreplicationLysedthecellsveryverygentlySpreadthelysateonanEMgridExposedthegridtoX-rayfilmforTWOmonths.ReplicationoftheE.colichromosomeIn1963,JohnCairns’TechniquWhatCairns’experiment(1963)showed:E.colihasacircularchromosome.E.colihasasingleoriginofreplication.InE.coli,replicationandunwindingaresimultaneous.WhatCairns’experiment(1963)大腸桿菌(E.coli)的OriC

復(fù)制原點大腸桿菌基因組的復(fù)制原點位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操縱子之間，全長245bp,稱為oriC。大腸桿菌(E.coli)的OriC復(fù)制原點大腸桿菌基因復(fù)制的起始復(fù)制的起始大腸桿菌DNA復(fù)制的步驟大腸桿菌DNA復(fù)制的步驟復(fù)制的延伸復(fù)制的延伸復(fù)制的終止復(fù)制的終止6真核生物DNA的復(fù)制6真核生物DNA的復(fù)制真核生物DNA的復(fù)制特點有多處復(fù)制起始點；在全部完成復(fù)制之前，各個起始點上DNA的復(fù)制不能再開始；DNA復(fù)制只在S期進行。復(fù)制子相對較小，為40-100千堿基對。真核生物DNA的復(fù)制特點有多處復(fù)制起始點；真核生物DNA的復(fù)制子被稱為ARS(autonomouslyreplicatingsequences)，長約150bp左右，包括數(shù)個復(fù)制起始必需的保守區(qū)。真核生物DNA復(fù)制的起始需要起始點識別復(fù)合物（originrecognitioncomplex，ORC）參與，ORC結(jié)合于ARS，它是由6種蛋白質(zhì)組成的啟動復(fù)合物。真核生物DNA的復(fù)制子被稱為ARS(autonomousl真核生物DNA復(fù)制叉的移動速度大約只有50bp/秒。因此，人類DNA中每隔30,000-300,000bp就有一個復(fù)制起始位點。真核生物DNA復(fù)制叉的移動速度大約只有50bp/秒。已發(fā)現(xiàn)的真核生物DNA聚合酶有15種以上。在哺乳動物細胞中主要有5種DNA聚合酶，分別稱為DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε。已發(fā)現(xiàn)的真核生物DNA聚合酶有15種以上。真核生物DNA聚合酶的特性比較性質(zhì)DNA聚合酶αDNA聚合酶βDNA聚合酶γDNA聚合酶δDNA聚合酶ε亞基數(shù)4122-3≥1在細胞內(nèi)分布核內(nèi)核內(nèi)線粒體核內(nèi)核內(nèi)(?)功能DNA引物合成損傷修復(fù)線粒體DNA復(fù)制主要DNA復(fù)制酶DNA復(fù)制(?)3'→5'外切無無有有有5'→3'外切無無無無無

真核生物DNA聚合酶的特性比較性質(zhì)DNADNADNADNADDNA聚合酶α主要參與引物合成。DNA聚合酶β活性水平穩(wěn)定，主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。DNA聚合酶δ主要負責(zé)DNA的復(fù)制。DNA聚合酶ε與后隨鏈合成有關(guān)，在DNA合成過程中核苷切除以及堿基的切除修復(fù)中起著重要的作用。DNA聚合酶在線粒體DNA的復(fù)制中發(fā)揮作用。DNA聚合酶α主要參與引物合成。DNA聚合酶β活性水平穩(wěn)定，DNA的復(fù)制與重組課程課件DNA的復(fù)制與重組課程課件DNA的復(fù)制與重組課程課件DNA的復(fù)制與重組課程課件RF-Cisafive-subunitcomplexAllsubunitsarerelatedinsequenceandhaveATPbindingmotifsATPhydrolysisbyRF-CisassociatedwiththeloadingofPCNARF-Cisthefunctionalhomologoftheclamp-loadergcomplexRF-Cisafive-subunitcomplexDNA的復(fù)制與重組課程課件Polymeraseswitchingoccursevenonlaggingstrands;polddoesmostofDNAsynthesisPolymeraseswitchingoccursevDNA的復(fù)制與重組課程課件DNA的復(fù)制與重組課程課件二，DNA的重組二，DNA的重組第一節(jié)概述一、DNA重組（recombination）1、概念：DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合，稱為遺傳重組（geneticrecombination）,或者基因重排(generearrangement)。2、意義：重組是遺傳學(xué)的靈魂，沒有重組就沒有生物的進化；沒有重組也就沒有現(xiàn)代的分子克隆技術(shù)第一節(jié)概述一、DNA重組（recombination）二、DNA重組的類型1、同源重組（HomologousRecombination）2、位點特異性重組（Site-specificRecombination）3、DNA的轉(zhuǎn)座（transposition）二、DNA重組的類型第二節(jié)

同源重組

一、概述1、定義：兩個DNA分子同源序列之間進行的重組2、條件：（1）兩個DNA分子有同源序列（相關(guān)的酶可以用任何一對同源序列為底物）（2）兩個DNA分子必須緊密接觸

3、發(fā)生：真核生物:非姐妹染色單體交換相對應(yīng)的區(qū)域。原核生物:依賴recA蛋白，并形成Holliday結(jié)構(gòu)

Holiday模型（1964年）第二節(jié)同源重組一、概述二、大腸桿菌同源重組的分子基礎(chǔ)（一）RecA

1、作用：可促進單鏈同化或單鏈吸收

RecA具有使DNA單鏈置換雙鏈中同源鏈的能力二、大腸桿菌同源重組的分子基礎(chǔ)

特異地識別單鏈DNA，并能將之與同源DNA中的互補順序“退火”，同時將另一條鏈排擠出去（取代），形成雜種分子

2、單鏈同化發(fā)生的三個條件（1）其中一個DNA必須存在單鏈區(qū)（2）其中一個DNA必須有一個自由3’末端（3）此單鏈區(qū)和3’末端必須位于兩分子之間互補的區(qū)域內(nèi)特異地識別單鏈DNA，并能將之與同源DNA中的互補（二）RecBCD復(fù)合體

1、酶的活性：

（1）核酸外切酶

（2）核酸內(nèi)切酶

（3）解旋酶2、作用：

在Chi位點處產(chǎn)生含3ˊ游離未端單鏈.（二）RecBCD復(fù)合體（三）Chi位點---RecBCD識別的靶位點

5'GCTGGTGG3'3'CGACCACC5'

是重組頻率較高的部位

E.coli中每隔約5~10kb有一個拷貝，

DNA的復(fù)制與重組課程課件斷裂和重連產(chǎn)生異源雙鏈DNA1.同源序列排列在一起；2.酶切。通過核酸酶和RecBCD蛋白復(fù)合體的作用在一對同源DNA上產(chǎn)生切口；3.入侵。含有3’端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA細絲；RecA-ssDNA細絲尋找相對的DNA雙螺旋上的相應(yīng)序列。三、Holiday重組模型斷裂和重連產(chǎn)生異源雙鏈DNA三、Holiday重組模型4.游離端交叉連接，形成Holliday

結(jié)構(gòu)5.通過分支遷移產(chǎn)生異源雙鏈DNA。十字形結(jié)構(gòu)4.游離端交叉連接，形成Holliday結(jié)構(gòu)十字形結(jié)構(gòu)6.空間重排。十字型兩臂旋轉(zhuǎn)180度7.解離(兩種不同方式)8.修補連接6.空間重排。十字型兩臂旋轉(zhuǎn)180度附：基因敲除(Geneknockout)是80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)是指對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計實驗，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測相應(yīng)基因的功能。

基因敲除的技術(shù)路線如下：

（1）構(gòu)建重組基因載體﹔

（2）用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞核內(nèi),基因敲除的靶細胞目前最常用的是小鼠ES細胞（3）用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細胞﹔

（4）轉(zhuǎn)入假孕母鼠使其生長成為轉(zhuǎn)基因動物，對轉(zhuǎn)基因動物進行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測。附：基因敲除(Geneknockout)是80年代后半期四細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組3種形式：1）轉(zhuǎn)化2）轉(zhuǎn)導(dǎo)3）接合

四細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組3種形式：1）轉(zhuǎn)化1轉(zhuǎn)化（transformation）定義：細菌品系由于吸收了外源DNA（轉(zhuǎn)化因子）而發(fā)生遺傳性狀的改變現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化子（transformant）：經(jīng)轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了供體性狀的受體細胞稱為轉(zhuǎn)化子，即轉(zhuǎn)化成功的菌落。

目前已知有二十多個種的G+和G-細菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力此過程可以發(fā)生在土壤和海洋環(huán)境中，可能是自然界遺傳交換的重要方式。1轉(zhuǎn)化（transformation）定義：細菌品系由于（1）轉(zhuǎn)化因子

本質(zhì)是離體的DNA片斷或質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)化因子進入細胞前還會被酶解成更小的片段，約8kb。在不同的微生物中，轉(zhuǎn)化因子的形式不同，dsDNA,ssDNA.但不管何種情況，最易與細胞表面結(jié)合的仍是dsDNA。由于每個細胞表面能與轉(zhuǎn)化因子相結(jié)合的位點有限（如肺炎鏈球菌約10個），因此，從外界加入無關(guān)的dsDNA就可競爭并干擾轉(zhuǎn)化作用。質(zhì)粒DNA也是良好的轉(zhuǎn)化因子，但它們通常并不能與核染色體組發(fā)生重組。

轉(zhuǎn)化的頻率通常為0.1％～1％，最高為20％。（1）轉(zhuǎn)化因子（2）人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細胞，PEG介導(dǎo)、電穿孔、基因槍法等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段（使細胞膜更易于透過DNA）。在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項細菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。用多種不同的技術(shù)處理受體細胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高（不像線型DNA那樣易于降解，而且還能在宿主中復(fù)制。任何來源的DNA將其連接到質(zhì)粒上都能進入受體細胞）.（2）人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細胞，PEG介導(dǎo)、電穿孔、基因定義：噬菌體DNA被感受態(tài)細胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒。（3）轉(zhuǎn)染(transfection)：現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動物細胞的過程也稱轉(zhuǎn)染提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進入微生物細胞并表達后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。特點：定義：噬菌體DNA被感受態(tài)細胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒。（2轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）轉(zhuǎn)導(dǎo)：利用完全或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細胞的小片段DNA攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。

由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得供體細胞部分遺傳性狀的重組受體細胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）

攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA片段）的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。細菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)2轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）轉(zhuǎn)導(dǎo)：利用完全或部分缺（1）、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對供體菌基因組上任何小片段DNA進行誤包，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。（1）、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduc轉(zhuǎn)導(dǎo)模型轉(zhuǎn)導(dǎo)模型（2）.局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（restrictedtransduction）

定義：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。

媒介：

部分缺陷噬菌體（丟失自身一部分基因，并被同等長度的宿主基因所取代）

只能轉(zhuǎn)導(dǎo)個別特定基因

（2）.局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（restrictedtransduct大腸桿菌中λ噬菌體的正常裂解及半乳糖基因轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成過程大腸桿菌中λ噬菌體的正常裂解及半乳糖基因轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成過程3、

接合(conjugation)通過細胞與細胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程（1）.接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Tatum細菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實驗3、接合(conjugation)通過細胞與細胞的直接接中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！為了減少所培養(yǎng)的結(jié)果是回復(fù)突變的機會，采用了雙重或三重營養(yǎng)缺陷型。該實驗是建立在不大可能同時發(fā)生兩種或三種回復(fù)突變的設(shè)想上的。中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落為了減少所培養(yǎng)的結(jié)果是回復(fù)證實接合過程需要細胞間的直接接觸的“U”型管實驗（BernardDavis，1950）證實接合過程需要細胞間的直接接觸的大腸桿菌的接合型與接合F＋