沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)

沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)食品學(xué)院14食品質(zhì)量與安全1班劉文敏柳基煒衛(wèi)杰恒 溫紫君201430520115201430520116201430520121201430520122摘要：本實(shí)驗(yàn)采用GB/T4789.4-2010的檢測(cè)方法測(cè)定雞場(chǎng)中的沙門(mén)氏菌。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法和技術(shù)，了解沙門(mén)氏菌的一些生化特性；本實(shí)驗(yàn)先用顯色培養(yǎng)基找出可疑菌落，再做生化試驗(yàn)找出可疑的典型性的沙門(mén)氏菌，再通過(guò)血清學(xué)試驗(yàn)最終確定是否為沙門(mén)氏菌屬。關(guān)鍵詞：沙門(mén)氏菌接種生化試驗(yàn)血清學(xué)鑒定前言沙門(mén)氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)中具有重要意義的人畜共患病種之一，其病原沙門(mén)氏菌屬于腸道細(xì)菌科。沙門(mén)氏菌是一個(gè)統(tǒng)稱，泛指2000多種有緊密連系的細(xì)菌，包括引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌。雖然只有少數(shù)人因沙門(mén)氏菌而患病，但是，在世界范圍內(nèi)的細(xì)菌性食物中毒事件中，由沙門(mén)氏菌引起的占大多數(shù)。因此，采用科學(xué)、合理的方法檢驗(yàn)食品中沙門(mén)氏菌，已經(jīng)成為了人們最關(guān)心的問(wèn)題之一⑴。國(guó)標(biāo)法384789.4-2010）是目前中國(guó)規(guī)定的食品中沙門(mén)氏菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，也是基層實(shí)驗(yàn)室普遍采用的檢測(cè)方法，它根據(jù)沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)和生化特性，采取前增菌、增菌、分離、生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定5個(gè)步驟進(jìn)行⑵。1材料與方法實(shí)驗(yàn)材料儀器設(shè)備均質(zhì)器、三角燒瓶、平皿、玻璃棒、接種棒恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃，42℃±1℃吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸頭電子天平PL602-S,梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋SYQ-DSX-280B,上海申安醫(yī)療器械廠試劑藥品雞腸、靛基質(zhì)試劑、沙門(mén)氏菌O和H診斷血清、API20E生化試劑盒或VITEKGNI生化鑒定卡培養(yǎng)基蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、HE瓊脂、三糖鐵瓊脂、蛋白胨水、尿素瓊脂、氰化鉀、氰化鉀對(duì)照、賴氨酸脫竣酶、賴氨酸脫竣酶對(duì)照、甘露醇、山梨醇、B-D半乳糖背（ONPG）培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的配制步驟蛋白胨水（BPW）：稱取蛋白胨10g、氯化鈉5g、磷酸氫二鈉9g、磷酸二氫鈉1.5g、蒸餾水1000ml,將各成分加入蒸餾水中，攪混均勻，靜置約10min,煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH,高壓滅菌121℃,15min。分裝10瓶，每瓶90ml四硫磺酸鈉煌綠（TTB）：高壓滅菌121℃,15min滅菌冷卻后至30℃,每100ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液加碘液2ml,煌綠液1ml配制培養(yǎng)基的注意事項(xiàng)（1）按照說(shuō)明書(shū)上的用量進(jìn)行換算，稱取準(zhǔn)確分量的合成培養(yǎng)基粉末；（2）加熱煮沸溶解培養(yǎng)基時(shí)，留意鍋內(nèi)水位的變化，水位下降可再添加適量的水，以免水分蒸發(fā)過(guò)多，導(dǎo)致后面分裝不夠量；（3）往試管中放小導(dǎo)管時(shí)，注意處理氣泡。沙門(mén)氏菌群檢測(cè)沙門(mén)氏菌檢測(cè)程序2沙門(mén)氏菌檢測(cè)操作步驟前增菌稱取10g（mL）樣品放入盛有90mLBPW的無(wú)菌均質(zhì)杯中，以8000r/min?10000r/min均質(zhì)1min?2min,或置于盛有90mLBPW的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min?2min。使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36℃±1℃培養(yǎng)8h?18h。增菌輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)的樣品混合物，移取1mL,轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi)，于42℃士1℃培養(yǎng)18h?24h。同時(shí)，另取1mL,轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h。分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)HE瓊脂平板。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h?24h（HE瓊脂平板、沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h?48h（BS瓊脂平板），觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落，各個(gè)平板上的菌落特征見(jiàn)表1表1沙門(mén)氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的囪落特征選棒性瓊脂平板沙門(mén)氏菌BS蟠菌落為黑色有金融限驚耨色或灰也懿周周培養(yǎng)軻&黑色或驚色有些菌株用成燧色的畝落，周圍培養(yǎng)基不變■:HE垣脂藍(lán)綠色或黃色，多數(shù)青落中心翳色或幾乎至黑色；有些國(guó)株為黃色.中心黑色或兒平全黑色XLD瓊騰匐落旦科紅色1帶或不帶黑色中心，有些■株可星現(xiàn)大的帶光涕的黑色中心1或呈現(xiàn)全部黑色的菌落有些菌株為黃鰭落帝或襁黑色中也沙門(mén)氏胡髓培養(yǎng)基按照顯色培養(yǎng)卦稅嬲行判總生化試驗(yàn)三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫竣酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h,必要時(shí)可延長(zhǎng)至48鼠在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)，沙門(mén)氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2沙門(mén)氏筐屬在三糖鐵頊脂和穎氨酸脫馥酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果二藕恢瓊脂賴氨蒯嬲試驗(yàn)培養(yǎng)基朝好斷斜面底層產(chǎn)氣航化氫KA+(-)+（一:，可疑沙門(mén)氏菌屬KA+(-)+(-.)可疑抄門(mén)氏菌屬AA+(-)+(-)腺加氏菌屬AA+/—非沙門(mén)氏窗KK+『一f一非沙門(mén)氏菌由K：產(chǎn)帳A：產(chǎn)酸：+：陽(yáng)性I一：陰性：+（-）：多獨(dú)陽(yáng)性，少數(shù)陰性：+/-：陽(yáng)性或陰性口在三糖鐵瓊脂內(nèi)斜面產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，同時(shí)賴氨酸脫竣酶試驗(yàn)陰性的菌株可以排除。其他的反應(yīng)結(jié)果均有沙門(mén)氏菌屬的可能，同時(shí)也均有不是沙門(mén)氏菌屬的可能。系列生化反應(yīng)試驗(yàn)接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí)，可直接接種蛋白胨水（供做靛基質(zhì)試驗(yàn)）、尿素瓊脂（PH7.2）、氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h,必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h,按表3判定結(jié)果。將已挑菌落的平板儲(chǔ)存于2℃?5℃或室溫至少保留24h,以備必要時(shí)復(fù)查。表3沙門(mén)氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號(hào)硫化氫（H2S）靛基質(zhì)pH12尿素上優(yōu)鉀（KCN）頓氨酸脫皎酶A]——————+A2+————+A3————+/-注：+陽(yáng)性;-陰性；+/—陽(yáng)性或陰性.反應(yīng)序號(hào)A1：典型反應(yīng)判定為沙門(mén)氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫竣酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常，按表4可判定為沙門(mén)氏菌，如有2項(xiàng)異常為非沙門(mén)氏菌。

表4沙門(mén)氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表pH尿素家化椰（KCN）賴氨酸雌酶判定緒果———甲型副睇沙門(mén)隔俵求血靜虢緒果）—一瀏〕氏菌腌V〔要求符合糊生化特性）+—一沙門(mén)氏盲個(gè)別變體（要求血翳鑒超果）注;+表示陽(yáng)由+表示陰山反應(yīng)序號(hào)A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，沙門(mén)氏菌靛基質(zhì)陽(yáng)性變體兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。反應(yīng)序號(hào)A3：補(bǔ)做ONPG。ONPG陰性為沙門(mén)氏菌，同時(shí)賴氨酸脫竣酶陽(yáng)性，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌為賴氨酸脫竣酶陰性。必要時(shí)按表5進(jìn)行沙門(mén)氏菌生化群的鑒別。表5沙門(mén)氏陵屬各生化辭的飄項(xiàng)目[n111IYV衛(wèi)矛解++——十—山梨盥4-+++十—水楊甘一—+——CNFG——-—+—丙二雌—++———KCN一—+.—注：+孟示陽(yáng)性；一表示陰性■:血清學(xué)鑒定滴一定生理鹽水在載玻片靠近磨砂的一邊作對(duì)照，在另外一邊滴一滴血清，用滅菌后的接種環(huán)從三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面取一點(diǎn)菌種，放進(jìn)血清中，然后用酒精燈將接種環(huán)滅菌冷卻后，再取少量菌種放進(jìn)生理鹽水中。觀察血清中的的菌落是否凝結(jié)，與生理鹽水中的菌落對(duì)比。結(jié)果與報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報(bào)告25g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門(mén)氏菌。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析沙門(mén)氏菌檢測(cè)現(xiàn)象和結(jié)果（見(jiàn)表7）表7沙門(mén)氏菌檢測(cè)現(xiàn)象和結(jié)果試劑硫化氫蛋白胨（加靛基質(zhì)）尿素氰化鉀賴氨酸脫竣酶現(xiàn)象黑色不變色桃紅色不渾濁綠色結(jié)果+-+-+注：+陽(yáng)性，-陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析對(duì)照沙門(mén)氏菌生化反應(yīng)初步鑒定表，尿素，氰化鉀，賴氨酸脫竣酸三項(xiàng)中有兩項(xiàng)異常，按沙門(mén)氏菌生化鑒定表可判定結(jié)果為非沙門(mén)氏菌屬。甘露醇和山梨醇試驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果甘露醇和山梨醇都變成黃色，表現(xiàn)為陽(yáng)性。需要補(bǔ)做血清學(xué)鑒定試驗(yàn)。OPNG試驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果OPNG變成深黃色，表現(xiàn)為陽(yáng)性，為非沙門(mén)氏菌屬。血清學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果血清中的菌落沒(méi)有出現(xiàn)凝結(jié)現(xiàn)象，與生理鹽水中的菌落現(xiàn)象一樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析血清學(xué)鑒定結(jié)果為該菌落為非沙門(mén)氏菌屬。4實(shí)驗(yàn)結(jié)論與討論結(jié)論：綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果，25g樣品中未檢出沙門(mén)氏菌屬。討論：沙門(mén)氏菌是重要的腸道致病菌，腸炎沙門(mén)氏菌是其中的一種，常引起雞、鴨等禽類感染，還可引起食物中毒⑸，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為非沙門(mén)氏菌屬，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性可信性不高，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能存在操作失誤（如接種環(huán)還未冷卻就取種，導(dǎo)致菌種死亡）或者其他原因?qū)е聦?shí)驗(yàn)偏差，應(yīng)該重新做實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)再次進(jìn)行試驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可信度。鑒于雞肉等畜禽產(chǎn)品污染沙門(mén)氏菌所引起食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，越來(lái)越多的學(xué)者投入到其生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)的溯源研究中。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法由于存在著抗原的變異及不同種屬菌間的交叉反應(yīng)等，其應(yīng)用受到了一定限制⑶。而ERIC-PCR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性強(qiáng)，靈敏度高、鑒別能力強(qiáng)、所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為細(xì)菌基因分型、流行病學(xué)調(diào)查研究領(lǐng)域里強(qiáng)有力的工具引。.5檢驗(yàn)報(bào)告報(bào)告陰性結(jié)果：25g樣品中未發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌。參考文[1]陳玲.食品中沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)方法的研究[J].科技與創(chuàng)新，2015,8.[2]孫園園，趙鵬等.沙門(mén)氏菌檢測(cè)