同源重組的應(yīng)用專(zhuān)題講義課件

同源重組的應(yīng)用09生工夏章傳同源重組的應(yīng)用09生工夏章傳1同源重組概述同源重組（homologousrecombination）◆即一般重組，是染色體之間進(jìn)行遺傳信息的方式之一，幾乎所有生物都發(fā)生同源重組?！羧缯婧松餃p數(shù)分裂中染色體的交換，細(xì)菌結(jié)合、轉(zhuǎn)化、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的遺傳重組都屬于同源重組。◆同源重組要求兩個(gè)DNA分子的序列同源，同源區(qū)越長(zhǎng)越有利于重組；同源區(qū)太短，則難于發(fā)生重組。因?yàn)樗蕾?lài)于大范圍DNA同源順序的聯(lián)會(huì)，負(fù)責(zé)DNA配對(duì)和重組的蛋白質(zhì)因子無(wú)堿基序列特異性，只要兩條DNA序列相同或相近，重組便可以在聯(lián)會(huì)部分的任何位置發(fā)生。當(dāng)然，也存在重組熱點(diǎn)，即某些序列發(fā)生重組的概率高于其它序列?！敉粗亟M也是對(duì)損傷DNA修復(fù)的一種重要途徑，即重組修復(fù)。同源重組概述同源重組（homologousrecombin2同源重組的應(yīng)用◆同源重組的應(yīng)用價(jià)值主要是用于基因敲除（knock-out）和基因敲進(jìn)(knock-in)①研究基因功能②轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備③用于藥物篩選的動(dòng)物模型④轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物同源重組的應(yīng)用◆同源重組的應(yīng)用價(jià)值3基因敲進(jìn)和敲進(jìn)◆基因敲除（knockoutofgene）:是基因打靶技術(shù)的一種，指外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細(xì)胞基因組中的相同或相似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中?！艋蚯眠M(jìn)（knockinofgene）：利用基因同源重組，將外源有功能的基因轉(zhuǎn)入基因組中不存在或已失活的細(xì)胞中與其基因組中同源序列進(jìn)行同源重組，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)，這一技術(shù)稱(chēng)為基因敲進(jìn)?；蚯眠M(jìn)和敲進(jìn)◆基因敲除（knockoutofgene4◆基因敲除和敲進(jìn)的原理都是同源重組，即同源雙交換，用克隆的外源基因取代基因組中野生型等位基因?！魞烧卟煌c(diǎn)在于，基因敲除導(dǎo)入的外源基因是失活的、無(wú)功能的基因，基因敲進(jìn)導(dǎo)入的是有活性和功能的基因。因而兩者的具體用途有所不同?！艋蚯贸颓眠M(jìn)都可用于基因功能的研究，基因敲進(jìn)則也可用于突變基因的修復(fù)?！艋蚯贸亲?0年代末以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用，比較成功的有基因的插入突變和iRNA，它們同樣可以達(dá)到基因敲除的目的?！艋蚯贸颓眠M(jìn)的原理都是同源重組，即同源雙交換，用克隆的外5小鼠基因敲除實(shí)驗(yàn)◆基因敲出實(shí)際操作簡(jiǎn)要步驟：1、克隆目的基因及其兩側(cè)的DNA序列。2、通過(guò)插入抗性基因或者DNA缺失，對(duì)克隆的目的基因進(jìn)行體外遺傳改造，使克隆的目的基因失活。3、將經(jīng)體外改造失活的目的基因引入受體細(xì)胞，使之與野生型基因進(jìn)行同源重組。小鼠基因敲除實(shí)驗(yàn)◆基因敲出實(shí)際操作簡(jiǎn)要步驟：6◆這兩種基因取代，都是是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外面的斷裂點(diǎn)，用同源序列的目的基因整個(gè)置換內(nèi)源基因。目前用于基因敲除的技術(shù)有Cre/LoxP系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等?！舸朔僧a(chǎn)生精確的基因突變，也可正確糾正機(jī)體的基因突變?！暨@兩種基因取代，都是是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外面的斷裂點(diǎn)，7①研究基因功能◆細(xì)菌和一些低等真核生物在進(jìn)行基因取代時(shí)，克隆的基因能精確地插入到染色體的同源部位，所以他們是研究基因取代的理想材料。◆基因取代法除成功用于細(xì)菌和酵母菌的基因分析外，還成功地應(yīng)用到老鼠和雞的基因功能分析中。①研究基因功能◆細(xì)菌和一些低等真核生物在進(jìn)行基因取代時(shí)，克8②轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備

②轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備

9◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用領(lǐng)域1、生物反應(yīng)器：藥用或食品蛋白的大量生產(chǎn)，即轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥；2、疾病的動(dòng)物模型：用于研究、藥物篩選、藥物治療、毒物測(cè)試；3、通過(guò)增加或刪除基因來(lái)研究基因的功能、調(diào)控和發(fā)育，如癌基因、免疫系統(tǒng)等；4、異種器官的移植；5、家畜品種的改良?！艮D(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用領(lǐng)域◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用領(lǐng)域1、生物反應(yīng)器：藥用或食品蛋白的大量生10③用于藥物篩選的動(dòng)物模型

◆誘發(fā)性或?qū)嶒?yàn)性動(dòng)物模型（ExperimentalAnimalModels）用同源重組的方法，將致病因素作用于動(dòng)物，造成動(dòng)物組織、器官或全身一定的損害，出現(xiàn)某些類(lèi)似人類(lèi)疾病時(shí)的功能、代謝或毒使動(dòng)物患相應(yīng)的傳染病，又如用化學(xué)致癌劑、放射線、致癌病毒誘發(fā)動(dòng)物的腫瘤等。誘發(fā)性疾病動(dòng)物模型具有能在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出大量疾病模型，并能?chē)?yán)格控制各種條件使復(fù)制出的疾病模型適合研究目的需要等特點(diǎn)，因而為近代醫(yī)學(xué)研究所常用，特別是藥物篩選研究工作所首選。但誘發(fā)模型和自然產(chǎn)生的疾病模型在某些方面畢竟存在一定差異。因此在設(shè)計(jì)誘發(fā)性動(dòng)物模型要盡量克服其不足，發(fā)揮其特點(diǎn)。③用于藥物篩選的動(dòng)物模型

◆誘發(fā)性或?qū)嶒?yàn)性動(dòng)物模型（Exp11③用于藥物篩選的動(dòng)物模型◆用于藥物篩選的動(dòng)物模型例如：帕金森病動(dòng)物模型，用于藥物篩選。建立抗丙型肝炎病毒藥物篩選的動(dòng)物模型。精神分裂癥動(dòng)物模型及其藥物篩選。高尿酸血癥動(dòng)物模型的建立及抗痛風(fēng)中藥的篩選。◆要求：（一）相似性（二）重復(fù)性（三）可靠性（四）適用性和可控性（五）易行性和經(jīng)濟(jì)性。③用于藥物篩選的動(dòng)物模型◆用于藥物篩選的動(dòng)物模型例如：12③用于藥物篩選的動(dòng)物模型◆動(dòng)物模型的意義和優(yōu)越性：（一）避免了在人身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。（二）臨床上平時(shí)不易見(jiàn)到的疾病可用動(dòng)物隨時(shí)復(fù)制出來(lái)。（三）可以克服人類(lèi)某些疾病潛伏期長(zhǎng)，病程長(zhǎng)和發(fā)病率低的缺點(diǎn)。（四）可以嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)材料的可比性。（五）可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作和樣品收集。（六）有助于更全面地認(rèn)識(shí)疾病的本質(zhì)。③用于藥物篩選的動(dòng)物模型13④轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物?！艮D(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物不僅開(kāi)辟了制藥業(yè)的新紀(jì)元，而且它也是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究最活躍的領(lǐng)域。◆基因工程藥物3個(gè)階段:1、細(xì)菌基因工程，即把目的基因通過(guò)適當(dāng)?shù)母慕▽?dǎo)入大腸桿菌中，再通過(guò)細(xì)菌等原核微生物表達(dá)的目的蛋白作為藥物;2、是細(xì)胞基因工程藥物，這是把人或哺乳動(dòng)物的基因直接導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，生產(chǎn)有生物活性的產(chǎn)品;3、其三是利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)低成本、高活性的藥物。④轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物?！艮D(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)14一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是把外源基因?qū)雱?dòng)物的生殖細(xì)胞中，并整合該細(xì)胞后發(fā)育成為個(gè)體整合的外源基因，整合的外源基因又能影響其后代遺傳的動(dòng)物。一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是把外源基因?qū)雱?dòng)物的生殖細(xì)胞中，15藥用蛋白基因→表達(dá)細(xì)胞株→細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥用蛋白的基本過(guò)程受體動(dòng)物供體動(dòng)物→受精卵→無(wú)核受精卵→組裝的核細(xì)胞→多細(xì)胞胚胎→假孕動(dòng)物→動(dòng)物幼崽→雌性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物→乳汁→藥用蛋白藥用蛋白基因→表達(dá)細(xì)胞株→細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥用蛋白的基本16◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn)：1、品種多、產(chǎn)量高、質(zhì)量好。2、設(shè)備簡(jiǎn)單、不耗能、無(wú)環(huán)鏡污染。3、生產(chǎn)周期短。4、生產(chǎn)成本低?！艮D(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn)：1、品種多、產(chǎn)量高、質(zhì)量好。17◆2006年報(bào)道：我國(guó)目前已有乳鐵蛋白、白蛋白、凝血因子等進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，首個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的藥物有望在5年內(nèi)上市。“究竟是哪種轉(zhuǎn)基因藥物率先上市，還得由臨床療效說(shuō)了算。”◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就是指通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法，人工地把外源基因?qū)雱?dòng)物的受精卵，使外源基因與動(dòng)物本身的基因組整合在一起，因而外源基因能隨細(xì)胞的分裂而增殖，并能穩(wěn)定地遺傳給下一代。在此基礎(chǔ)上，人們只要將事先提取到的藥用蛋白注射到牛、羊等身上，當(dāng)它們的下一代出生，人們便可以從其體內(nèi)提取更多的藥用蛋白。簡(jiǎn)單地說(shuō)，就像在動(dòng)物的體內(nèi)批量生產(chǎn)藥物一樣。◆此前，我國(guó)科學(xué)家曾在上海成功研制出5頭有目的基因整合的轉(zhuǎn)基因羊，其中一頭羊產(chǎn)下小羊進(jìn)入泌乳期后，其乳汁中有活性的人凝血因子IX顯示，這種凝血因子恰是治療血友病乙的珍貴藥物。上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所成功培育出含有人血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因試管牛。目前，科學(xué)家們正在進(jìn)一步研究如何提高成功率?！?006年報(bào)道：我國(guó)目前已有乳鐵蛋白、白蛋白、凝血因子等進(jìn)18Theend,thanks!Theend,thanks!19同源重組的應(yīng)用09生工夏章傳同源重組的應(yīng)用09生工夏章傳20同源重組概述同源重組（homologousrecombination）◆即一般重組，是染色體之間進(jìn)行遺傳信息的方式之一，幾乎所有生物都發(fā)生同源重組?！羧缯婧松餃p數(shù)分裂中染色體的交換，細(xì)菌結(jié)合、轉(zhuǎn)化、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的遺傳重組都屬于同源重組?！敉粗亟M要求兩個(gè)DNA分子的序列同源，同源區(qū)越長(zhǎng)越有利于重組；同源區(qū)太短，則難于發(fā)生重組。因?yàn)樗蕾?lài)于大范圍DNA同源順序的聯(lián)會(huì)，負(fù)責(zé)DNA配對(duì)和重組的蛋白質(zhì)因子無(wú)堿基序列特異性，只要兩條DNA序列相同或相近，重組便可以在聯(lián)會(huì)部分的任何位置發(fā)生。當(dāng)然，也存在重組熱點(diǎn)，即某些序列發(fā)生重組的概率高于其它序列?！敉粗亟M也是對(duì)損傷DNA修復(fù)的一種重要途徑，即重組修復(fù)。同源重組概述同源重組（homologousrecombin21同源重組的應(yīng)用◆同源重組的應(yīng)用價(jià)值主要是用于基因敲除（knock-out）和基因敲進(jìn)(knock-in)①研究基因功能②轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備③用于藥物篩選的動(dòng)物模型④轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物同源重組的應(yīng)用◆同源重組的應(yīng)用價(jià)值22基因敲進(jìn)和敲進(jìn)◆基因敲除（knockoutofgene）:是基因打靶技術(shù)的一種，指外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細(xì)胞基因組中的相同或相似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中?！艋蚯眠M(jìn)（knockinofgene）：利用基因同源重組，將外源有功能的基因轉(zhuǎn)入基因組中不存在或已失活的細(xì)胞中與其基因組中同源序列進(jìn)行同源重組，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)，這一技術(shù)稱(chēng)為基因敲進(jìn)?；蚯眠M(jìn)和敲進(jìn)◆基因敲除（knockoutofgene23◆基因敲除和敲進(jìn)的原理都是同源重組，即同源雙交換，用克隆的外源基因取代基因組中野生型等位基因?！魞烧卟煌c(diǎn)在于，基因敲除導(dǎo)入的外源基因是失活的、無(wú)功能的基因，基因敲進(jìn)導(dǎo)入的是有活性和功能的基因。因而兩者的具體用途有所不同?！艋蚯贸颓眠M(jìn)都可用于基因功能的研究，基因敲進(jìn)則也可用于突變基因的修復(fù)?！艋蚯贸亲?0年代末以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用，比較成功的有基因的插入突變和iRNA，它們同樣可以達(dá)到基因敲除的目的?！艋蚯贸颓眠M(jìn)的原理都是同源重組，即同源雙交換，用克隆的外24小鼠基因敲除實(shí)驗(yàn)◆基因敲出實(shí)際操作簡(jiǎn)要步驟：1、克隆目的基因及其兩側(cè)的DNA序列。2、通過(guò)插入抗性基因或者DNA缺失，對(duì)克隆的目的基因進(jìn)行體外遺傳改造，使克隆的目的基因失活。3、將經(jīng)體外改造失活的目的基因引入受體細(xì)胞，使之與野生型基因進(jìn)行同源重組。小鼠基因敲除實(shí)驗(yàn)◆基因敲出實(shí)際操作簡(jiǎn)要步驟：25◆這兩種基因取代，都是是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外面的斷裂點(diǎn)，用同源序列的目的基因整個(gè)置換內(nèi)源基因。目前用于基因敲除的技術(shù)有Cre/LoxP系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等?！舸朔僧a(chǎn)生精確的基因突變，也可正確糾正機(jī)體的基因突變。◆這兩種基因取代，都是是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外面的斷裂點(diǎn)，26①研究基因功能◆細(xì)菌和一些低等真核生物在進(jìn)行基因取代時(shí)，克隆的基因能精確地插入到染色體的同源部位，所以他們是研究基因取代的理想材料?！艋蛉〈ǔ晒τ糜诩?xì)菌和酵母菌的基因分析外，還成功地應(yīng)用到老鼠和雞的基因功能分析中。①研究基因功能◆細(xì)菌和一些低等真核生物在進(jìn)行基因取代時(shí)，克27②轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備

②轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備

28◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用領(lǐng)域1、生物反應(yīng)器：藥用或食品蛋白的大量生產(chǎn)，即轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥；2、疾病的動(dòng)物模型：用于研究、藥物篩選、藥物治療、毒物測(cè)試；3、通過(guò)增加或刪除基因來(lái)研究基因的功能、調(diào)控和發(fā)育，如癌基因、免疫系統(tǒng)等；4、異種器官的移植；5、家畜品種的改良?！艮D(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用領(lǐng)域◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用領(lǐng)域1、生物反應(yīng)器：藥用或食品蛋白的大量生29③用于藥物篩選的動(dòng)物模型

◆誘發(fā)性或?qū)嶒?yàn)性動(dòng)物模型（ExperimentalAnimalModels）用同源重組的方法，將致病因素作用于動(dòng)物，造成動(dòng)物組織、器官或全身一定的損害，出現(xiàn)某些類(lèi)似人類(lèi)疾病時(shí)的功能、代謝或毒使動(dòng)物患相應(yīng)的傳染病，又如用化學(xué)致癌劑、放射線、致癌病毒誘發(fā)動(dòng)物的腫瘤等。誘發(fā)性疾病動(dòng)物模型具有能在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出大量疾病模型，并能?chē)?yán)格控制各種條件使復(fù)制出的疾病模型適合研究目的需要等特點(diǎn)，因而為近代醫(yī)學(xué)研究所常用，特別是藥物篩選研究工作所首選。但誘發(fā)模型和自然產(chǎn)生的疾病模型在某些方面畢竟存在一定差異。因此在設(shè)計(jì)誘發(fā)性動(dòng)物模型要盡量克服其不足，發(fā)揮其特點(diǎn)。③用于藥物篩選的動(dòng)物模型

◆誘發(fā)性或?qū)嶒?yàn)性動(dòng)物模型（Exp30③用于藥物篩選的動(dòng)物模型◆用于藥物篩選的動(dòng)物模型例如：帕金森病動(dòng)物模型，用于藥物篩選。建立抗丙型肝炎病毒藥物篩選的動(dòng)物模型。精神分裂癥動(dòng)物模型及其藥物篩選。高尿酸血癥動(dòng)物模型的建立及抗痛風(fēng)中藥的篩選?！粢螅海ㄒ唬┫嗨菩裕ǘ┲貜?fù)性（三）可靠性（四）適用性和可控性（五）易行性和經(jīng)濟(jì)性。③用于藥物篩選的動(dòng)物模型◆用于藥物篩選的動(dòng)物模型例如：31③用于藥物篩選的動(dòng)物模型◆動(dòng)物模型的意義和優(yōu)越性：（一）避免了在人身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。（二）臨床上平時(shí)不易見(jiàn)到的疾病可用動(dòng)物隨時(shí)復(fù)制出來(lái)。（三）可以克服人類(lèi)某些疾病潛伏期長(zhǎng)，病程長(zhǎng)和發(fā)病率低的缺點(diǎn)。（四）可以嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)材料的可比性。（五）可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作和樣品收集。（六）有助于更全面地認(rèn)識(shí)疾病的本質(zhì)。③用于藥物篩選的動(dòng)物模型32④轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物。◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物不僅開(kāi)辟了制藥業(yè)的新紀(jì)元，而且它也是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究最活躍的領(lǐng)域?！艋蚬こ趟幬?個(gè)階段:1、細(xì)菌基因工程，即把目的基因通過(guò)適當(dāng)?shù)母慕▽?dǎo)入大腸桿菌中，再通過(guò)細(xì)菌等原核微生物表達(dá)的目的蛋白作為藥物;2、是細(xì)胞基因工程藥物，這是把人或哺乳動(dòng)物的基因直接導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，生產(chǎn)有生物活性的產(chǎn)品;3、其三是利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)低成本、高活性的藥物。④轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物?！艮D(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)33一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是把外源基因?qū)雱?dòng)物的生殖細(xì)胞中，并整合該細(xì)胞后發(fā)育成為個(gè)體整合的外源基因，整合的外源基因又能影響其后代遺傳的動(dòng)物。一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物◆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是把外源基因?qū)雱?dòng)物的生殖細(xì)胞