生化技術（5）化學檢測課件

第五章化學檢測技術1、生化檢測技術定義：根據物質的各種性質對物質進行定性、定量、定位測定的各種方法。2、化學檢測定義：根據物質的化學性質而對物質進行定性、定量測定的方法。第一節(jié)糖類的化學檢測1、糖類有單糖、雙糖、寡糖和多糖之分，單糖和某些雙糖是具有多羥基醛或多羥基酮（即羰基化合物）。其中具有（CH2O）n通式的為還原糖。多糖和蔗糖為非還原糖。2、糖類的化學檢測主要是利用糖結構中游離羰基的還原性，與氧化劑試劑進行氧化還原反應而進行測定的。而對于非還原性糖必須轉化成還原性糖再進行測定。第五章化學檢測技術1、生化檢測技術定義：根13、糖類化學檢測中最常用的試劑為斐林（Fehling)試劑。1）其基本組成是2）Fehling試劑測定原理根據一定量的Fehling試劑完全還原，所需還原糖的量，計算樣品中還原糖的含量。酒石酸鉀鈉銅是一種氧化劑，可與還原糖的游離羰基發(fā)生氧化還原反應。還原糖在堿性條件下將金屬絡離子（銅、汞、銀等）還原，而還原糖本身被氧化成酸類化合物，此性質可作為還原糖含量測定的依據。因為含有游離羰基的糖類，-CHO具有還原性，而硫酸銅作為一種氧化劑與糖類作用時，糖類的-CHO被氧化，兩價的銅離子被還原成氧化亞銅。測定氧化亞銅的生成量即可測知溶液中的含糖量。常用的Fehling試劑和Benedict試劑就是CuSO4的堿性溶液。3、糖類化學檢測中最常用的試劑為斐林（Fehling)試劑。2一、蘭-愛農（Lane-Eynon）法1、以次甲基藍為指示劑，直接用糖溶液滴定到Fehling試劑中進行測定的方法或將糖溶液加到Fehling試劑中，再用標準的葡萄糖反滴定2、用Lane-Eynon法滴定還原糖時，應在電爐上加熱至微沸，整個過程應在3min內完成（為什么？）反應取決于反應液的堿度及加熱的時間和溫度（1）盡量減少生成的Cu2O被空氣中O2重新氧化（2）減少還原糖未與Cu2+反應前已被氧化成糖酸3、多糖或其他非還原糖必須轉化成還原糖后才能進行還原滴定。如：淀粉還原性單糖進行Fehling試劑測定。酸或堿水解酶法水解中和或微酸性一、蘭-愛農（Lane-Eynon）法1、以次甲基藍為指示劑3二、斐林試劑快速法是在Fehling試劑中加入亞鐵氰化鉀（黃血鹽）K4Fe(CN)6紅色Cu2O與亞鐵氰化鉀絡合生成可溶性的復鹽使反應終點更為明顯。三、碘量法將過量的二價銅用碘化鉀還原，析出的碘用硫代硫酸鈉滴定即為碘量法。包括次碘酸鈉法和銅試劑法。1、次碘酸鈉法是以I與NaOH反應生成的次碘酸鈉（NaIO)去氧化還原糖的自由醛基，過量的I2再由Na2S2O3滴定，而進行糖的測定。由于次碘酸鈉的氧化能力較弱僅適用于醛糖的滴定，而與酮糖不起反應。（所以在酮糖存在的情況下，可以單獨測定醛糖）二、斐林試劑快速法是在Fehling試劑中加入亞鐵氰化42、酮試劑法是將還原糖與二價銅離子反應生成的氧化亞銅用碘氧化，再用Na2S2O3滴定反應液中剩余的碘，而測定樣品中還原糖的含量。另外對于葡萄糖的測定還可用以下方法：（1）鐵氰化鉀方法在熱堿溶液中，葡萄糖可將黃色的高鐵氰化鉀還原成無色的亞鐵氰化鉀，致使λ=420nm的吸光度降低，而降低的程度與樣品中葡萄糖濃度成正比。稀釋樣品透析器葡萄糖與高鐵氰化鉀混合油?。?5℃）的蛇形管高鐵氰化鉀被還原成亞鐵氰化鉀測λ=420nm的吸光度計算葡萄糖的濃度。流經透析出流經加熱此法可用于連續(xù)流動分析儀測定樣品中葡萄糖的含量。2、酮試劑法是將還原糖與二價銅離子反應生成的氧化亞銅5（2）鄰甲苯胺法利用某些芳香伯胺可與醛糖在熱醋酸中生成有色化合物的原理。首先，鄰甲苯胺試劑與醛糖的醛基縮合形成糖基胺和其Shiff堿的平衡混合物；然后經分子重排等反應生成藍綠色化合物。在λ=630nm處有一吸收峰，吸光度大小與葡萄糖濃度成正比。（3）3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）糖類的測定在工業(yè)發(fā)酵以及微生物培養(yǎng)中具有特別的重要意義。如原料中淀粉含量是原料的重要質量指標；發(fā)酵過程中糖量變化可以衡量發(fā)酵正常與否；味精生產中終了也需通過發(fā)酵液中殘?zhí)堑臏y定確定的。另外，淀粉酶、糖化酶的活力測定也是通過測定糖量來計算的。三、應用（2）鄰甲苯胺法利用某些芳香伯胺可與醛糖在熱醋酸中6

※谷氨酸發(fā)酵液中還原糖的測定在谷氨酸發(fā)酵中有著重要的指導意義。還原糖的變化與發(fā)酵正常與否、染菌與否關系密切。同時，發(fā)酵完畢和放罐時間也是通過殘?zhí)菧y定來確定的。一般情況下，染菌后，還原糖幾乎不被減少；而正常發(fā)酵中，當還原糖小于1%時就可認為發(fā)酵完畢放罐。※谷氨酸發(fā)酵液中還原糖的測定在谷氨酸發(fā)酵中有著重要的7第二節(jié)蛋白質和氨基酸的化學檢測蛋白質是由二十種氨基酸通過肽鍵連接而成的多肽鏈，而測定蛋白質一般是利用蛋白質的結構或性質進行的1、蛋白質的肽鏈結構。如雙縮脲反應2、酪氨酸和色氨酸對Folin-ciocalteu(酚）試劑反應或紫外吸收。如紫外分光光度法測定法。3、與色素結合的能力。如考馬斯亮藍染色法。4、沉淀后借濁度或光折射測定。一、凱氏定氮法測定蛋白質的含量（總蛋白測定）1、依據：蛋白質是含氮化合物且含氮量幾乎是恒定的，平均為16%，故只要測出蛋白質的含量，再乘以6.25即為蛋白質的含量。第二節(jié)蛋白質和氨基酸的化學檢測蛋白質是由二十種82、原理：用高溫、濃硫酸將蛋白質消化，使其所含的氮素全部轉化為銨鹽，在加堿使堿鹽成為氨經蒸餾分離出來，最后用酸滴定測定氮量。按每克氮相當于6.25克蛋白質計算蛋白質的量。消化爐++消化管漏斗蛋白質RCH(NH2)COOHCO2、NH3、SO2、H2O濃硫酸濃硫酸200℃200℃NH3+H2SO4（過量）

(NH4)2SO4(NH4)2SO4+NaOHNa2SO4+2NH3+H2ONH3+H3BO3(NH4)3BO3(NH4)3BO3+HClH3BO3+NH4ClHCl+NaOHNaCl+H2O2、原理：用高溫、濃硫酸將蛋白質消化，使其所含的氮素全部轉化9★在消化過程中添加的各種試劑的作用（1）濃硫酸：脫水使有機物炭化、氧化，濃硫酸在200度以上能使有機物破壞生成二氧化碳和水。（2）硫酸銅：作為消化的催化劑以促進化學反應的進行。（3）硫酸鉀或硫酸鈉等：用于提高消化時的沸點，可使沸點提高到400℃。（4）濃堿：可使消化液中的(NH4)2SO4分解游離出氨?！飿悠返念A處理（1）固體樣品中含氮量是用100克該物質（干重）中所含氮的克數(shù)來表示（%）。定氮前應先將固體樣品中的水分除去，一般樣品的烘干溫度都采用105℃，因為非游離的水都不能在100℃以下烘干。（2）若為液體樣品，可直接量取一定體積的樣品進行測定?！镌谙^程中添加的各種試劑的作用（1）濃硫酸：脫水使有機物10二、雙縮脲試劑法測定蛋白質的含量。蛋白質中的肽鍵（-CO-NH-）在堿性溶液中能與銅離子作用產生紫紅色絡合物。此反應和兩個尿素分子縮合生成的雙縮脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）在堿性條件下與銅離子作用形成紫紅色的反應相似故稱為雙縮脲反應。這種顏色反應強度在一定濃度范圍內與蛋白質含量成正比關系，經與同樣處理的蛋白質標準溶液比較，即可求得蛋白質含量，此用于蛋白質的定量測定。定性測定：雙縮脲反應至少含有兩個-CO-NH-基團才能和銅離子絡合，故氨基酸及二肽無此反應，三肽以上才能進行反應?？梢酝ㄟ^此反應檢查蛋白質的水解程度。但含有兩個-CSNH-、-C（NH）NH-或CH2NH-等基團的化合物對雙縮脲試劑反應亦呈陽性，所以本反應并非蛋白質所特有。二、雙縮脲試劑法測定蛋白質的含量。蛋白質中的肽鍵（-11三、Folin-ciocalteu(酚）試劑法測定蛋白質含量此法Folin最早用于酪氨酸和色氨酸的測定，后由我國吳憲用于蛋白質定量測定，經多次改良成廣泛應用的Lowry法，是對雙縮脲的發(fā)展。蛋白質先與堿性硫酸銅（含酒石酸鉀鈉）作用。其肽鍵或烯醇化的肽鍵可與銅離子絡合，絡合物釋放出電子，使后加入的酚試劑（主要成分為磷鎢酸和磷鉬酸）還原。

另一方面，蛋白質中的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸也能使鎢酸、鉬酸或兩者同時失去氧原子，還原成多種有藍色的混合酸。最大的吸收峰在λ=745~750nm。一般可在650nm處比色測定。-N-C-HO=-N=COH-N-C-=O與Cu2+絡合后釋放出電子磷鎢酸、磷鉬酸藍色混合酸此法的靈敏度為10~60μg/ml三、Folin-ciocalteu(酚）試劑法測定蛋白質含12此外蛋白質的測定方法還有：（1）紫外分光光度法許多蛋白質由于含有色氨酸和酪氨酸，在λ=280nm處有一吸收峰，可用于測定蛋白質的含量。但生物樣品?；煊泻怂?，而核酸的最大吸收峰λ=260nm處，在λ=280nm處也有較強的光吸收峰，可采用兩個波長測定吸光度校正。用各種蛋白質和核酸不同比例的混合樣品求得的各種經驗公式，可以算出蛋白質濃度1）Lowry-kalacker公式蛋白質濃度（mg/ml)=1.45A280-0.74A2602)Warburg-christian公式蛋白質濃度（mg/ml)=1.55A280-0.76A260本法測定的蛋白質未加任何試劑和處理，可保留樣品的生物活性，且可回收全部蛋白質，故常用于較純的酶和免疫球蛋白等蛋白質含量的測定。此外蛋白質的測定方法還有：（1）紫外分光光度法許多蛋白13（2）染料結合法

在酸性條件下，蛋白質分子解離出帶正電荷的-NH3+基團，它可與染料的陰離子產生顏色反應。借以同樣處理的標準溶液對比，求出樣品中蛋白質的含量。最常用的染料為考馬斯亮藍G-250，在酸性條件下，與蛋白質結合后由棕紅色變?yōu)樗{色，最大吸收峰從465nm移至595nm，在150mg/dl范圍內蛋白質濃度和吸光度成線性關系。（3）比濁法某些強酸如三氯乙酸、磺基水揚酸或兩者混合等，能與生物堿結合而沉淀故稱為生物堿試劑，它們能與蛋白質結合產生沉淀。這是蛋白質的共性，即在pH小于蛋白質等電點的溶液中，蛋白質分子帶正電荷，可與帶負電荷的三氯乙酸或磺基水揚酸結合形成沉淀。然后測定懸浮液的混濁度，與同樣處理的已知含量的蛋白質標準液比較即可求出樣品中蛋白質的含量（2）染料結合法在酸性條件下，蛋白質分子解離出帶正14四、蛋白質N-末端氨基酸DNS測定法即丹磺?；瘻y定法（二甲氨基萘磺酰氯法）（DNS-Cl）1、原理DNS-Cl是一種熒光試劑，能與蛋白質（或多肽）的N-末端氨基酸反應生成DNS-多肽，DNS-基團與N-末端氨基酸反應結合牢固，水解可得DNS-氨基酸和各種氨基酸。用醋酸乙酯抽提，然后進行層析法鑒定，層析圖譜在360nm或280nm出產生強烈的熒光，與標準樣品對照測知蛋白質或多肽的N-末端氨基酸，從而確定蛋白質多肽鏈的數(shù)目。2、反應過程DNS-Cl+蛋白質（多肽）DNS-蛋白質（多肽）DNS-氨基酸+各種氨基酸醋酸乙酯抽提堿性條件PH9.1（H+）酸性水解H2O四、蛋白質N-末端氨基酸DNS測定法即丹磺酰化測定法（二甲氨15五、蛋白質氨基酸排列順序的測定-Edman法又稱PITC法（異硫氰酸苯酯分析法）1、原理蛋白質或多肽的N-末端氨基酸能與PITC作用，生成苯氨基硫甲酰蛋白質或多肽，簡稱PTC-蛋白質或多肽，它們在酸性有機溶劑中加熱時，N末端的PTC-氨基酸發(fā)生環(huán)化，生成苯乙內酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）并從肽鏈上水解下來，少一個N-末端氨基酸的多肽鏈保持完整，因為PITC的引入只使N-末端第一個肽鍵穩(wěn)定性降低。PTC-氨基酸經有機溶劑抽提，進行層析鑒定并與標準樣品對照從而測定出樣品中N-末端氨基酸種類。剩余的多肽可再與PITC重復上述反應，逐步遞減N-末端氨基酸，確定其順序，稱為Edman順序降解法。五、蛋白質氨基酸排列順序的測定-Edman法又稱PITC法（162、反應過程PITC+蛋白質（多肽）PTC-蛋白質（多肽）PTH-氨基酸+少一個氨基酸的剩余多肽PH8.7~9.040-50℃H+H2O☆蛋白質多肽鏈氨基酸順序測定的步驟（3）通過N-末端氨基酸的測定，確定蛋白質多肽鏈的數(shù)目（1）蛋白質進行提取、純化。（2）斷裂多肽鏈的二硫鍵并進行拆分多肽鏈。（4）利用Edman法測定各肽鏈氨基酸的排列順序?！顜追N水解斷裂多肽鏈酶的介紹（1）胰蛋白酶：專一水解賴氨酸和精氨酸的羧基參與形成的肽鍵（2）糜蛋白酶：斷裂苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵（3）胃蛋白酶斷裂Leu、Phe、Trp和Tys等疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵另、CNBr只斷裂甲硫氨酸羧基參與形成的肽鍵。2、反應過程PITC+蛋白質（多肽）17六、蛋白質N-末端氨基酸FDNB測定法1、原理蛋白質或多肽的游離末端-NH2與DNFB（2，4-二硝基氟苯又稱Sanger試劑）反應，生成DNP-蛋白質（多肽），由于DNFB與氨基形成的鍵對酸水解穩(wěn)定性比肽鍵高，因此當DNP-蛋白質（多肽）經酸水解時，只有N-末端氨基酸為黃色的DNP-氨基酸衍生物，其余為游離的氨基酸，只要鑒別DNP-氨基酸即可得知N-末端的氨基酸。由于DNFB的衍生物DNP-氨基酸都呈黃色，有利與檢測但它們對光敏感，因此應避光進行實驗。2、注意六、蛋白質N-末端氨基酸FDNB測定法1、原理蛋白質18七、茚三酮顯色法測定氨基酸含量原理：除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應產生黃色物質外，所有α-氨基酸以及一切蛋白質都能與以上同反應生成藍紫色物質茚三酮反應分為兩步進行：首先，氨基酸氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被氧化成還原型的茚三酮；其次，還原型的茚三酮銅另一水合茚三酮分子和氨縮合成有色物質。β-丙氨酸、氨和許多一級胺都呈正反應，因此，雖然蛋白質和氨基酸均有茚三酮顏色反應，但能與茚三酮反應呈陽性反應的不一定就是蛋白質或氨基酸，在定性定量測定試驗中應嚴防干擾物的存在。七、茚三酮顯色法測定氨基酸含量原理：除脯氨酸、羥脯19八、本身沒有顏色的物質，通過適當?shù)脑噭┓磻?，轉化為有顏色的物質，如雙縮脲反應、茚三酮反應和熒光反應等。如：熒光檢測技術可分為原子熒光檢測技術和分子熒光檢測技術熒光檢測的方法有三類：1）直接用熒光性物進行檢測；2）利用非熒光物與熒光試劑進行反應，成為熒光性物質，再進行檢測；3）在熒光性物質中加入消光物質，測定熒光的減少量。（一）鄰苯二甲醛熒光法測定氨基酸鄰苯二甲醛（OPT）作為一種熒光試劑，主要用于氨基酸、多肽和蛋白質的檢測方法。八、本身沒有顏色的物質，通過適當?shù)脑噭┓磻?，轉化為有顏色的物20OPT+氨基酸、多肽和蛋白質熒光性化合物堿性還原劑激發(fā)波長為λ=340nm,熒光波長λ=455nm優(yōu)點：OPT與氨基酸、多肽等反應不需加熱、作用迅速、熒光試劑與氨基酸混合后5min便可測定熒光，靈敏度高熒光產物有一定穩(wěn)定性。。（二）熒光胺熒光分析法測定肽的含量以熒光胺為熒光試劑，用于蛋白質、肽、氨基酸等的檢測方法。其中合成類似的熒光試劑MDPE（2-甲氧基-2，4-二苯基-3-呋喃酮）。熒光胺或MDPE+含有伯胺基的化合物（氨基酸、多肽、蛋白質等）生成強熒光性化合物PH=8-9其激發(fā)波長為λ=390nm,熒光波長λ=475nmOPT+氨基酸、多肽和蛋白質21九、甲醛滴定法測定氨基酸氨基酸是兩性電解質在水溶液中存在如下平衡：不能用一般的酸堿指示劑氨基酸在高PH的水溶液中能發(fā)生下面的解離反應：R-CH-COO-R-CH-COO-+H2O-NH3+-NH2OH-九、甲醛滴定法測定氨基酸氨基酸是兩性電解質在水溶液中存在如下22-NH3+是一個弱酸，使其完全解離時PH為11-13，若用堿滴定-NH3+所釋放的H+來測定氨基酸，一般指示劑變色范圍小于10，很難準確指示終點。常溫下，甲醛能迅速與氨基酸的氨基結合，生成羥甲基化合物R-CH-COO-R-CH-COO-+H+

-NH3+-NH2NaOH中和HCHO中性條件R-CH-COO-NHCH2OHR-CH-COO-N（CH2OH）2HCHO中性條件利用化學平衡原理，由于醛基的加入，使平衡右移，促使-NH3+釋放H+，使溶液的酸度增加，滴定終點移至酚酞的變色范圍內（PH9.0）左右。此時可用酚酞作為指示劑，用標準NaOH溶液滴定。-NH3+是一個弱酸，使其完全解離時PH為11-1323

第三節(jié)蛋白質的免疫化學檢測定義：利用抗原與抗體之間特異的結合反應而對蛋白質進行定性定量分析的技術。一、基本概念與原理1、抗體：將外源物質（不同種屬的蛋白質或微生物）不經口（避開消化道）進入動物體內后，經過一定時間，動物的血清中出現(xiàn)與引入蛋白質起反應的物質（球蛋白）。2、抗原：能引起抗體產生的物質3、免疫反應：抗原與抗體起結合反應，形成沉淀的過程。二、蛋白質的免疫化學檢測方法主要有凝集反應和沉淀反應（一）凝集反應1、定義：細胞性抗原（細菌、病毒、紅血球等）與相應的抗體（抗血清）相混合時，細胞性抗原出現(xiàn)凝集成團，這叫做凝集反應。2、用途測定抗體（抗血清）的效價，也可用于細菌、病毒的分類。第三節(jié)蛋白質的免疫化學檢測定義24（二）沉淀反應1、定義：可溶性抗原（蛋白質）與相應的抗體混合，當兩者的比例適當，并有適當?shù)柠}類存在時，即可形成沉淀。這叫沉淀反應。2、注意條件1）選擇適當?shù)目乖⒖贵w比例9ml9ml9ml9ml9ml取1ml取1ml取1ml取1ml原液稀釋10-1倍稀釋10-2倍稀釋10-3倍稀釋10-4倍如果是藥品則以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為該藥品的效價。假如青霉素在10-4稀釋倍數(shù)時能全部殺死某種病毒，則此時青霉素對這種病毒的效價為10000個單位。（二）沉淀反應1、定義：可溶性抗原（蛋白質）與相應的抗體混合252）沉淀溫度：一般為37℃或室溫（25℃）3）沉淀PH：一般為中性偏堿（PH6.5~8.6)4)離子強度：一般為生物的生理鹽水濃度0.9%NaCl溶液3、作用：可對抗原和抗體進行定性、定量測定。4、方法1）沉淀試驗利用抗體+抗原沉淀為陽性反應2）界面試驗抗體抗原（不同濃度）沉淀界面注：在實驗中應利用生理鹽水作空白對照實驗。2）沉淀溫度：一般為37℃或室溫（25℃）3）沉淀PH：一般263）免疫擴散利用蛋白質在半固體基質上的擴散作用，使抗原與抗體在濃度比例合適的部位產生沉淀帶或沉淀環(huán)，從而檢測蛋白質?！飭蜗驍U散：把可溶性抗原擴散到均勻分布于半固體基質中的抗體中。當抗原適當過量時，便可形成沉淀帶。抗體血清半固體基質擴散作用抗原沉淀帶3）免疫擴散利用蛋白質在半固體基質上的擴散作用，使抗27★雙向擴散：把可溶性抗原擴散到均勻分布于半固體基質中的抗體中。當抗原適當過量時，便可形成沉淀帶。抗體抗原擴散作用沉淀帶抗血清不同蛋白質溶液★雙向擴散：把可溶性抗原擴散到均勻分布于半固體基質中的抗體中284）免疫電泳123456123456代表不同的抗血清擴散電泳技術與免疫擴散相結合。4）免疫電泳123295）免疫親和層析抗原和相應的抗體具有特異親和力的生物分子對。6）免疫熒光檢測技術第四節(jié)核酸的化學檢測核酸磷酸+戊糖+堿基，針對核酸不同組成，可采取定磷法、二苯胺法和地衣酚法對它們進行化學檢測。水解一、定磷法測定核酸含量可用于分析生物材料或制品中核酸、核苷酸所含的磷成分。

其過程為：先將核酸或核苷酸用強酸消化（如濃硫酸或過氯酸），使有機磷轉化成無機磷；再用一般測定無機磷的試劑顯色，如用鉬酸銨與無機磷反應而生成藍色的磷鉬酸；最后根據無機磷的含量推算核酸或核苷酸的含量。5）免疫親和層析抗原和相應的抗體具有特異親和力的生物分子對。30藍色的磷鉬酸最大吸收峰在650~660nm波長處，測定OD650，測定磷的含量。二、二苯胺法測定DNA含量（比色法）為測定脫氧核糖的常用方法含脫氧核糖的DNA在酸性條件下和二苯胺在沸水浴中共熱10分鐘后，產生藍色。在595nm處有最大吸收峰。因為DNA嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-6-酮醛戊醛。它再與苯胺作用產生藍色物質，在一定范圍內與DNA的濃度成正比。由于DNA和RNA都含有磷，所以在測定時必須把兩者分開，然后分別進行測定。DNA+少量濃H2SO4+二苯胺藍色物質100℃藍色的磷鉬酸最大吸收峰在650~660nm波長處，測31三、地衣酚法測定RNA含量（比色法）測定核糖的常用方法是苔黑酚（即地衣酚：3.5-二羥甲苯法）當含有核糖的RNA與濃HCl及3.5-二羥甲苯法）在FeCl3存在的情況下反應，在沸水浴中加熱10-20分鐘后，有綠色物質產生，這是RNA脫嘌呤后的核糖與酸作用生成糠醛，后者再與3.5-二羥甲苯作用產生綠色物質，在670nm處有最高吸收峰，在一定濃度與RNA成正比。RNA+濃HCl+3.5-二羥甲苯法）綠色復合物100℃FeCl3實際上在酸溶液中，DNA與RNA的嘌呤核苷鍵易水解斷裂而產生具有戊糠醛基的水解產物，稱為去嘌呤核酸，后者可在酸中進一步變成糠醛衍生物，再與特異的試劑呈現(xiàn)顏色反應。由此可測定生物材料或制品中核酸的含量。三、地衣酚法測定RNA含量（比色法）測定核糖的常用方法是苔黑32四、紫外分析法由于核酸分子中的嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，對260nm的紫外吸收波有一個最大的吸收，根據此性質可進行定性和定量測定。方法是：在260nm處測定樣品的吸收度，然后與標準曲線對比，即可求出樣品的核酸含量。此法的優(yōu)點是：不易受其他物質的干擾、靈敏度高、正確而迅速。

核酸測定時應注意：用測糖法和測磷酸法來測定生物樣品中核酸或其水解產物的含量時，一般需去掉干擾物質，如磷蛋白、糖類、磷脂和輔酶等雜質。四、紫外分析法由于核酸分子中的嘌呤堿和嘧啶堿具有33第六章光學檢測技術定義：利用物質所具有的各種光學性質，或被檢測物與其他物質進行顏色反應后，進行光學檢測，對物質進行定性和定量及結構分析的技術。第一節(jié)旋光檢測技術1、定義：2、原理：手性分子具有旋光性。即分子中具有不對稱碳原子的物質如糖類、多數(shù)氨基酸、羥基酸等，能夠使偏振光的偏振面產生旋轉作用即旋光作用。旋光物質對偏振光的旋轉方向和角度大小是物質的固有特性。偏振光旋轉的方向和角度稱為旋光度，旋光度的大小和方向可用旋光儀測定。第六章光學檢測技術34物質的旋光度主要決定于物質本身的結構，同時與溶液的濃度、溶劑、溫度、樣品管的長度和光的波長有關系。物質的旋光度α為α=[α]λt.L.C/100通常采用比旋光度[α]λt.來表示各種物質的旋光度[α]λt.=100a/LC如20℃時，利用旋光儀測定谷氨酸水溶液的旋光度，2dm的樣品管，測得α=+10.6，求谷氨酸的濃度。物質的旋光度主要決定于物質本身的結構，同時與溶液的35第二節(jié)熒光檢測技術熒光檢測技術可分為原子熒光檢測技術和分子熒光檢測技術1、原理：分子熒光的發(fā)生是物質分子吸收輻射能，從基態(tài)（低能級）躍遷至某一電子激發(fā)態(tài)中（較高能級）的某一振動能級。處于受激發(fā)態(tài)較高的振動能級中的分子通過運動或與其他分子碰撞而將過多的能量轉移給其他分子，很快回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，然后發(fā)生自發(fā)輻射躍遷到基態(tài)，發(fā)射出一定波長的輻射能量，此能量即為熒光。第二電子激發(fā)態(tài)S2第一電子激發(fā)態(tài)S1基態(tài)S0碰撞失去振動能熒光不同的物質放射的熒光光譜不同，熒光的強度與物質的濃度有關。第二節(jié)熒光檢測技術362、熒光檢測的方法有三類：1）直接用熒光性物進行檢測；2）利用非熒光物與熒光試劑進行反應，成為熒光性物質，再進行檢測；3）在熒光性物質中加入消光物質，測定熒光的減少量。一、鄰苯二甲醛熒光法測定氨基酸鄰苯二甲醛（OPT）作為一種熒光試劑，主要用于氨基酸、多肽和蛋白質的檢測方法。OPT+氨基酸、多肽和蛋白質熒光性化合物堿性還原劑激發(fā)波長為λ=340nm,熒光波長λ=455nm優(yōu)點：OPT與氨基酸、多肽等反應不需加熱、作用迅速、熒光試劑與氨基酸混合后5min便可測定熒光，靈敏度高熒光產物有一定穩(wěn)定性。。2、熒光檢測的方法有三類：一、鄰苯二甲醛熒光法測定氨基酸37二、熒光胺熒光分析法測定肽的含量以熒光胺為熒光試劑，用于蛋白質、肽、氨基酸等的檢測方法。其中合成類似的熒光試劑MDPE（2-甲氧基-2，4-二苯基-3-呋喃酮）。熒光胺或MDPE+含有伯胺基的化合物（氨基酸、多肽、蛋白質等）生成強熒光性化合物PH=8-9其激發(fā)波長為λ=390nm,熒光波長λ=475nm二、熒光胺熒光分析法測定肽的含量以熒光胺為熒光試劑，38第三節(jié)分光光度檢測技術分光光度檢測是利用物質所特有的吸收光譜來鑒定物質或測定物質含量的技術。根據物質吸收光譜的頻率范圍不同，分光光度分析可分為：紫外光（200-400nm）檢測核酸類、蛋白質類等。可見光（400-760nm）各種有色物質。紅外光（760-10000nm）飽和脂肪酸、脂肪胺、醇類等一、樣品溶液的配制1、物質本身對紫外光、可見光或紅外光等有選擇吸收特性的物質。2、本身沒有顏色的物質，通過適當?shù)脑噭┓磻?，轉化為有顏色的物質，如雙縮脲反應和茚三酮反應。第三節(jié)分光光度檢測技術分光光度檢測是利用物質所特有的吸收39二、樣品的檢測根據被測物的吸收光譜特性，選擇好入射光線的波長，調節(jié)好零點，即可進行測試。三、待測物質的定性分析（確定為何種物質）1、將測得的吸收光譜與標準物質的吸收光譜相對照。2、根據吸收光譜中峰頂與峰谷吸光度之比值與相當條件下資料所記載的比值相比較，推斷為何種物質。3、分光度檢測技術與其他生化技術相配合。四、待測物質的定量分析1、根據Lambert-Beer定律（光吸收的基本定律）由于有機化合物中發(fā)色基團和助色基團的種類、數(shù)目及其在分子中所處的位置和環(huán)境不同，因此測得的吸收光譜也不相同，依據物質的吸收光譜的特性和形狀，可作該物質的鑒別、純度檢查和初步結構分析等。二、樣品的檢測根據被測物的吸收光譜特性，選擇好入射40Lambert-Beer定律是可見光、紫外光吸收光譜法定量基礎。說明吸光物質對單色光吸收的強弱與該物質的濃度與厚度間關系的規(guī)律，是吸收光譜的基本定律。E=KCL其中Lambert定律，說明吸收與厚度間的關系Beer定律說明吸收與濃度間的關系。2、繪制標準曲線，測定樣品與標準曲線比較或在標準曲線上查出樣品中物質的含量。3、對于有干擾物質存在的樣品，計算時要進行適當?shù)男ＵＨ纾篖owry-kalacker公式蛋白質濃度（mg/ml)=1.45A280-0.74A260Lambert-Beer定律是可見光、紫外光吸收光譜法定量基41第七章氣體檢測技術1、氣體檢測技術：利用物質在生化反應或化學反應中放出或吸收氣體的性質，通過測量氣體量的變化而對物質進行定性和定量分析的技術。2、應用：用于細胞的呼吸、酶的反應動力學研究、氧化還原反應以及氨基酸、酮酸、尿素等的測定。3、檢測的氣體：主要為CO2、N2和O2氣體檢測有兩種類型1）一種是測量試樣中的氣體組分如瓶裝啤酒中CO2含量的測定2）另一種是固體或液體試劑經過化學反應生成某一種氣體，借助氣體生成量來計算被測物組分的含量。第七章氣體檢測技術1、氣體檢測技術：利用物質在生化反應424、主要應用的儀器為1）華勃氏（Warburg)呼吸儀：主要用于反應過程中氧氣的吸收量或二氧化碳的放出量的測定。如：大腸桿菌L-谷氨酸脫羧酶。只催化L-Glu脫羧，反應生成的CO2可用華勃氏呼吸儀來定量測定釋放的CO2摩爾數(shù)等于溶液中谷氨酸的量HOOC-CH2-CH2-CH-COOHHOOC-CH2-CH2-CH2NH2+CO2NH2L-Glu脫羧酶2）范.斯萊（Vanslyke)檢測儀：主要用于檢測α-氨基酸與亞硝酸反應所產生的氮氣，從而計算氨基酸的含量R-CH-COOH+HNO2R-CH-COOH+N2+H2ONH2OH通過范.斯萊定氮儀測定N2的體積，計算出N2的摩爾數(shù)，得到α-氨基酸的摩爾數(shù)。4、主要應用的儀器為如：大腸桿菌L-谷氨酸脫羧酶。只催化L-43第一節(jié)華勃氏呼吸儀檢壓法一、基本原理在溫度固定和體積不變的條件下，反應系統(tǒng)中某氣體量的變化可以從其所表現(xiàn)的壓力變化測量出來。根據理想氣體狀態(tài)方程PV=nRT測出壓力的變化，算出氣體量的變化n=PV/RT=KP華勃氏呼吸儀是根據氣體定律而設計的，常用來測定一些吸收氣體或釋放氣體的生物化學反應。如：1）琥珀酸的測定CH2-COOHCH-COOHCH2-COOHHOOC-CH+O2琥珀酸氧化酶2)谷氨酸和丙氨酸等氨基酸含量的測定（谷氨酸和丙氨酸在相應的脫羧酶的作用下產生CO2）第一節(jié)華勃氏呼吸儀檢壓法一、基本原理在溫度固定和體443）組織或細胞的呼吸測定（氧氣的吸入和二氧化碳的呼出）在生產谷氨酸發(fā)酵過程中必須經常測定發(fā)酵液中Glu的含量，借以控制適宜的工藝條件，獲得較高的產率。發(fā)酵液中Glu含量的測定方法是利用專一性較高的大腸桿菌L-Glu脫羧酶，在一定溫度（37℃）、一定PH值（PH=4.2）和固定容積的條件下，Glu脫羧生成CO2。3）組織或細胞的呼吸測定（氧氣的吸入和二氧化碳的呼出）45第二節(jié)范.斯萊克檢測儀測定α-氨基酸R-CH-COOH+HNO2R-CH-COOH+N2+H2Oα-氨基酸與亞硝酸反應生成羥基酸并放出氮氣：NH2OH釋放出的N2一半來自氨基酸；另一半來自亞硝酸，故應把測得的氮氣體積除以2。再換算成標準狀態(tài)下氮的體積，在標準狀態(tài)下，1mol氣體所占體積為22.4L。故可計算出樣品液中氨基酸的含量。第二節(jié)范.斯萊克檢測儀測定α-氨基酸R-CH-COOH46第五章化學檢測技術1、生化檢測技術定義：根據物質的各種性質對物質進行定性、定量、定位測定的各種方法。2、化學檢測定義：根據物質的化學性質而對物質進行定性、定量測定的方法。第一節(jié)糖類的化學檢測1、糖類有單糖、雙糖、寡糖和多糖之分，單糖和某些雙糖是具有多羥基醛或多羥基酮（即羰基化合物）。其中具有（CH2O）n通式的為還原糖。多糖和蔗糖為非還原糖。2、糖類的化學檢測主要是利用糖結構中游離羰基的還原性，與氧化劑試劑進行氧化還原反應而進行測定的。而對于非還原性糖必須轉化成還原性糖再進行測定。第五章化學檢測技術1、生化檢測技術定義：根473、糖類化學檢測中最常用的試劑為斐林（Fehling)試劑。1）其基本組成是2）Fehling試劑測定原理根據一定量的Fehling試劑完全還原，所需還原糖的量，計算樣品中還原糖的含量。酒石酸鉀鈉銅是一種氧化劑，可與還原糖的游離羰基發(fā)生氧化還原反應。還原糖在堿性條件下將金屬絡離子（銅、汞、銀等）還原，而還原糖本身被氧化成酸類化合物，此性質可作為還原糖含量測定的依據。因為含有游離羰基的糖類，-CHO具有還原性，而硫酸銅作為一種氧化劑與糖類作用時，糖類的-CHO被氧化，兩價的銅離子被還原成氧化亞銅。測定氧化亞銅的生成量即可測知溶液中的含糖量。常用的Fehling試劑和Benedict試劑就是CuSO4的堿性溶液。3、糖類化學檢測中最常用的試劑為斐林（Fehling)試劑。48一、蘭-愛農（Lane-Eynon）法1、以次甲基藍為指示劑，直接用糖溶液滴定到Fehling試劑中進行測定的方法或將糖溶液加到Fehling試劑中，再用標準的葡萄糖反滴定2、用Lane-Eynon法滴定還原糖時，應在電爐上加熱至微沸，整個過程應在3min內完成（為什么？）反應取決于反應液的堿度及加熱的時間和溫度（1）盡量減少生成的Cu2O被空氣中O2重新氧化（2）減少還原糖未與Cu2+反應前已被氧化成糖酸3、多糖或其他非還原糖必須轉化成還原糖后才能進行還原滴定。如：淀粉還原性單糖進行Fehling試劑測定。酸或堿水解酶法水解中和或微酸性一、蘭-愛農（Lane-Eynon）法1、以次甲基藍為指示劑49二、斐林試劑快速法是在Fehling試劑中加入亞鐵氰化鉀（黃血鹽）K4Fe(CN)6紅色Cu2O與亞鐵氰化鉀絡合生成可溶性的復鹽使反應終點更為明顯。三、碘量法將過量的二價銅用碘化鉀還原，析出的碘用硫代硫酸鈉滴定即為碘量法。包括次碘酸鈉法和銅試劑法。1、次碘酸鈉法是以I與NaOH反應生成的次碘酸鈉（NaIO)去氧化還原糖的自由醛基，過量的I2再由Na2S2O3滴定，而進行糖的測定。由于次碘酸鈉的氧化能力較弱僅適用于醛糖的滴定，而與酮糖不起反應。（所以在酮糖存在的情況下，可以單獨測定醛糖）二、斐林試劑快速法是在Fehling試劑中加入亞鐵氰化502、酮試劑法是將還原糖與二價銅離子反應生成的氧化亞銅用碘氧化，再用Na2S2O3滴定反應液中剩余的碘，而測定樣品中還原糖的含量。另外對于葡萄糖的測定還可用以下方法：（1）鐵氰化鉀方法在熱堿溶液中，葡萄糖可將黃色的高鐵氰化鉀還原成無色的亞鐵氰化鉀，致使λ=420nm的吸光度降低，而降低的程度與樣品中葡萄糖濃度成正比。稀釋樣品透析器葡萄糖與高鐵氰化鉀混合油?。?5℃）的蛇形管高鐵氰化鉀被還原成亞鐵氰化鉀測λ=420nm的吸光度計算葡萄糖的濃度。流經透析出流經加熱此法可用于連續(xù)流動分析儀測定樣品中葡萄糖的含量。2、酮試劑法是將還原糖與二價銅離子反應生成的氧化亞銅51（2）鄰甲苯胺法利用某些芳香伯胺可與醛糖在熱醋酸中生成有色化合物的原理。首先，鄰甲苯胺試劑與醛糖的醛基縮合形成糖基胺和其Shiff堿的平衡混合物；然后經分子重排等反應生成藍綠色化合物。在λ=630nm處有一吸收峰，吸光度大小與葡萄糖濃度成正比。（3）3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）糖類的測定在工業(yè)發(fā)酵以及微生物培養(yǎng)中具有特別的重要意義。如原料中淀粉含量是原料的重要質量指標；發(fā)酵過程中糖量變化可以衡量發(fā)酵正常與否；味精生產中終了也需通過發(fā)酵液中殘?zhí)堑臏y定確定的。另外，淀粉酶、糖化酶的活力測定也是通過測定糖量來計算的。三、應用（2）鄰甲苯胺法利用某些芳香伯胺可與醛糖在熱醋酸中52

※谷氨酸發(fā)酵液中還原糖的測定在谷氨酸發(fā)酵中有著重要的指導意義。還原糖的變化與發(fā)酵正常與否、染菌與否關系密切。同時，發(fā)酵完畢和放罐時間也是通過殘?zhí)菧y定來確定的。一般情況下，染菌后，還原糖幾乎不被減少；而正常發(fā)酵中，當還原糖小于1%時就可認為發(fā)酵完畢放罐。※谷氨酸發(fā)酵液中還原糖的測定在谷氨酸發(fā)酵中有著重要的53第二節(jié)蛋白質和氨基酸的化學檢測蛋白質是由二十種氨基酸通過肽鍵連接而成的多肽鏈，而測定蛋白質一般是利用蛋白質的結構或性質進行的1、蛋白質的肽鏈結構。如雙縮脲反應2、酪氨酸和色氨酸對Folin-ciocalteu(酚）試劑反應或紫外吸收。如紫外分光光度法測定法。3、與色素結合的能力。如考馬斯亮藍染色法。4、沉淀后借濁度或光折射測定。一、凱氏定氮法測定蛋白質的含量（總蛋白測定）1、依據：蛋白質是含氮化合物且含氮量幾乎是恒定的，平均為16%，故只要測出蛋白質的含量，再乘以6.25即為蛋白質的含量。第二節(jié)蛋白質和氨基酸的化學檢測蛋白質是由二十種542、原理：用高溫、濃硫酸將蛋白質消化，使其所含的氮素全部轉化為銨鹽，在加堿使堿鹽成為氨經蒸餾分離出來，最后用酸滴定測定氮量。按每克氮相當于6.25克蛋白質計算蛋白質的量。消化爐++消化管漏斗蛋白質RCH(NH2)COOHCO2、NH3、SO2、H2O濃硫酸濃硫酸200℃200℃NH3+H2SO4（過量）

(NH4)2SO4(NH4)2SO4+NaOHNa2SO4+2NH3+H2ONH3+H3BO3(NH4)3BO3(NH4)3BO3+HClH3BO3+NH4ClHCl+NaOHNaCl+H2O2、原理：用高溫、濃硫酸將蛋白質消化，使其所含的氮素全部轉化55★在消化過程中添加的各種試劑的作用（1）濃硫酸：脫水使有機物炭化、氧化，濃硫酸在200度以上能使有機物破壞生成二氧化碳和水。（2）硫酸銅：作為消化的催化劑以促進化學反應的進行。（3）硫酸鉀或硫酸鈉等：用于提高消化時的沸點，可使沸點提高到400℃。（4）濃堿：可使消化液中的(NH4)2SO4分解游離出氨?！飿悠返念A處理（1）固體樣品中含氮量是用100克該物質（干重）中所含氮的克數(shù)來表示（%）。定氮前應先將固體樣品中的水分除去，一般樣品的烘干溫度都采用105℃，因為非游離的水都不能在100℃以下烘干。（2）若為液體樣品，可直接量取一定體積的樣品進行測定?！镌谙^程中添加的各種試劑的作用（1）濃硫酸：脫水使有機物56二、雙縮脲試劑法測定蛋白質的含量。蛋白質中的肽鍵（-CO-NH-）在堿性溶液中能與銅離子作用產生紫紅色絡合物。此反應和兩個尿素分子縮合生成的雙縮脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）在堿性條件下與銅離子作用形成紫紅色的反應相似故稱為雙縮脲反應。這種顏色反應強度在一定濃度范圍內與蛋白質含量成正比關系，經與同樣處理的蛋白質標準溶液比較，即可求得蛋白質含量，此用于蛋白質的定量測定。定性測定：雙縮脲反應至少含有兩個-CO-NH-基團才能和銅離子絡合，故氨基酸及二肽無此反應，三肽以上才能進行反應。可以通過此反應檢查蛋白質的水解程度。但含有兩個-CSNH-、-C（NH）NH-或CH2NH-等基團的化合物對雙縮脲試劑反應亦呈陽性，所以本反應并非蛋白質所特有。二、雙縮脲試劑法測定蛋白質的含量。蛋白質中的肽鍵（-57三、Folin-ciocalteu(酚）試劑法測定蛋白質含量此法Folin最早用于酪氨酸和色氨酸的測定，后由我國吳憲用于蛋白質定量測定，經多次改良成廣泛應用的Lowry法，是對雙縮脲的發(fā)展。蛋白質先與堿性硫酸銅（含酒石酸鉀鈉）作用。其肽鍵或烯醇化的肽鍵可與銅離子絡合，絡合物釋放出電子，使后加入的酚試劑（主要成分為磷鎢酸和磷鉬酸）還原。

另一方面，蛋白質中的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸也能使鎢酸、鉬酸或兩者同時失去氧原子，還原成多種有藍色的混合酸。最大的吸收峰在λ=745~750nm。一般可在650nm處比色測定。-N-C-HO=-N=COH-N-C-=O與Cu2+絡合后釋放出電子磷鎢酸、磷鉬酸藍色混合酸此法的靈敏度為10~60μg/ml三、Folin-ciocalteu(酚）試劑法測定蛋白質含58此外蛋白質的測定方法還有：（1）紫外分光光度法許多蛋白質由于含有色氨酸和酪氨酸，在λ=280nm處有一吸收峰，可用于測定蛋白質的含量。但生物樣品?；煊泻怂幔怂岬淖畲笪辗濡?260nm處，在λ=280nm處也有較強的光吸收峰，可采用兩個波長測定吸光度校正。用各種蛋白質和核酸不同比例的混合樣品求得的各種經驗公式，可以算出蛋白質濃度1）Lowry-kalacker公式蛋白質濃度（mg/ml)=1.45A280-0.74A2602)Warburg-christian公式蛋白質濃度（mg/ml)=1.55A280-0.76A260本法測定的蛋白質未加任何試劑和處理，可保留樣品的生物活性，且可回收全部蛋白質，故常用于較純的酶和免疫球蛋白等蛋白質含量的測定。此外蛋白質的測定方法還有：（1）紫外分光光度法許多蛋白59（2）染料結合法

在酸性條件下，蛋白質分子解離出帶正電荷的-NH3+基團，它可與染料的陰離子產生顏色反應。借以同樣處理的標準溶液對比，求出樣品中蛋白質的含量。最常用的染料為考馬斯亮藍G-250，在酸性條件下，與蛋白質結合后由棕紅色變?yōu)樗{色，最大吸收峰從465nm移至595nm，在150mg/dl范圍內蛋白質濃度和吸光度成線性關系。（3）比濁法某些強酸如三氯乙酸、磺基水揚酸或兩者混合等，能與生物堿結合而沉淀故稱為生物堿試劑，它們能與蛋白質結合產生沉淀。這是蛋白質的共性，即在pH小于蛋白質等電點的溶液中，蛋白質分子帶正電荷，可與帶負電荷的三氯乙酸或磺基水揚酸結合形成沉淀。然后測定懸浮液的混濁度，與同樣處理的已知含量的蛋白質標準液比較即可求出樣品中蛋白質的含量（2）染料結合法在酸性條件下，蛋白質分子解離出帶正60四、蛋白質N-末端氨基酸DNS測定法即丹磺?；瘻y定法（二甲氨基萘磺酰氯法）（DNS-Cl）1、原理DNS-Cl是一種熒光試劑，能與蛋白質（或多肽）的N-末端氨基酸反應生成DNS-多肽，DNS-基團與N-末端氨基酸反應結合牢固，水解可得DNS-氨基酸和各種氨基酸。用醋酸乙酯抽提，然后進行層析法鑒定，層析圖譜在360nm或280nm出產生強烈的熒光，與標準樣品對照測知蛋白質或多肽的N-末端氨基酸，從而確定蛋白質多肽鏈的數(shù)目。2、反應過程DNS-Cl+蛋白質（多肽）DNS-蛋白質（多肽）DNS-氨基酸+各種氨基酸醋酸乙酯抽提堿性條件PH9.1（H+）酸性水解H2O四、蛋白質N-末端氨基酸DNS測定法即丹磺?；瘻y定法（二甲氨61五、蛋白質氨基酸排列順序的測定-Edman法又稱PITC法（異硫氰酸苯酯分析法）1、原理蛋白質或多肽的N-末端氨基酸能與PITC作用，生成苯氨基硫甲酰蛋白質或多肽，簡稱PTC-蛋白質或多肽，它們在酸性有機溶劑中加熱時，N末端的PTC-氨基酸發(fā)生環(huán)化，生成苯乙內酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）并從肽鏈上水解下來，少一個N-末端氨基酸的多肽鏈保持完整，因為PITC的引入只使N-末端第一個肽鍵穩(wěn)定性降低。PTC-氨基酸經有機溶劑抽提，進行層析鑒定并與標準樣品對照從而測定出樣品中N-末端氨基酸種類。剩余的多肽可再與PITC重復上述反應，逐步遞減N-末端氨基酸，確定其順序，稱為Edman順序降解法。五、蛋白質氨基酸排列順序的測定-Edman法又稱PITC法（622、反應過程PITC+蛋白質（多肽）PTC-蛋白質（多肽）PTH-氨基酸+少一個氨基酸的剩余多肽PH8.7~9.040-50℃H+H2O☆蛋白質多肽鏈氨基酸順序測定的步驟（3）通過N-末端氨基酸的測定，確定蛋白質多肽鏈的數(shù)目（1）蛋白質進行提取、純化。（2）斷裂多肽鏈的二硫鍵并進行拆分多肽鏈。（4）利用Edman法測定各肽鏈氨基酸的排列順序?！顜追N水解斷裂多肽鏈酶的介紹（1）胰蛋白酶：專一水解賴氨酸和精氨酸的羧基參與形成的肽鍵（2）糜蛋白酶：斷裂苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵（3）胃蛋白酶斷裂Leu、Phe、Trp和Tys等疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵另、CNBr只斷裂甲硫氨酸羧基參與形成的肽鍵。2、反應過程PITC+蛋白質（多肽）63六、蛋白質N-末端氨基酸FDNB測定法1、原理蛋白質或多肽的游離末端-NH2與DNFB（2，4-二硝基氟苯又稱Sanger試劑）反應，生成DNP-蛋白質（多肽），由于DNFB與氨基形成的鍵對酸水解穩(wěn)定性比肽鍵高，因此當DNP-蛋白質（多肽）經酸水解時，只有N-末端氨基酸為黃色的DNP-氨基酸衍生物，其余為游離的氨基酸，只要鑒別DNP-氨基酸即可得知N-末端的氨基酸。由于DNFB的衍生物DNP-氨基酸都呈黃色，有利與檢測但它們對光敏感，因此應避光進行實驗。2、注意六、蛋白質N-末端氨基酸FDNB測定法1、原理蛋白質64七、茚三酮顯色法測定氨基酸含量原理：除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應產生黃色物質外，所有α-氨基酸以及一切蛋白質都能與以上同反應生成藍紫色物質茚三酮反應分為兩步進行：首先，氨基酸氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被氧化成還原型的茚三酮；其次，還原型的茚三酮銅另一水合茚三酮分子和氨縮合成有色物質。β-丙氨酸、氨和許多一級胺都呈正反應，因此，雖然蛋白質和氨基酸均有茚三酮顏色反應，但能與茚三酮反應呈陽性反應的不一定就是蛋白質或氨基酸，在定性定量測定試驗中應嚴防干擾物的存在。七、茚三酮顯色法測定氨基酸含量原理：除脯氨酸、羥脯65八、本身沒有顏色的物質，通過適當?shù)脑噭┓磻?，轉化為有顏色的物質，如雙縮脲反應、茚三酮反應和熒光反應等。如：熒光檢測技術可分為原子熒光檢測技術和分子熒光檢測技術熒光檢測的方法有三類：1）直接用熒光性物進行檢測；2）利用非熒光物與熒光試劑進行反應，成為熒光性物質，再進行檢測；3）在熒光性物質中加入消光物質，測定熒光的減少量。（一）鄰苯二甲醛熒光法測定氨基酸鄰苯二甲醛（OPT）作為一種熒光試劑，主要用于氨基酸、多肽和蛋白質的檢測方法。八、本身沒有顏色的物質，通過適當?shù)脑噭┓磻?，轉化為有顏色的物66OPT+氨基酸、多肽和蛋白質熒光性化合物堿性還原劑激發(fā)波長為λ=340nm,熒光波長λ=455nm優(yōu)點：OPT與氨基酸、多肽等反應不需加熱、作用迅速、熒光試劑與氨基酸混合后5min便可測定熒光，靈敏度高熒光產物有一定穩(wěn)定性。。（二）熒光胺熒光分析法測定肽的含量以熒光胺為熒光試劑，用于蛋白質、肽、氨基酸等的檢測方法。其中合成類似的熒光試劑MDPE（2-甲氧基-2，4-二苯基-3-呋喃酮）。熒光胺或MDPE+含有伯胺基的化合物（氨基酸、多肽、蛋白質等）生成強熒光性化合物PH=8-9其激發(fā)波長為λ=390nm,熒光波長λ=475nmOPT+氨基酸、多肽和蛋白質67九、甲醛滴定法測定氨基酸氨基酸是兩性電解質在水溶液中存在如下平衡：不能用一般的酸堿指示劑氨基酸在高PH的水溶液中能發(fā)生下面的解離反應：R-CH-COO-R-CH-COO-+H2O-NH3+-NH2OH-九、甲醛滴定法測定氨基酸氨基酸是兩性電解質在水溶液中存在如下68-NH3+是一個弱酸，使其完全解離時PH為11-13，若用堿滴定-NH3+所釋放的H+來測定氨基酸，一般指示劑變色范圍小于10，很難準確指示終點。常溫下，甲醛能迅速與氨基酸的氨基結合，生成羥甲基化合物R-CH-COO-R-CH-COO-+H+

-NH3+-NH2NaOH中和HCHO中性條件R-CH-COO-NHCH2OHR-CH-COO-N（CH2OH）2HCHO中性條件利用化學平衡原理，由于醛基的加入，使平衡右移，促使-NH3+釋放H+，使溶液的酸度增加，滴定終點移至酚酞的變色范圍內（PH9.0）左右。此時可用酚酞作為指示劑，用標準NaOH溶液滴定。-NH3+是一個弱酸，使其完全解離時PH為11-1369

第三節(jié)蛋白質的免疫化學檢測定義：利用抗原與抗體之間特異的結合反應而對蛋白質進行定性定量分析的技術。一、基本概念與原理1、抗體：將外源物質（不同種屬的蛋白質或微生物）不經口（避開消化道）進入動物體內后，經過一定時間，動物的血清中出現(xiàn)與引入蛋白質起反應的物質（球蛋白）。2、抗原：能引起抗體產生的物質3、免疫反應：抗原與抗體起結合反應，形成沉淀的過程。二、蛋白質的免疫化學檢測方法主要有凝集反應和沉淀反應（一）凝集反應1、定義：細胞性抗原（細菌、病毒、紅血球等）與相應的抗體（抗血清）相混合時，細胞性抗原出現(xiàn)凝集成團，這叫做凝集反應。2、用途測定抗體（抗血清）的效價，也可用于細菌、病毒的分類。第三節(jié)蛋白質的免疫化學檢測定義70（二）沉淀反應1、定義：可溶性抗原（蛋白質）與相應的抗體混合，當兩者的比例適當，并有適當?shù)柠}類存在時，即可形成沉淀。這叫沉淀反應。2、注意條件1）選擇適當?shù)目乖?、抗體比例9ml9ml9ml9ml9ml取1ml取1ml取1ml取1ml原液稀釋10-1倍稀釋10-2倍稀釋10-3倍稀釋10-4倍如果是藥品則以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為該藥品的效價。假如青霉素在10-4稀釋倍數(shù)時能全部殺死某種病毒，則此時青霉素對這種病毒的效價為10000個單位。（二）沉淀反應1、定義：可溶性抗原（蛋白質）與相應的抗體混合712）沉淀溫度：一般為37℃或室溫（25℃）3）沉淀PH：一般為中性偏堿（PH6.5~8.6)4)離子強度：一般為生物的生理鹽水濃度0.9%NaCl溶液3、作用：可對抗原和抗體進行定性、定量測定。4、方法1）沉淀試驗利用抗體+抗原沉淀為陽性反應2）界面試驗抗體抗原（不同濃度）沉淀界面注：在實驗中應利用生理鹽水作空白對照實驗。2）沉淀溫度：一般為37℃或室溫（25℃）3）沉淀PH：一般723）免疫擴散利用蛋白質在半固體基質上的擴散作用，使抗原與抗體在濃度比例合適的部位產生沉淀帶或沉淀環(huán)，從而檢測蛋白質。★單向擴散：把可溶性抗原擴散到均勻分布于半固體基質中的抗體中。當抗原適當過量時，便可形成沉淀帶。抗體血清半固體基質擴散作用抗原沉淀帶3）免疫擴散利用蛋白質在半固體基質上的擴散作用，使抗73★雙向擴散：把可溶性抗原擴散到均勻分布于半固體基質中的抗體中。當抗原適當過量時，便可形成沉淀帶?？贵w抗原擴散作用沉淀帶抗血清不同蛋白質溶液★雙向擴散：把可溶性抗原擴散到均勻分布于半固體基質中的抗體中744）免疫電泳123456123456代表不同的抗血清擴散電泳技術與免疫擴散相結合。4）免疫電泳123755）免疫親和層析抗原和相應的抗體具有特異親和力的生物分子對。6）免疫熒光檢測技術第四節(jié)核酸的化學檢測核酸磷酸+戊糖+堿基，針對核酸不同組成，可采取定磷法、二苯胺法和地衣酚法對它們進行化學檢測。水解一、定磷法測定核酸含量可用于分析生物材料或制品中核酸、核苷酸所含的磷成分。

其過程為：先將核酸或核苷酸用強酸消化（如濃硫酸或過氯酸），使有機磷轉化成無機磷；再用一般測定無機磷的試劑顯色，如用鉬酸銨與無機磷反應而生成藍色的磷鉬酸；最后根據無機磷的含量推算核酸或核苷酸的含量。5）免疫親和層析抗原和相應的抗體具有特異親和力的生物分子對。76藍色的磷鉬酸最大吸收峰在650~660nm波長處，測定OD650，測定磷的含量。二、二苯胺法測定DNA含量（比色法）為測定脫氧核糖的常用方法含脫氧核糖的DNA在酸性條件下和二苯胺在沸水浴中共熱10分鐘后，產生藍色。在595nm處有最大吸收峰。因為DNA嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-6-酮醛戊醛。它再與苯胺作用產生藍色物質，在一定范圍內與DNA的濃度成正比。由于DNA和RNA都含有磷，所以在測定時必須把兩者分開，然后分別進行測定。DNA+少量濃H2SO4+二苯胺藍色物質100℃藍色的磷鉬酸最大吸收峰在650~660nm波長處，測77三、地衣酚法測定RNA含量（比色法）測定核糖的常用方法是苔黑酚（即地衣酚：3.5-二羥甲苯法）當含有核糖的RNA與濃HCl及3.5-二羥甲苯法）在FeCl3存在的情況下反應，在沸水浴中加熱10-20分鐘后，有綠色物質產生，這是RNA脫嘌呤后的核糖與酸作用生成糠醛，后者再與3.5-二羥甲苯作用產生綠色物質，在670nm處有最高吸收峰，在一定濃度與RNA成正比。RNA+濃HCl+3.5-二羥甲苯法）綠色復合物100℃FeCl3實際上在酸溶液中，DNA與RNA的嘌呤核苷鍵易水解斷裂而產生具有戊糠醛基的水解產物，稱為去嘌呤核酸，后者可在酸中進一步變成糠醛衍生物，再與特異的試劑呈現(xiàn)顏色反應。由此可測定生物材料或制品中核酸的含量。三、地衣酚法測定RNA含量（比色法）測定核糖的常用方法是苔黑78四、紫外分析法由于核酸分子中的嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，對260nm的紫外吸收波有一個最大的吸收，根據此性質可進行定性和定量測定。方法是：在260nm處測定樣品的吸收度，然后與標準曲線對比，即可求出樣品的核酸含量。此法的優(yōu)點是：不易受其他物質的干擾、靈敏度高、正確而迅速。

核酸測定時應注意：用測糖法和測磷酸法來測定生物樣品中核酸或其水解產物的含量時，一般需去掉干擾物質，如磷蛋白、糖類、磷脂和輔酶等雜質。四、紫外分析法由于核酸分子中的嘌呤堿和嘧啶堿具有79第六章光學檢測技術定義：利用物質所具有的各種光學性質，或被檢測物與其他物質進行顏色反應后，進行光學檢測，對物質進行定性和定量及結構分析的技術。第一節(jié)旋光檢測技術1、定義：2、原理：手性分子具有旋光性。即分子中具有不對稱碳原子的物質如糖類、多數(shù)氨基酸、羥基酸等，能夠使偏振光的偏振面產生旋轉作用即旋光作用。旋光物質對偏振光的旋轉方向和角度大小是物質的固有特性。偏振光旋轉的方向和角度稱為旋光度，旋光度的大小和方向可用旋光儀測定。第六章光學檢測技術80物質的旋光度主要決定于物質本身的結構，同時與溶液的濃度、溶劑、溫度、樣品管的長度和光的波長有關系。物質的旋光度α為α=[α]λt.L.C/100通常采用比旋光度[α]λt.來表示各種物質的旋光度[α]λt.=100a/LC如20℃時，利用旋光儀測定谷氨酸水溶液的旋光度，2dm的樣品管，測得α=+10.6，求谷氨酸的濃度。物質的旋光度主要決定于物質本身的結構，同時與溶液的81第二節(jié)熒光檢測技術熒光檢測技術可分為原子熒光檢測技術和分子熒光檢測技術1、原理：分子熒光的發(fā)生是物質分子吸收輻射能，從基態(tài)（低能級）躍遷至某一電子激發(fā)態(tài)中（較高能級）的某一振動能級。處于受激發(fā)態(tài)較高的振動能級中的分子通過運動或與其他分子碰撞而將過多的能量轉移給其他分子，很快回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，然后發(fā)生自發(fā)輻射躍遷到基態(tài)，發(fā)射出一定波長的輻射能量，此能量即為熒光。第二電子激發(fā)態(tài)S2第一電子激發(fā)態(tài)S1基態(tài)S0碰撞失去振動能熒光不同的物質放射的熒光光譜不同，熒光的強度與物質的濃度有關。第二節(jié)熒光檢測技術822、熒光檢測的方法有三類：1）直接用熒光性物進行檢測；2）利用非熒光物與熒光試劑進行反應，成為熒光性物質，再進行檢測；3）在熒光性物質中加入消光物質，測定熒光的減少量。一、鄰苯二甲醛熒光法測定氨基酸鄰苯二甲醛（OPT）作為一種熒光試劑，主要用于氨基酸、多肽和蛋白質的檢測方法。OPT+氨基酸、多肽和蛋白質