基因工程原理與技術思考題(完整資料)

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ChaｐterIＩntrｏduction基因工程原理與技術思考題(完整資料）(可以直接使用，可編輯優(yōu)秀版資料，歡迎下載）什么是基因？基因有哪些主要特點?基因是一段可以編碼具有某種生物學功能物質的核苷酸序列。①不同基因具有相同的物質基礎．②基因是可以切割的.③基因是可以轉移的.④多肽與基因之間存在對應關系.⑤遺傳密碼是通用的。⑥基因可以通過復制把遺傳信息傳遞給下一代。翻譯并解釋下列名詞genｅtiｃｅngiｎeeｒinｇ遺傳工程geｎeengineeｒing基因工程：通過基因操作，將目的基因或DNA片段與合適的載體連接轉入目標生物獲得新的遺傳性狀的操作。geneｍanipulaｔion基因操作：對基因進行分離、分析、改造、檢測、表達、重組和轉移等操作的總稱。ｒｅcombinaｎtDNAtecｈnique重組DNA技術genecloｎinｇ基因克隆:是指對基因進行分離和擴大繁殖等操作過程，其目的在于獲得大量的基因拷貝,在技術上主要包括載體構建、大腸桿菌遺傳轉化、重組子篩選和擴大繁殖等環(huán)節(jié)。molecularclonｉｎｇ分子克隆什么是基因工程？簡述基因工程的基本過程？p２ｐ４簡述基因工程研究的主要內容？ｐ５簡述基因工程誕生理論基礎p2和技術準備有哪些p３?基因表達的產物中，氨基酸序列相同時，基因密碼子是否一定相同？為什么？否,密碼子簡并性舉例說明基因工程技術在醫(yī)學、農業(yè)、工業(yè)等領域的應用。醫(yī)學:人胰島素和疫苗農業(yè):抗蟲BT農藥工業(yè):工程釀酒酵母ＣｈａpteｒⅡThetoolsoｆｔradｅ什么是限制性核酸內切酶?簡述其主要類型和特點?是一種核酸水解酶,主要從細菌中分離得到.類型特點p11II型核酸內切酶的基本特點有哪些p1２—１4?簡述影響核酸內切酶活性的因素有哪些p14?解釋限制酶的信號活性？抑制星號活性的方法有哪些？什么是DNA連接酶ｐ15？有哪幾類p１6?有何不同ｐ１６？什么叫同尾酶、同裂酶ｐ１2？在基因工程中有何應用價值？同裂酶:識別位點、切割位點均相同,來源不同。在載體構建方面往往可以取得巧妙的應用。應用較多的同裂酶比如Ｓma1和Xma1，它們均識別ＣCＣGＧG,但前者切后產生鈍末端，后者切后產生粘性末端同尾酶:來源各異，識別序列各不相同,但切割后產生相同的粘性末端。由同尾酶(isｏcａudomeｒ）產生的DNA片段,是能夠通過其粘性末端之間的互補作用彼此連接起來的。什么是DNＡ聚合酶？根據ＤNA聚合酶使用的模板不同,可將其分為哪兩類？各有什么活性？p17—18聚合酶：在引物和模板的存在下，把脫氧核苷酸連續(xù)地加到雙鏈ＤNA分子引物鏈的3‘－ＯH末端,催化核苷酸的聚合作用。依賴于DNA的DNA聚合酶依賴于RNA的DNＡ聚合酶TaqDNA聚合酶:是一種從水生嗜熱菌中分離得到的一種耐熱的dｎａ聚合酶,具有5－3聚合酶活性和３-５外切酶活性，在分子中主要用于ＰCR.逆轉錄酶：RNA指導的DNA聚合酶，Kleｎow片段的特性和用途有哪些？舉例說明。p1７名詞解釋：Ｓ1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、甲基化酶：甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護宿主

DNA

不被相應的限制酶所切割。什么是末端脫氧核苷酸轉移酶？舉例說明其應用之一。P１9加p什么是堿性磷酸酶？其在基因工程領域中有哪些用途？ｐ１9減p質粒單酶切點的基因連接如何降低本底和防止自我環(huán)化和提高連接效率？目的基因片段與載體由相同的單一限制性核酸內切酶消化酶切后,兩者的兩端均具有相同的黏性末端，成為單酶切位點的黏性末端。為了防止載體的自我環(huán)化，通常用堿性磷酸酶去除載體的粘性末端的5‘p以抑制DNA的自我環(huán)化。若構建表達載體選用雙酶切切割目的基因和載體,可使目的基因與載體的連接發(fā)生定向連接重組，以便定向克隆。gap缺口和nick裂口的區(qū)別？用寡核苷酸和銜接物DNＡ的短片段連接時為使基因內部的切點保護,常用何種辦法解決?哪些酶可用于DNＡ片段的末端標記？ＫlenｏwDNA聚合酶和T4或T７DNA聚合酶在對DNA片段進行末端補平反應或末端的置換反應時可引入標記的核苷酸.ChaptｅrⅢＨosｔandｖｅｃtors根據來源和性質不同，可將基因工程載體分為哪些種類?質粒載體、噬菌體載體、黏粒載體、噬菌粒載體、病毒載體、人工染色體什么是克隆質粒載體?什么是表達質粒載體？什么是穿梭質粒載體?克隆載體是指專用于基因或ＤＮＡ片段無性繁殖的質粒載體。表達質粒載體是指專用于在宿主細胞中高水平表達外源蛋白質的質粒載體。穿梭質粒載體是指一類由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇標記,因而可以在兩種不同的宿主細胞中存活和復制的質粒載體.基因工程中對載體的基本要求？具有復制子,能在宿主細胞內進行獨立和穩(wěn)定的自我復制.②具有合適的限制性內切酶位點。③具有合適的選擇標基因。④具有較多的拷貝數(shù),易于宿主細胞的染色體ＤNA分開，便于分離提純.⑤具有較小的相對分子質量,易于操作。什么是質粒？質粒分哪幾種?有哪兩種復制類型,質粒的分子生物學特性有哪些?質粒是染色體外能自我復制的小型DNA分子.嚴緊型和松弛型。①不親和性②轉移性質粒存在的三種形式是什么？共價閉合環(huán)狀DNＡ②開環(huán)ＤNA③線性DNA解釋質粒的不親和性和轉移性？不親和性：兩種不同質粒不能夠在同一宿主細胞系中穩(wěn)定地共存。轉移性:質粒從一個細胞轉移到另一個細胞的特性。接合型質粒和非接合型質粒.接合性質粒和非接合性質粒有何區(qū)別？接合型質粒：相對分子量大，除了攜帶自我復制遺傳信息外，還帶有一套控制細菌和質粒接合轉移的基因，嚴緊型質粒.非接合型質粒：相對分子量小，不能攜帶接合轉移基因。理想的質粒載體應具備哪些條件?具有較小的相對分子質量和較高的拷貝數(shù)。②具有多個單一限制性內切酶酶切位點。③具有兩種以上標記基因。④具有安全性。簡述pBR３２2質粒載體的主要特征?P25構建λ噬菌體載體的主要內容有哪些?為什么野生型的l噬菌體DＮA不宜作為基因工程載體?該如何改造？p２8插入型和取代型基因組大而復雜何為α－互補，在載體構建中有何作用？α-互補：指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)

段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β－半

乳糖苷酶（β—ｇalactoｓidase，由1０24個氨基酸

組成）陰性的突變體之間實現(xiàn)互補。α－互補是基于

在兩個不同的缺陷β-半乳糖苷酶陰性的突變體之

間可實現(xiàn)的功能互補而建立的。

將缺失編碼第1１—4１位氨基酸的β—半乳糖苷酶基

因稱為ｌacZ△M１５基因而將半乳糖苷酶基因（lacZ)

的調控序列和編碼β-半乳糖苷酶N端140個氨基酸

的序列稱為lacZ’．這兩個基因的產物單獨存在時

都無酶學活性,但混合在一起時卻有酶學活性.所以

在載體上加lacZ’/(MＳC),并在受體菌中引入laｃＺ

△M1５即可實現(xiàn)α-互補．IＰTG是lac操縱子的誘導

物,底物X－ｇaｌ被β—半乳糖苷酶分解后可以產生藍

色．如果質粒載體中插入了外源ＤNＡ，

laｃZ’的產

物則不能與lａｃZ△Ｍ１５基因的產物實現(xiàn)α-互補,在

IPTG誘導下不能產生有活性的β—半乳糖苷酶,菌

落便不可能呈現(xiàn)藍色。白色菌落便是含有插入了外

源ＤNＡ的重組質粒。因此可利用菌落顏色變化來篩

選插入外源ＤＮA的重組質粒。

這種方法是根據組織化學的原理來篩選重組體。主

要是在λ載體的非必要區(qū)插入一個帶有大腸桿菌β

-半乳糖苷酶的基因片段,攜帶有l(wèi)ac基因片段的λ

載體轉入lacˉ的宿主菌后，在含有5－溴-４-氯—3－吲哚—β－D-半乳糖苷（Ｘ—gal)平板上形成白色的噬

菌斑，非重組的噬菌體則為藍色噬菌斑。將外源性DNA克隆到-半乳糖苷酶失活的插入型入噬菌體上后，如何篩選重組噬菌體？簡述單鏈DNA噬菌體M13在基因工程中的主要用途？什么是Cos質粒？簡述其基本特點。什么是酵母人工染色體、細菌人工染色體、哺乳動物人工染色體？從哺乳動物中分離出復制起始區(qū)、端粒及著絲粒構建載體可以克隆大于1０0０Kｂ的DNＡ什么叫插入失活,舉例說明之。名稱來源特點用途Ｍ13噬菌體載體M13ｍｐ1是構建的第一個M13噬菌體載體，隨后構建的一系列Ｍ13載體都是在此基礎上經改建派生出來的.可用來克隆具有不同限制末端的外源DNA片段,而且克隆片段插入方向是固定的。１?？梢灾苽鋯捂淒NA進行ＤNA序列分析。2?？梢灾苽渲慌c外源DNA的任意一條鏈互補的DNA探針。3．可以在寡核苷酸介導的基因定點突變來制備含有目的基因的單鏈DNA模板。黏粒載體（cosmidveｃtor）先用特定的限制性核酸內切酶局部消化真核生物的ＤＮA，產生出高相對分子質量的外源DNＡ片段，與經同樣的限制性核酸內切酶切割過的黏粒載體線性DNA分子驚醒體外連接反應。1.具有λ噬菌體的體外包裝、高效感染特性。2。具有質粒載體的易于克隆操作。3.具有高容量的克隆能力。４.具有與同源序列的智力進行重組的能力?？梢钥寺⊥庠碊NA分子比較大的。酵母人工染色體由酵母的自主復制序列、著絲粒、四膜蟲的端粒、以及酵母的選擇性標記組成的能自我復制的酵母線性克隆載體。目前克隆最大DNＡ片段的載體。目前克隆最大ＤNA片段的載體。細菌人工染色體以細菌F因子為基礎構建的細菌克隆載體。除去了F因子的轉移去及整合區(qū)等非復制必須片段,并引入了多克隆位點及選擇標記BAC克隆容量可以達到3０0ｋｂ?？捎糜谡婧松镏匾蚣叭蚪M物理作圖、重要性狀基因的圖位克隆、基因結構及功能分析。ChａpteｒⅣThｅtechnｉｃalｐrｉnciplｅofgeneｔｉcmanipｕlation簡述提取基因組DＮA的主要步驟和原理?分離純化質粒的方法有哪幾種?簡述CsCl密度梯度分離法、堿變性法的原理，如何選擇合適的分離方法？簡述提取ＲNA常用的兩種方法和相關原理？列舉三種常用的核酸檢測方法和基本原理？簡述瓊脂糖－EＢ電泳法分離純化DNＡ的基本原理？名詞解釋：分子雜交、核酸雜交探針切口平移標記探針的主要步驟有哪些？簡述Southｅｒｎ印跡雜交的基本原理及其主要步驟?簡述Ｎｏrthern印跡雜交的基本原理及其應用？簡述Wｅsｔeｒn印跡的基本原理及其主要步驟?簡述Saｎgｅｒ堿基順序分析法的基本原理?簡述酵母雙雜交技術的基本原理和在基因工程中的應用?簡述酵母單雜交技術的基本原理和操作過程？什么是噬菌體展示技術？簡述其基本操作過程?什么是ＤＮＡ遷移率變動試驗？簡述其基本原理？什么是DＮaｓeI足跡實驗?簡述其基本原理?ＣhaｐterⅤPolyｍerasｅCｈaiｎＲeacｔiｏnTｅｃhｎolｏgyanｄAppｌication什么是PCR技術？簡述其基本原理?簡述PCR反應體系的主要成分與反應流程？簡述PCR引物設計的目的和一般原則？簡述提高PCR反應特異性的因素和措施？什么是巢式PCR、降落PＣR、反轉錄PCR？它們分別有哪些應用？簡述熒光定量PCR的基本原理?為什么在定量PＣR中要引入Ct值的概念？CｈaｐtｅrⅥＲNAｉandmｉRNＡｒeｇulation什么是RＮA干擾技術?簡述利用RＮA干擾技術沉默基因的基本原理和一般操作流程？什么是ｓiRNA?如何選擇siＲＮA靶位點？簡述獲得sｉRNA的途徑有哪些？ChaｐｔerⅦＯbｔａinｉｎgｏftargeｔgeｎｅ目的基因克隆時常用哪些方法分離和獲得基因?什么是基因文庫？簡述構建基因文庫常用的載體有哪些？什么是基因組文庫？簡述構建基因組文庫的一般步驟？什么是ｃＤNA文庫？簡述構建cDNA文庫的主要步驟？目的基因與載體的連接方法有哪些？各有哪些優(yōu)點?基因重組時在兩個酶切位點中其中有一個不相匹配時，你如何解決連接問題?如果目的基因的基因結構中有內含子存在，而且要采用原核表達系統(tǒng)，你應如何分離克隆基因？ＣhａpｔｅrⅧＲecoｍｂｉnationandgeｎetｒaｎsｆercDNA克隆較之基因組克隆的優(yōu)越性體現(xiàn)在哪里？試述T—A克隆法的原理和用途？基因工程宿主菌必需具備哪些特性？名詞解釋：受體細胞、感受態(tài)細胞、轉化、轉染、轉導簡述將重組DNA導入原核細胞的方法有哪些？簡述將重組DNＡ導入真核細胞導的方法有哪些？外源基因導入植物的方法？Ｔi質粒的結構特點?Ｔｉ質粒介導植物基因轉移的過程?ChapteｒⅨScrｅｅningandｉdentificatiｏnｏfrecombinaｎtcｌonｅs如何從所克隆到的基因重組載體中鑒定目的基因的存在和正確性重組子的篩選與鑒定主要有哪些方法？重組子的遺傳學檢測法主要包括哪兩類？簡述根據載體表型特征進行重組子篩選的常用方法及其基本原理？如何利用抗性標記基因篩選陽性克隆?名詞解釋:插入失活效應LａcＺ基因通常用于構建質粒載體的目的和原理?如何利用LaｃＺ標記基因篩選陽性克?。繄蟾婊驒z測法篩選重組子對報告基因有哪些基本要求？舉例說明重用的報告基因有哪幾種?ＣhａpｔerⅩExｐｒｅｓｓiｏnoｆclonｉｎgｇene大腸桿菌作為基因工程受體菌有哪些優(yōu)缺點？實現(xiàn)真核基因在大腸桿菌表達系統(tǒng)的正確表達需要哪些基本條件？名詞解釋：啟動子、終止子、SD序列、包涵體蛋白質包含體復性的方法有哪些?可使外源基因在大腸桿菌中高水平表達的啟動子應具備哪些條件？常用大腸桿菌表達載體有哪些？簡述λPＬ啟動子表達載體和T7噬菌體RNA聚合酶／啟動子表達載體的主要特征？原核表達系統(tǒng)常采用的啟動子有哪些？Laｃ、Tａc、tｒp啟動子各自有何特點？在大腸桿菌中表達外源基因的表達載體需具備哪些條件？利用大腸桿菌進行外源蛋白質主要有哪幾種表達部位？采用相應表達形式有何優(yōu)缺點?名詞解釋:融合基因、融合蛋白提高外源基因表達效率一般從那幾個方面進行考慮？從提高轉錄啟動效率及翻譯起始效率角度考慮，可通過哪些措施構建高效率表達載體,提高外源基因表達效率？避免外源基因表達蛋白被宿主細胞內源蛋白水解酶降解的主要措施有哪些?簡述大腸桿菌表達外源基因產物的檢測方法有哪幾種？與原核細菌相比，釀酒酵母做為外源基因表達受體菌有哪些優(yōu)點？酵母表達系統(tǒng)有哪些優(yōu)缺點?酵母基因表達系統(tǒng)主要有哪些基本結構?常采用的選擇標記基因有哪些？簡述酵母表達載體的種類和主要特征?甲醇酵母表達系統(tǒng)的主要特點？酵母DＮＡ轉化的方法有哪幾種？酵母菌的蛋白修飾分泌系統(tǒng)有哪些功能？對外源基因的蛋白表達有何作用？根據課堂討論題目擴增思考題目基因芯片技術的概念、原理和主要的應用?基因治療的概念與策略？基因治療的基本程序?轉基因動物的概念，顯微注射法制備轉基因動物的主要過程何謂動物克隆技術?有何應用價值？轉基因植物有哪些應用價值？基因工程技術在環(huán)境保護中的應用隨著科技的發(fā)展,人類在為自己生產出越來越多生活資料的同時,產生有害物質的數(shù)量和種類也大幅度增加,環(huán)境污染已遠遠超出了自然界微生物的凈化能力，已成為人們十分關注的問題.基因工程技術是在DNA分子水平上按照人們的意愿進行的定向改造生物的新技術.而利用基因工程技術提高微生物凈化環(huán)境的能力是用于環(huán)境治理的一項關鍵技術。這一技術發(fā)展到今天,正形成產業(yè)化并列為世界領先專業(yè)技術領域之一,廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工、農業(yè)、環(huán)保、能源和國防等許多部門,并日益顯示出其巨大的潛力。一、基因工程在廢水處理中的應用基因工程技術應用于廢水處理是水處理領域一項具有廣泛應用前景的新興技術。常規(guī)的廢水處理方法有物化法、生物法等。由于一般的物化方法只是污染物的轉移,不能從根本上治理，且容易造成二次污染,成本也較高，生物法逐漸成為廢水處理的主要方法。但是由于廢水的多樣性及其成分的復雜性，自然進化的微生物降解污染物的酶活性往往有限,如果能利用基因工程技術對這些菌株進行遺傳改造,提高微生物酶的降解活性，并可大量繁殖,就可以定向獲得具有特殊降解性狀的高效菌株,方便有效地應用于水污染處理。因此,構建基因工程菌成為現(xiàn)代廢水處理技術的一個重要研究方向,且日益受到人們的重視。基因工程技術在廢水處理中的應用有以下幾個方面。1、基因工程在環(huán)境污染監(jiān)測中的應用目前,聚合酶反應（簡稱PCR)技術和核酸探針技術是常用于水環(huán)境中微生物的檢測技術.PCR技術是一種在體外模擬自然DNＡ復制過程的核酸擴增技術，常用于監(jiān)測海洋環(huán)境中存在的微生物。標記的核酸探針可以用于待測核酸樣本中特定基因序列,如監(jiān)測飲用水中病毒的含量。PCR技術和核酸探針技術可能取代常規(guī)的水質分析,發(fā)展成為一種快速可靠水體微生物的檢測技術,并將在細菌、病毒及其他毒物檢測中得以迅速的應用發(fā)展。2、基因工程菌對水體中重金屬離子的生物富集利用基因工程菌代替普通微生物處理重金屬是近年來研究的熱點。基因工程技術在重金屬廢水治理中的作用主要體現(xiàn)在提高微生物菌體細胞對重金屬離子的富集容量以及提高菌體對特定重金屬離子的選擇性兩個方面.此法采用生物工程技術將微生物細胞中參與富集的主導性基因導入繁殖力強、適應性能佳的受體菌株內,大大提高了菌體對重金屬的適應性和處理效率。2.1提高重組菌重金屬離子的富集容量若不考慮重組菌對特定重金屬離子的選擇性而只要提高重組菌重金屬離子的富集容量，則通過在微生物細胞表面表達高容量金屬結合蛋白或金屬結合肽的方法就能很好地達到目的。另外,將經基因技術在菌體中表達的金屬結合蛋白分離后固定在某些惰性載體表面同樣也能達到重金屬離子高富集容量的目的.２.2同時提高重組菌的富集容量和對特定重金屬離子的選擇性通過特異性金屬轉運系統(tǒng)的表達，基因工程菌對目標重金屬的富集作用就介于特異性蛋白與目標重金屬之間才存在的生物親和力,具有很高的排他性,與生物吸附法的表面吸附特性完全不同,這就使有效回收利用廢水中重金屬離子，使廢水中重金屬元素實現(xiàn)再資源化成為可能.3、基因工程菌降解廢水中的有機污染物生物處理法是廢水中有機污染物降解的主要方法,但是部分難降解有機污染物需要不同降解菌之間的協(xié)同代謝或共代謝等復雜機制才能最終得以降解，這無疑降低了污染物的降解效率。首先,污染物代謝產物在不同降解菌間的跨膜轉運是耗能過程，對細菌來說這是一種不經濟的營養(yǎng)方式;其次，某些污染物的中間代謝產物可能具有毒性，對代謝活性有抑制作用。因此，將不同種屬、來源的細菌的降解基因進行重組，把分屬于不同菌體中的污染物代謝途徑組合起來以構建具有特殊降解功能的超級降解菌，可以有效地提高微生物的降解能力。4、絮凝降解高效基因工程菌處理染料廢水運用生物工程技術把降解菌的基因片段通過轉基因工程轉入絮凝菌株，培養(yǎng)出具有絮凝和降解雙功能基因的高效基因工程菌并應用于染料廢水的處理.

進一步的工作是繼續(xù)構建系列基因工程菌,篩選出絮凝—降解性能好、遺傳特性好和成本低的系列雙功能基因工程菌株。并將該技術應用于染料生產廢水的處理或其它領域。５、基因工程在水產養(yǎng)殖廢水處理中的應用伴隨著生物技術的發(fā)展,水產養(yǎng)殖業(yè)越來越多地運用生物工程技術來減少排放量和污染物數(shù)量。比如用微生物發(fā)酵生產和遺傳工程技術將合成特定氨基酸的基因克隆進入微生物的細胞質中，然后借助微生物的增殖來生產蛋白質魚類飼料，可以提高魚對飼料的利用率,降低氮的排泄物，減少中氮的濃度；利用生物篩選技術和基因工程培育一些去污能力強的植物（特別是藻類）和微生物來凈化水產養(yǎng)殖；利用生物工程對魚類進行生理修正，使魚類提高耐污能力和減少排泄物，比如Pheｌｐs培育的魚類對沙門氏菌屬形成抗體，這種魚類就可以在污染水體中生長。鄭耀通等對具有高效凈化水產養(yǎng)殖水體的紫色非硫光合細菌進行了分離和篩選，篩選出來的紫色非硫光合細菌既有很強的凈水能力，又是魚類的飼料。目前國內的研究主要集中在光合細菌在水產養(yǎng)殖水體凈化中的應用.６、轉基因水生植物治理工業(yè)廢水的重金屬污染根據一些藻類等水生物植物具有從水環(huán)境中大量積累重金屬離子的能力,利用基因工程消除水體中重金屬的污染。由北京大學生命科學院蛋白質工程國家重點實驗室研究成功的轉基因藍藻，可分別用于吸附并排除水域中重金屬鎘、汞、鉛、鎳污染,尤其是水稻、人參、中草藥、茶葉等多種出口產品的污染和城市工業(yè)污水、礦業(yè)污水、電鍍污水等，使其達到國際出口標準.此外，還可美化城市街道，防止環(huán)境再度污染。目前這項成果已經完成實驗室階段工作，可望盡快推廣應用。每公斤轉基因藍藻可吸附1０克以上的汞,已成為國家８６３項目和科技部九五重點攻關項目,并處于國際領先水平。二、基因工程在土壤污染中的應用由于人類的活動,使得污染物進入土壤并積累到一定程度，引起土壤環(huán)境質量惡化,對生物、水體、空氣和人體健康造成危害。相對于其他環(huán)境介質污染，土壤污染具有隱蔽性和潛伏性、長期性和不可逆性,并且土壤對污染物有富集作用。因此對于土壤污染的治理受到了廣大人民的關注。主要有以下幾方面.1、基因工程技術應用于含油土壤的治理落地油和含油污水對土壤造成了嚴重污染，大量的油泥,不僅造成嚴重的環(huán)境問題,同時也給石油行業(yè)造成重大的經濟損失。在生命科學已成為自然科學核心的今天，一批具有特殊生理生化功能的植物、微生物應運而生,基因修飾、改造、基因轉移等現(xiàn)代生物技術的滲透推動了污油土壤處理生物技術的進一步發(fā)展，因此,利用生物技術進行油污土壤治理，具有廣闊的應用前景.美國利用DＮＡ重組技術把降解芳烴、萜烴、多環(huán)芳烴、脂肪烴的4種菌體基因鏈接,轉移到某一菌體中構建出可同時降解4種有機物的“超級細菌”，用之清除石油污染，在數(shù)小時內可將水上浮油中的2/3烴類降解。在石油開采過程中，采出的原油含有大量水分,原油脫下的廢水中，含有大量的石油污染物.全向春引入現(xiàn)代生物技術，從一般的篩選工作，轉入到降解代謝途徑、降解酶系組成及其遺傳的控制機制上來，在此基礎上,實現(xiàn)定向育種，定向構建具有高效生物降解能力的基因工程菌?；蚬こ叹到庑矢?、底物范圍廣、表達穩(wěn)定,比自然環(huán)境中的降解性微生物更具競爭力，例如PCP10３菌株的構建?；蚬こ叹臉嫿ê蛻脤τ诿阑h(huán)境、保護人類健康提供了一系列可行的途徑.現(xiàn)代科學工作者把ＰCR技術用于基因工程菌的構建并已取得了一些成績，國內外正在進行這方面的研究.隨著生物技術的發(fā)展，基因工程菌在含油污水處理中的應用將會進一步完善，為人類造福.2、基因工程技術已成功開發(fā)出能吞食有毒廢棄物的細菌美國加利福尼亞大學的微生物學工作者培育出了一種以PＣＢs(聚氯聯(lián)苯）為食物的細菌。PＣＢs是一種污染環(huán)境的致癌物質，它不能被一般的自然過程破壞,這種從實驗室中培育成的細菌被認為是有效解決這一難題的工具.該大學的研究人員是將一種一般土壤細菌(惡臭假單胞菌)的兩個菌株的DNＡ進行交換，產生一種雜交的突變菌株。該基因交換菌株能破壞聯(lián)苯基，而聯(lián)苯基正是構成ＰＣBs分子的一個關鍵基因。它由兩個苯環(huán)組成的,有劇毒，在它們緊密結合時便成為潛在的致癌物。PCBs進入人體后,不能被人體的新陳代謝過程破壞，且能傳給下一代。這種物質也能長期保存在土壤中不會被分解.新培育出的這種兩個菌株的遺傳物質發(fā)生交換的突變菌株則能分解PCBs，可使這種有毒害的物質變成無害的物質—-—水、二氧化碳和鹽類。３、基因工程在治理土壤中重金屬污染的應用全球工業(yè)化導致大量的潛在毒性化合物釋放并進入生物圈,不僅對環(huán)境造成了污染，還會通過食物鏈對人體產生傷害。一般利用化學和物理方法清除土壤中重金屬的污染，通常因為成本太高和破壞環(huán)境而不被大規(guī)模應用.而通過植物修復來轉移，容納或轉化環(huán)境污染物可以達到清除污染物，治理環(huán)境的目的。植物修復技術是利用植物對重金屬的吸收、富集和轉化能力把土壤中殘存的重金屬吸收,富集到植物體內，然后收獲植物,從而減少土壤中重金屬的含量,實現(xiàn)環(huán)境修復的目標?？梢岳猛寥乐刑烊晃⑸镔Y源或人為添加的目的菌株,甚至是構建的特異降解功能菌株,將滯留的重金屬降解和轉化成無害的物質。三、基因工程在農業(yè)環(huán)保中的應用隨著科技的發(fā)展，人類在為自己生產出越來越多的生活資料的同時，也向大自然排放了越來越多的有害和難降解物質,例如：農藥、化肥等，這些物質正嚴重破壞環(huán)境和危害著人類的身體健康。因此,有意識地利用生物界中存在的凈化能力進行生物治理,已漸漸成為環(huán)境治理的主要手段?；蚬こ淘谵r業(yè)方面的應用前景是相當廣闊的，除、抗蟲害，還可能培育出能固氮的轉基因作物,能抗旱、抗寒的轉基因植物等.主要有以下幾個方面。1、基因工程技術應用微生物降解農藥農田長期過量施用農藥,嚴重破壞生態(tài)平衡，造成土壤水質及食品中殘留毒性增加，給人畜帶來潛在危害。因微生物在物質循環(huán)中的重要作用，因此對環(huán)境修復也有著重要作用，然而農藥(特別是難降解農藥)恰恰限制了微生物的降解能力。應用基因工程原理與技術，對微生物進行改造，構建高效的基因工程菌可以顯著提高農藥降解效率。利用環(huán)境微生物知識中對細菌中的農藥降解基因、降解途徑等許多農藥降解機制的闡述,可構建具有高效降解性能的工程菌。例如，現(xiàn)已開發(fā)出有凈化農藥（如DDT)，降解水中染料以及環(huán)境中有機氯苯類和氯酚類、多氯聯(lián)苯的基因工程菌”。農桿菌得到的OpdA（編碼有機磷降解基因)構建原核表達質粒，并轉到大腸桿菌正E.ｃoliDHl０B中表達，對其表達產物進行研究，發(fā)現(xiàn)OpdA能對幾種農藥有酶解作用。2、基因工程應用于生物替代合成農藥、化肥農作物在生長過程中容易受到致病菌及害蟲的影響，因此在作物種植過程中往往需要使用大量的農藥控制病蟲害，這是造成食物中農藥殘留及環(huán)境污染的主要原因。2．1微生物農藥代替合成農藥、化肥基因工程技術的發(fā)展,為防治農林害蟲提供了有效的新技術手段，微生物農藥因此在世界范圍受到廣泛重視。微生物農藥是指非化學合成,具有殺蟲防病作用的微生物制劑,如微生物殺蟲劑、殺菌劑、農用抗生素等,這類微生物包括殺蟲防病的細菌、真菌和病毒.微生物殺蟲劑對人畜安全無毒,不污染環(huán)境；殺蟲作用具有一定的特異性和選擇性，不會致死天敵和非目標昆蟲；易和其他生物手段結合綜合防治害蟲,維持生態(tài)平衡；由于殺蟲活性蛋白的多樣性，昆蟲產生抗性較緩慢;可以通過發(fā)酵法生產;生產成本較低；可以通過基因工程技術途徑篩選或構建優(yōu)良性能的菌株來滿足生產應用的需要等?？茖W工作者正在對固氮酶及國氮酶基因進行深入的研究，并利用基因工程技術對固氮酶基因進行修飾改造,一方面提高固氮菌的固氮能力，另一方面擴大能與固氮菌共生的作物種類。隨著基因工程技術的發(fā)展和對固氮菌分子生物學機理研究的不斷深入，將會有越來越多的農作物通過固氮菌的作用直接利用空氣中的氮氣。從而減少化學肥料的使用量.2．２轉基因農作物代替合成農藥、化肥利用基因工程技術使作物獲得抗病、抗蟲的能力是替代合成農藥最直接有效的方法.目前。已采用基因工程技術將各種抗病、抗蟲基因轉移到大豆、玉米和水稻等多種重要農作物中，利用轉基因植物自身的能力抵抗外界病、蟲的危害,達到減少農藥使用的目的。3、基因工程技術應用于植物，改善環(huán)境3．1基因工程技術應用于植物治理重金屬污染基因工程技術可用于改進一些生長快、生物量大的植物，使其對重金屬具有高的耐受性和富集能力。通過研究轉基因植物的修復能力，獲得可應用于重金屬污染治理的超富集植物新品種。3。2基因工程技術應用于植物治理持久性有機污染物近年來許多學者開展了有機污染土壤的植物修復研究和實踐,并取得了一定進展。目前,英國的一些生物學家已經培養(yǎng)出一種轉基因煙草,它們可以吸收土壤中的TＮＴ，然后把TNT轉化成對其他植物無害的物質，從而除去土壤中的污染。這些轉基因煙草植物的儲物基因來源于土壤中的一種細菌，這種細菌可以產生一種轉化TNT的酶?；蚬こ虖土曨}題型：名詞解釋(10個）3０分；填空（每空１分）20分；選擇題(每題1分）１0分；簡答題（4個）20分;論述題（2個）20分。第一章緒論1．名詞解釋：基因工程：按照預先設計好的藍圖,利用現(xiàn)代分子生物學技術，特別是酶學技術，對遺傳物質DNA直接進行體外重組操作與改造，將一種生物(供體）的基因轉移到另外一種生物（受體)中去，從而實現(xiàn)受體生物的定向改造與改良。遺傳工程廣義：指以改變生物有機體性狀為目標，采用類似工程技術手段而進行的對遺傳物質的操作,以改良品質或創(chuàng)造新品種。包括細胞工程、染色體工程、細胞器工程和基因工程等不同的技術層次。狹義:基因工程?？寺。簾o性（繁殖）系或純系。指由同個祖先經過無性繁殖方式得到的一群由遺傳上同一的DＮA分子、細胞或個體組成的特殊生命群體。2．什么是基因克隆及基本要點?３。舉例說明基因工程發(fā)展過程中的三個重大事件.A）限制性內切酶和ＤＮA連接酶的發(fā)現(xiàn)（標志著ＤNA重組時代的開始)；B)載體的使用；C）１９70年,逆轉錄酶及抗性標記的發(fā)現(xiàn)。4.基因工程研究的主要內容是什么？基礎研究：基因工程克隆載體的研究基因工程受體系統(tǒng)的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技術的研究應用研究:基因工程藥物研究轉基因動植物的研究在食品、化學、能源和環(huán)境保護等方面的應用研究第二章基因克隆的工具酶1.名詞解釋:限制性核酸內切酶：一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開的內脫氧核糖核酸酶.回文結構：雙鏈DＮＡ中的一段倒置重復序列，當該序列的雙鏈被打開后,可形成發(fā)夾結構。同尾酶:來源不同、識別序列不同，但產生相同粘性末端的酶。同裂酶:不同來源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的識別序列黏性末端：DNA末端一條鏈突出的幾個核苷酸能與另一個具有突出單鏈的DNA末端通過互補配對粘合，這樣的DNA末端，稱為粘性末端。平末端:DNA片段的末端是平齊的。限制性核酸內切酶的酶活性單位（U）：在酶的最適反應條件下，在50μｌ容積中,６0分鐘內完全切割１mgｌＤNA所需的酶量為1個酶活性單位（ｕnｉt或Ｕ)限制性核酸內切酶的星活性:指限制性內切酶在非標準條件下，對與識別序列相似的其它序列也進行切割反應,導致出現(xiàn)非特異性的DNA片段的現(xiàn)象。連桿（linkeｒ）：化學合成的8~12個核苷酸組成的寡核苷酸片段.以中線為軸兩邊對稱，其上有一種或幾種限制性核酸內切酶的識別序列,酶切后可產生一定的粘性末端，便于與具有相同粘性末端的另一DNA片段連接。銜接頭(aｄaｐtor）：化學合成的寡核苷酸，含有一種以上的限制性核酸內切酶識別序列。其一端或兩端具有一種或兩種內切酶切割產生的黏性末端。底物位點優(yōu)勢效應:酶對同一個DＮＡ底物上的不同酶切位點的切割速率不同。激酶：對核酸末端羥基進行磷酸化的酶.2．說明限制性內切核酸酶的命名原則要點。用屬名第一個字母和種名的頭兩個字母組成的３個字母斜體的略語表示寄主菌的物種名以及菌株（型）的代號命名。該菌株（種）中發(fā)現(xiàn)的不同的酶按照順序以羅馬字母編號I,IＩ,IＩＩ等.如：Eschｅrｉchiacoli用Eco表示。第四個字母代表菌株或株型、變種名，若酶存在于質粒上，則需大寫字母表示非染色體遺傳因子。例：HindＩII從流感嗜血菌株(ＨaemophilｕsInflｕｅnzuｅ)d株中分離的第三個酶。EcoRI表示基因位于Eschericｈｉａcoli中的抗藥性R質粒上。前三個字母用斜體,其他用正體表示.如果酶存在于一種特殊菌株中,三個字母后加上菌株名稱符號，名稱最后部分往往包含羅馬數(shù)字，表示在該特殊菌株中發(fā)現(xiàn)這種酶的先后次序。３。引起限制性核酸內切酶星活性的可能因素有哪些？若使用buffer不當,會有sｔarａcｔｉvitｙ，而ｓtaｒａcｔiviｔｙ是指限制酶對所作用的DＮＡ及序列失去專一性，當酶辨認切割位置的能力降低，導致相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用,而產生錯誤的結果。所以當DNＡ同時以兩種限制酶處理時，選擇可使兩種酶之活性反應均可達75﹪以上的rｅstrictionbuffeｒ，若找不到適當?shù)模猓鮢fer則先加低鹽的buffer使其中一酶作用后，在加入高鹽buｆfeｒ使另一酶作用，若無法以鹽的高低分別加入不同的bｕｆfer，則先加入一種bufｆer作用后,加3MNａOAc/95﹪aｌcoｈoｌ沉淀DＮA，再加另一種buffer作用。４．DNA片段之間的連接方式有哪些?具黏性末端的DNA片段之間的連接、具平末端ＤＮA片段之間的連接、DNA片段末端修飾后進行連接、DNA片段加連桿（linker）后的連接。5。什么是Ｋlenoｗ酶？有哪些活性?在基因工程中有什么作用？KlenowDＮA聚合酶是E．cｏliDNＡｐolymｅraseⅠ經蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解而從全酶中除去5’－－3’外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和３'--5’外切活性不受影響。也稱為Kｌｅnoｗ片段（Kｌｅnowｆragment）,或Ｅ．colｉDNA聚合酶Ⅰ大片段。5?￠３￠聚合酶3?￠５￠外切酶無小亞基活性6。DNA聚合酶、RＮA聚合酶、反轉錄酶、末端轉移酶、多核苷酸激酶和堿性磷酸酯酶有哪些主要特性?它們在基因工程中的主要用途分別是什么?第三章基因工程的載體１．名詞解釋：載體：指能夠運載外源DＮＡ片段（目的基因）進入受體細胞,具有自我復制能力，使外源ＤNA片段在受體細胞中得到擴增和表達,不被受體細胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類ＤNA分子.克隆載體:用于在受體細胞中進行目的基因擴增的載體.一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復制子。主要由細菌質粒或與其它質粒、噬菌體及真核生物病毒的DNA重組構建。表達載體：使目的基因在宿主細胞中得以表達的載體.可將重組體DNA導入適合的受體細胞,使所載的目的基因能夠復制、轉錄和翻譯.穿梭載體：稱雙功能載體（bｉfunctionaｌvectｏr）。能在兩種不同的生物體內復制的載體.質粒:指獨立存在于宿主細胞染色體外、能夠自我復制的DNA分子.松弛型質粒：拷貝數(shù)多于１0個的質粒。嚴謹型質粒；拷貝數(shù)為１至幾個的質粒.接合質粒；指質粒所攜帶的基因的功能是使細胞彼此有效地接觸,以便將質粒DNＡ從供體細胞轉移至受體細胞。如:質粒上的tra基因使宿主細胞（大腸桿菌）產生菌毛,合成細胞表面物質，促使宿主細胞與受體細胞接合.質粒的不親和性;顯性質粒;隱性質粒；質粒的遷移作用;多拷貝質粒；整合質粒;穿梭質粒；表達質粒；探針質粒；pUCl8質粒;pBR322質粒;溶菌生長；溶源生長；原噬菌體；烈性噬菌體；溶原化;柯斯載體或粘粒（coｓｍｉｄ）;cｏs位點；人工染色體2。作為工程載體必備哪些基本條件？3。試述質粒載體、噬菌體載體、柯斯載體、M１3單鏈絲狀噬菌體載體和酵母人工染色體載體各自的組成特點及其在基因工程中的應用.4．簡述質粒的生物學特性有哪些？5.構建人工質粒的目的?６.理想質粒載體應具備的條件及構建需遵循的原則是什么？7．λ-DNＡ作為載體的優(yōu)點是什么？8。為什么野生型的l噬菌體ＤＮA不宜作為基因工程載體？該如何改造？第四章目的基因的制備1.名詞解釋：目的基因；基因文庫ｃDNA文庫；2.常規(guī)分離目的基因的方法有哪些？其原理分別是什么？3.克隆目的基因的方法有哪些？4．什么是基因組文庫（genomiｃlibrarｙ)？構建基因組文庫的原理,涉及哪些基本過程？它同遺傳學上的基因庫、cDNA文庫有什么不同？第五章目的基因的導入和重組子的篩選1.名詞解釋：受體細胞;感受態(tài)細胞;轉化；轉導;轉染；體外裝配;轉換子；重組子；轉化率；負篩選；正篩選;ａ-互補篩選２。試述幾種常用的轉化方法。3。試述根據載體的選擇標記進行重組子篩選的方法和原理。試述根據插入序列的表型特征進行重組子篩選的方法和原理。5．DNA片斷之間的連接方式有哪些?各種連接方式的優(yōu)缺點及DNＡ重組中需要注意什么問題?6.受體細胞選擇的原則？第六章外源基因的表達1．名詞解釋:融合蛋白；分泌蛋白；包涵體；外源基因表達體系2．大腸桿菌表達載體構成的重要元件有哪些？3。試比較大腸桿菌、酵母、植物和動物細胞基因表達載體各自組成的特點.4.真核基因在大腸桿菌中表達存在的問題和高效表達的對策是什么?５.基因表達產物的檢測方法有哪些?第七章基因操作的基本技術1．名詞解釋：分子雜交；探針；PCＲ;引物；隨機引物；切口位移；熱啟動;缺口翻譯;Ｎorthｅｒn印跡;Soｕｔｈern印跡2.DNA制備的基本步驟有哪些？３．堿裂解法和CTAＢ法的原理。４.凝膠電泳有哪幾類?影響瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)有哪些？5。PＣR的基本原理是什么？PCＲ反應體系的組成成份是什么?6．試述PCR反應的程序及參數(shù)。7．PCR反應引物設計需遵循的原則有哪些？8.試述核酸分子雜交的類型和基本步驟。9.探針標記的方法有哪些？１0．說明Sｏｕtｈｅｒn雜交的原理和方法。11。Nｏrtheｒn印跡與Sｏｕtherｎ印跡有什么不同?第八章植物基因工程及應用1．植物遺傳轉化方法主要有？2.基因槍轉化的優(yōu)點？3.天然的Ti質粒能作為表達載體使用嗎?為什么？4．理想殺蟲劑應具備什么特性？第九章動物基因工程及應用1。名詞解釋：轉基因生物;共抑制效應；多效性胚胎干細胞2．轉基因共機制效應的特征？３。導致轉基因失活的原因可能有哪些？4.試述動物基因工程的載體有？5．如何篩選轉基因多效性干細胞?第十章醫(yī)學基因工程及應用1.名詞解釋:胰島素；基因診斷；基因治療；２。基因鑒定的作用？3。如何進行基因治療？基因工程原理練習題及其答案一、填空題1?；蚬こ淌莀___＿＿___年代發(fā)展起來的遺傳學的一個分支學科.２.基因工程的兩個基本特點是:（1)_____＿__＿＿＿_,（2)__＿______＿_。3．基因克隆中三個基本要點是：_____＿_____；＿_____＿＿_和___＿___＿__。４．通過比較用不同組合的限制性內切核酸酶處理某一特定基因區(qū)域所得到的不同大小的片段,可以構建顯示該區(qū)域各限制性內切核酸酶切點相互位置的_＿＿__＿_____。5．限制性內切核酸酶是按屬名和種名相結合的原則命名的,第一個大寫字母取自＿＿_____，第二、三兩個字母取自_______＿＿，第四個字母則用____＿＿_____表示。6．部分酶切可采取的措施有：（1)__＿＿__＿＿＿＿_＿(2）____＿__＿___（3）_______＿__＿等.7．第一個分離的限制性內切核酸酶是__＿______＿_；而第一個用于構建重組體的限制性內切核酸酶是＿_＿____＿___＿＿。８．限制性內切核酸酶BsuRI和HａeⅢ的來源不同,但識別的序列都是_＿___＿___,它們屬于___＿_________。9．DNA聚合酶I的Kｌeｎoｗ大片段是用__＿_____＿_＿__切割DＮA聚合酶I得到的分子量為76kDa的大片段,具有兩種酶活性：（1）____＿＿______；(2）_＿______＿____＿__的活性.10．為了防止DNA的自身環(huán)化,可用_＿____＿＿___＿_去雙鏈DNA＿___＿__＿＿_＿＿______。1１．EGTＡ是_____＿___＿__離子螯合劑。12．測序酶是修飾了的Ｔ7DＮA聚合酶，它只有_＿____＿______酶的活性，而沒有_______酶的活性。13．切口移位（nｉcktranslation)法標記DNA的基本原理在于利用__＿_＿____的______＿和＿_＿＿__的作用。1４．欲將某一具有突出單鏈末端的雙鏈ＤNＡ分子轉變成平末端的雙鏈形式,通?？刹捎胈___＿____或____＿_＿__＿＿_＿__.15．反轉錄酶除了催化ＤNＡ的合成外，還具有＿＿_＿_＿____＿_的作用，可以將ＤＮA—ＲNA雜種雙鏈中的___＿＿______水解掉。1６．基因工程中依據應用對象分有3種主要類型的載體：________＿_＿＿__＿、_＿____＿__＿_＿_、__＿________＿＿_。17.就克隆一個基因（ＤNA片段）來說，最簡單的質粒載體也必需包括三個部分:＿_________＿____、_＿______＿__＿_、_＿_＿__＿__＿_＿__。另外,一個理想的質粒載體必須具有低分子量。18。一個帶有質粒的細菌在有EB的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時間后，一部分細胞中已測不出質粒，這種現(xiàn)象叫.１9。ｐB(yǎng)R3２2是一種改造型的質粒,它的復制子來源于，它的四環(huán)素抗性基因來自于，它的氨芐青霉素抗性基因來自于。2０.ＹAC的最大容載能力是,BAC載體的最大容載能力是。21。ｐSＣl01是一種復制的質粒.22．pUCl8質粒是目前使用較為廣泛的載體。ｐUＣ系列的載體是通過和兩種質粒改造而來。它的復制子來自，Amp抗性基因則是來自。2３．噬菌體之所以被選為基因工程載體，主要有兩方面的原因：一是；二是。24.野生型的M１3不適合用作基因工程載體，主要原因是和.2５．黏粒(cｏｓｍiｄ)是質粒—噬菌體雜合載體，它的復制子來自、COS位點序列來自，最大的克隆片段達到kb。2６。野生型的l噬菌體DNA不宜作為基因工程載體，原因是:(1）(2）（3)。2７。噬菌粒是由質粒和噬菌體DＮＡ共同構成的，其中來自質粒的主要結構是，而來自噬菌體的主要結構是。2８.l噬菌體載體由于受到包裝的限制，插入外源DＮA片段后，總的長度應在噬菌體基因組的的范圍內。29。在分離DNA時要使用金屬離子螯合劑,如EDＴA和檸檬酸鈉等，其目的是.3０.用乙醇沉淀DＮA時，通常要在DNＡ溶液中加人單價的陽離子，如ＮaCl和NaＡc,其目的是.31．引物在基因工程中至少有4個方面的用途：（1）（2）（３）（4）。32．Clａｒk發(fā)現(xiàn)用ＴaqDNA聚合酶得到的ＰＣR反應產物不是平末端，而是有一個突出堿基末端的雙鏈DNA分子。根據這一發(fā)現(xiàn)設計了克?。蠧Ｒ產物的.33．在cDNＡ的合成中要用到Ｓ1核酸酶,其作用是切除在。34．乙醇沉淀ＤNA的原理是。3５．假定克隆一個編碼某種蛋白質的基因，必須考慮其表達的三個基本條件:(1)_＿＿＿＿____＿_＿＿__＿＿_____＿_______＿＿(２）___＿__＿__＿_____＿＿＿_______＿_＿_(３）__＿___________＿_＿_＿____＿＿________.３6.受體細胞的感受態(tài)是__＿_____＿＿__________＿___＿＿_＿_＿_____。3７．DNＡ重組連接的方法大致分為四種：（1)__＿________＿_(2）＿＿___＿＿_＿＿___＿＿(３)＿＿__＿__＿__＿__＿_____＿＿______(4）_________＿_______＿＿___＿____。３8.將含有外源基因組一個酶切片段的質粒稱之為含有一個__＿＿_＿__＿__，各種此類質粒的集合體稱之為構建了一個＿_＿____________＿_。３9．將含有一個mRNA的DＮA拷貝的克隆稱作一個_＿_____＿＿___，源于同一批ＲＮA制備物的克隆群則構建了一個____＿____________。40．只要知道基因組中某一特定區(qū)域的部分核苷酸組成,用________＿＿_可以將這段DＮA進行百萬倍的擴增。41．人工感受態(tài)的大腸桿菌細胞在溫度為___＿＿＿＿____時吸附DNA，__＿_______＿時攝人DNA。42.目前，在重組體的篩選中，已經發(fā)展了許多構思巧妙、具有極高準確性的篩選方法。大致可以分為:（1）________＿____＿_（2)__________＿____（3）____＿＿＿__＿____＿____(4)____＿________________＿__＿___等.43。PCR擴增篩選重組體是比較簡便的篩選方法,它適合于＿____＿_____＿___＿____＿_____＿。４4。核酸雜交探針可分為兩大類:ＤNＡ探針和RNA探針。其中DＮＡ探針又分為___＿＿_____探針和___＿＿_______＿＿_＿__探針。４5.如果用限制性內切核酸酶切割雙鏈ＤNA產生5'突出的黏性末端，則可以用＿___＿___＿＿進行3’末端標記.如果用限制性內切核酸酶切割DNA產生的是3’突出的黏性末端，可以用______＿＿___＿＿＿____進行3'末端標記。46．單鏈DＮA探針的標記可以采用下列方法：（1)_＿_______＿＿＿__＿__＿_＿_＿______＿_＿__＿__（2）＿__＿_＿_____＿__＿___________（３)_______＿_＿＿＿____＿_______＿___＿________。４７。根據Nｏｒｔｈeｒn雜交的結果可以說明：_____＿___＿＿_______＿________________＿_＿____。48.差示雜交(diffeｒenｔialhybｒidizａｔion）技術需要__＿＿＿____＿_______＿_____＿_＿_____＿_。４9.RＮA分子經凝膠電泳后按大小不同分開,然后被轉移到一張硝酸纖維素膜（尼龍膜）上，同一放射ＤNA探針雜交的技術稱__＿___＿___＿___＿__＿__＿_＿。50。在_______＿_＿_____＿技術中,DNA限制性片段經凝膠電泳分離后，被轉移到硝酸纖維素膜（或尼龍膜)上，然后與放射性的DNＡ探針雜交。51?？捎肨４DＮA聚合酶進行平末端的ＤNＡ標記，因為這種酶具有_________＿＿_和＿_＿＿_＿_的活性。５2。根據外源片段提供的遺傳表型篩選重組體，必需考慮三種因素：(1）_____________＿_（2)＿____＿＿__＿＿_＿__＿____＿___（３）____＿______＿＿_______＿＿.５３．Northerｎ印跡和Ｓouｔｈerｎ印跡有兩點根本的區(qū)別：（1）＿＿_______＿_________＿_______________＿_____＿__＿_＿_______＿___＿_＿_____＿____（２）__________＿_＿_＿_＿＿___＿_____________＿＿_＿_______＿_＿＿_＿____＿____＿_____＿＿＿_.５4.放射免疫篩選的原理基于以下三點：(1）_____＿_____＿＿＿_＿______＿_＿__＿______(２）＿_＿__＿____＿_＿_____＿___＿_＿__（3）_＿_＿＿＿＿＿___＿__＿_＿_____＿___＿___＿_＿＿。

答案１。702．(1）分子水平上的操作;(２）細胞水平上的表達3.克隆基因的類型；受體的選擇;載體的選擇4．限制性酶切圖譜５．屬名的第一個字母;種名的前兩個字母；株名6。(1）減少酶量；（2）縮短反應時間;(3）增大反應體積７．EｃoK；EcｏＲl８．GGCＣ;異源同工酶9．枯草桿菌蛋白酶;(1）5'—3’合成酶的活性;（2）３’－5＇外切核酸酶10。堿性磷酸酶；５’端的磷酸基團１１.Cａ2+1２.5＇—3’合成;3’-5’外切１3.DNA聚合酶I:５’一3’外切核酸酶；5'一3’合成酶14．S1核酸酶切割;DNＡ聚合酶補平１5．核酸水解酶H；RNA16．質粒DNA；病毒DNＡ;質粒和病毒ＤＮＡ雜合體1７。復制區(qū)：含有復制起點；選擇標記:主要是抗性基因；克隆位點:便于外源DNA的插入１8.質粒消除（或治愈)19，pMBl；pＳCl０1；pSＦ2124(Ｒ質粒)2０.1000kｂ；300kb21。嚴緊22．ｐB(yǎng)Ｒ322和M１3；pMＢl;轉座子2３．它在細菌中能夠大量繁殖，這樣有利于外源DNＡ的擴增;對某些噬菌體(如l噬菌）的遺傳結構和功能研究得比較清楚,其大腸桿菌宿主系統(tǒng)的遺傳也研究得比較詳盡24.沒有合適的限制性內切核酸酶識別位點；選擇標記25．質粒;l噬菌體；４5２6.(1）分子量大,(2)酶的多切點，（3)無選擇標記27．復制區(qū)；IＧ區(qū)28．7５％～105%29．螯合Mｇ2+離子,抑制核酸酶的活性30．中和DNA分子的負電荷，增加DＮＡ分子間的凝聚力31.（1)合成探針;(2)合成cＤNA；(3）用于PCＲ反應；（4)進行序列分析３2.T—載體３3．第二鏈合成時形成的發(fā)夾環(huán)?３4。乙醇使DNA分子脫水35.（1)保持正確的可讀框（2）能夠使其轉錄的啟動子(3）具有翻譯的起始和終止信號36.接受外源DNA的生理狀態(tài)3７。（1）黏性末端連接；（２）平末端連接;（3)同聚物接尾連接；（4）接頭連接法38.基因組DＮA克??；基因組DＮA文庫３９.cDNA克隆；cDNA文庫40．聚合酶鏈式反應(PCR)４1.0°Ｃ；42°C42．（１)遺傳學方法；(２)物理篩選法；（３)核酸雜交法；(4）表達產物分析法43．插入外源片段的種類較多,大小又極為相似的重組體的篩選４4.基因組DNA；cDNA45．Klenｏw酶填補的方法；T4DNA聚合酶4６．（1）用Ｍ13噬菌體載體合成單鏈ＤNA探針；(2）從mRＮA反轉錄合成單鏈cDＮA探針;（3)用不對稱PCR合成單鏈ＤNA探針4７．外源基因是否進行了轉錄４８.兩種不同的細胞群體能夠表達不同的基因，即在一個群體中能夠表達一些基因，而在另一個細胞群體中不能表達這些基因４９．Ｎoｒthｅrｎ印跡50．Southern印跡51．5’?３’合成酶;3’?５’外切核酸酶52．（１）克隆的是完整的基因；（2)使用的是表達載體；（３）不含內含子53．（1)印跡的對象不同：Norｔhern是ＲNA,Ｓｏuthern是DNA；(2）電泳條件不同,前者是變性條件，后者是非變性條件５４.（１)抗體能夠被吸附到固體支持物上;（2)同一個抗原可以同幾種抗體結合；(３)抗體能夠被標記

二、選擇題(單選或多選）1。因研究重組DNA技術而獲得諾貝爾獎的科學家是（）（a）Ａ。Koｒnｂerg（ｂ)W。Gilｂert（c)P。Berg（d）B.McCｌｉntｏcｋ２。第一個作為重組ＤNA載體的質粒是（）(a）pBR322（ｂ)ColＥl(c）pSCl01(d)pUCl83．關于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質，下列描述中只有（）不太恰當。（a）由作用于同一DNＡ序列的兩種酶構成（b）這一系統(tǒng)中的核酸酶都是Ⅱ類限制性內切核酸酶（ｃ)這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過甲基化作用對DNA進行修飾(ｄ）不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制-修飾系統(tǒng)4.Ⅱ型限制性內切核酸酶：(）（a)有內切核酸酶和甲基化酶活性且經常識別回文序列（ｂ)僅有內切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供（c)限制性識別非甲基化的核苷酸序列(ｄ）有外切核酸酶和甲基化酶活性(e）僅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供5．下面有關限制酶的敘述哪些是正確的？（）（a）限制酶是外切酶而不是內切酶（b)限制酶在特異序列（識別位點）對ＤＮA進行切割(c）同一種限制酶切割DNA時留下的末端序列總是相同的（ｄ）一些限制酶在識別位點內稍有不同的點切割雙鏈DNＡ，產生黏末端（e)一些限制酶在識別位點內相同的位置切割雙鏈DNA,產生平末端6.第一個被分離的Ⅱ類酶是：（）(a)EｃｏK（b）HｉndⅢ（c）ＨindⅡ(d）EｃoＢ7．在下列進行DＮＡ部分酶切的條件中，控制那一項最好？(）（a）反應時間（b）酶量（c）反應體積(d)酶反應的溫度8．在下列試劑中,那一種可以螯合Ｃa2＋離子?(）(a）EＤTA(ｂ)檸檬酸鈉(c)SDS（ｄ）EGＴA9．在下列工具酶中，那一種可以被EGTＡ抑制活性?（）(a）S1單鏈核酸酶（b)末端轉移酶(c）堿性磷酸酶(d)Bal31核酸酶１０．限制性內切核酸酶可以特異性地識別：()（a）雙鏈ＤNＡ的特定堿基對(b)雙鏈DＮＡ的特定堿基序列（ｃ）特定的三聯(lián)密碼（d)以上都正確１1.下列關于限制性內切核酸酶的表示方法中，正確一項的是(）。(a)Saｕ3AI（b)E。coＲI(c）hindIII(ｄ)Sau3Ａ1１2．限制性內切核酸酶的星號活性是指：()（a)在非常規(guī)條件下,識別和切割序列發(fā)生變化的活性。(b）活性大大提高(c)切割速度大大加快(d)識別序列與原來的完全不同13．下面哪一種不是產生星號活性的主要原因？（）(a)甘油含量過高(b）反應體系中含有有機溶劑(c）含有非Mｇ2＋的二價陽離子（d)酶切反應時酶濃度過低14．關于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質，下列描述中只有（）不太恰當（ａ)由作用于同一DNＡ序列的兩種酶構成(ｂ)這一系統(tǒng)中的核酸酶都是Ⅱ類限制性內切核酸酶(c）這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過甲基化作用對ＤNＡ進行修飾（d）不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制-修飾系統(tǒng)15．在長模板鏈的指導下引物延伸合成長的DNA互補鏈時應選用（）（a）T4DＮA聚合酶（b)Klenow酶。（c）大腸桿菌ＤＮA聚合酶I(d)T7DNA聚合酶16．末端轉移酶是合成酶類，（)（a)作用時不需要模板（ｂ）在Ca2＋的存在下，可以在突出的3，末端延長ＤNＡ鏈(c)在Ca2+的存在下，可以在隱蔽的3，末端延長DＮA鏈（ｄ）上述說法有兩種是正確的17．在基因工程中，可用堿性磷酸酶（）(a)防止ＤNＡ的自身環(huán)化（b)同多核苷酸激酶一起進行ＤNＡ的5，末端標記（c）制備突出的3，末端（ｄ)上述說法都正確1８．下列酶中，除（)外都具有磷酸酶的活性（a)λ核酸外切酶（ｂ）外切酶Ⅲ（c）單核苷酸激酶(ｄ）堿性磷酸酶19。下列哪一種酶作用時需要引物？()(a）限制酶（b）末端轉移酶(c)反轉錄酶（d）DNA連接酶20．S1核酸酶的功能是（)（a）切割雙鏈的DNＡ（b）切割單鏈的RNA（c）切割發(fā)夾環(huán)(d）以上有兩項是正確的21。Klｅnoｗ酶與DＮA聚合酶相比,前者喪失了(）的活性.（a）5,——３，合成酶，(b)3，-—5，外切酶(c）5，-－-3,外切酶(d)轉移酶22．下面關于松弛型質粒(relaxedｐlasmiｄ）性質的描述中，()是不正確的(a)質粒的復制只受本身的遺傳結構的控制,而不受染色體復制機制的制約,因而有較多的拷貝數(shù)(b）可以在氯霉素作用下進行擴增(c)通常帶有抗藥性標記(ｄ）同嚴緊型質粒融合后，雜合質粒優(yōu)先使用松弛型質粒的復制子23。基因工程中所用的質粒載體大多是改造過的，真正的天然質粒載體很少,在下列載體中只有（）被視為用作基因工程載體的天然質粒載體(a）pBR３２２(b)pSＣl０1（c)pＵBｌｌ0（d）ｐUCl824。下列哪種克隆載體對外源DNA的容載量最大?（)（a）質粒（b）黏粒（c)酵母人工染色體(YAC）(d）l噬菌體(e）cＤNA表達載體２5。松弛型質粒：（)（ａ）在寄主細胞中拷貝數(shù)較多（b）可用氯霉素擴增(c）一般沒有選擇標記（d)上述(a）、(b)兩項正確2６．CｏｌEｌ是惟一用作基因工程載體的自然質粒,這種質粒:（)（a）是松弛復制型（b)具有,四環(huán)素抗性(c）能被氯霉素擴增（d)能產生腸桿菌素27。同一種質粒ＤNA，以三種不同的形式存在，電泳時，它們的遷移速率是：（）(a）OCDNA>ＳCＤNA>ＬＤＮA（b)SCDNA〉ＬDNＡ〉OCＤNA(c）LDＮA〉ＯＣＤNA>SCDNA(d)SＣDNA>ＯCDNＡ＞LDＮA28．ｐＢＲ322是一種改造型的質粒,含有兩個抗性基因,其中四環(huán)素抗性基因來自：()(a）CoｌEl（b）Rｉ質粒（c)pSCl01(d)pＵＣl82９．關于穿梭質粒載體，下面哪一種說法最正確？(）（ａ）在不同的宿主中具有不同的復制機制(b）在不同的宿主細胞中使用不同的復制起點（c)在不同的宿主細胞中使用不同的復制酶(d)在不同的宿主細胞中具有不同的復制速率30．能夠用來克隆3２ｋb以下大小的外源片段的質粒載體是(）（ａ)charomｉd(ｂ）pｌａsmid（C）cｏsｍid(d)phagｅｍid31。第一個作為重組DNA載體的質粒是()（a)pBR3２2(b)ColEl(c）ｐSＣl０1(d)pUCl8３2．Ti質粒:()（a)可從農桿菌轉到植物細胞中（b)作為雙鏈ＤNA被轉移(c）在植物中導致腫瘤(ｄ)介導冠癭堿的合成，作為細菌的營養(yǎng)物和植物的生長激素（e）需要細菌的ｖiｒ基因幫助轉移（f)在植物細胞中作為染色體外質粒33．黏粒(cosmｉｄ)是一種人工建造的載體，(）（ａ)它具有COS位點，因而可進行體外包裝（ｂ)它具有質粒DNA的復制特性(c）進入受體細胞后,可引起裂解反應（d）進入受體細胞后,可引起溶源化反應34．有兩種確定核酸中核苷酸序列的方法：化學序列分析法(Maxam-Gｌｂerｔ）和酶學序列分析法(Sanｇer）.酶學測序法的基本原理/優(yōu)點是：（）（a）堿基與特殊染料間不同的相互作用（b）一個合成引物的延伸和ＤＮA修復合成的可靠終止（c）限制性位點與ＤNA末端標記的相關性（ｄ）可同時對DＮA雙螺旋的兩條鏈進行測序（ｅ)反應是DNA特異的,ＲNＡ不會帶來干擾。這樣既減少純化步驟，也節(jié)約了開支。35．關于cDNA的最正確的說法是：(）（a)同mRNA互補的單鏈DNA（ｂ）同mRＮA互補的雙鏈ＤNA（c）以mRＮA為模板合成的雙鏈DＮA(d）以上都正確3６．用堿法分離質粒DNＡ時，染色體DNA之所以可以被除去，是因為:（）(ａ）染色體DNA斷成了碎片(b）染色體DNA分子量大,而不能釋放(c）染色體變性后來不及復性（d)染色體未同蛋白質分開而沉淀37.關于堿解法分離質粒ＤＮA，下面哪一種說法不正確？()(a）溶液I的作用是懸浮菌體(ｂ）溶液Ⅱ的作用是使DNA變性(c)溶液Ⅲ的作用是使DNA復性(d）質粒DＮA分子小，所以沒有變性，染色體變性后不能復性3８。Clark做了一個有趣的實驗，發(fā)現(xiàn)ＴaｑDNA聚合酶可以不需要模板,在雙鏈DNA的末端加一個堿基,主要是加(）。（ａ)dＧTP(ｂ）dATP（c）ｄCTP（d）dTＴP３９．根據構建方法的不同,基因文庫分為基因組文庫、cDNA文庫等。在下列文庫中,()屬cDNＡ文庫（a）ＹAC文庫（b)MＡC文庫(c）扣減文庫（d）BAC文庫4０.下面關于多克隆位點（multipｌecｌoｎesite，MCS)的描述，不正確的—句是()（a)僅位于質粒載體中（b)具有多種酶的識別序列(c)不同酶的識別序列可以有重疊(d）一般是人工合成后添加到載體中4１．在cDＮA技術中，所形成的發(fā)夾環(huán)可用（)(a）限制性內切核酸酶切除(b)用31外切核酸酶切除(c)用S1核酸酶切除（ｄ）用51外切核酸酶切除42．在DNＡ的酶切反應系統(tǒng)中，通常：()(a)用SＳＣ緩沖液(b)加入Mｇ２+作輔助因子(c）加入BSA等保護劑(d）上述說法中，有兩項是正確的43。黏性末端連接法，不僅操作方便，而且（）（a)產生新切點（b)易于回收外源片段（c）載體不易環(huán)化（d）影響外源基因的表達４4．在下列表型中，()是基因工程上理想的受體菌表型（a）ｒ+m＋rec*(b）r—ｍ-rｅｃ－(C）r—m—reｃ＋(d)ｒ＋ｍ+rec-45．關于DNA接頭在基因工程中的作用,下列說法中哪一項不正確?(）（a）給外源ＤNA添加適當?shù)那悬c（b）人工構建載體（c）調整外源基因的可讀框（d)增加調控元件４6.cＤNA文庫包括該種生物的（）(a）某些蛋白質的結構基因(b)所有蛋白質的結構基因（ｃ)所有結構基因（d）內含子和調控區(qū)47.下列關于建立cＤNＡ文庫的敘述中，哪一項是錯誤的？（)（a）從特定組織或細胞中提?。腘A或ＲNA（b）用反轉錄酶合成ｍRＮA的對應單鏈ＤNA(c）以新合成的單鏈ＤNA為模板合成雙鏈DＮA（d)新合成的雙鏈ＤNA甲基化４８．下列對黏性末端連接法的評價中，哪一項是不正確的？()(a）操作方便(b)易于回收片段(c)易于定向重組（ｄ）載體易于自身環(huán)化，降低重組率４９．關于感受態(tài)細胞性質的描述,下面哪一種說法不正確?（）（功具有可誘導性(b)具有可轉移性(c)細菌生長的任何時期都可以出現(xiàn)（d）不同細菌出現(xiàn)感受態(tài)的比例是不同的5０．下面關于用T4多核苷酸激酶標記5＇端制備探針的描述中(）是不正確的。（a)既能標記DＮＡ,又能標記ＲＮA（b）既能標記雙鏈DNA又能標記單鏈DNA（c)只能標記突出的5＇端不能標記其他類型末端(d)DNA或RNA必須有5'—OH的存在５1．Sｏｕｔheｍ印跡的DＮＡ探針（）雜交.（a)只與完全相同的片段（b）可與任何含有相同序列的DＮＡ片段(c）可與任何含有互補序列的DNA片段’.（d)可與用某些限制性內切核酸酶切成的DNA片段(e)以上都是5２．用下列方法進行重組體的篩選,只有()說明外源基因進行了表達.(a)Soutｈem印跡雜交（ｂ）Ｎortｈem印跡雜交（c)Weｓtern印跡（ｄ)原位菌落雜交53．下列哪一個不是Souｔheｒn印跡法的步驟？()（ａ）用限制酶消化ＤNA(a)DＮA與載體的連接（c)用凝膠電泳分離ＤNＡ片段（ｄ)ＤNA片段轉移至硝酸纖維素膜上(ｅ）用一個標記的探針與膜雜交54。報告基因（）(a)以其易于分析的編碼序列代替感興趣基因的編碼序列（b）以其易于分析的啟動子區(qū)代替感興趣基因的啟動子區(qū)(c）能用于檢測啟動子的活性（d）能用于確定啟動子何時何處有活性55．在利用ｌacZ失活的顯色反應篩選法中,IＰTＧ的作用是（）（a）誘導宿主的α肽的合成（b)誘導宿主的ω肽的合成（c）作為酶的作用底物(d)作為顯色反應的指示劑56.切口移位是指在()作用下，使（)帶上放射性標記。（ａ）DNA聚合酶I,RNA(b）DNA聚合酶I,DNＡ(c)DＮA聚合酶Ⅲ，ＲNA（d）ＤNA聚合酶Ⅲ,DＮA57．用于核酸分子雜交的探針可以是放射性標記的（）（a）DNA(ｂ）RNＡ（c)抗體(d）抗原58．Sｏｕtｈｅrｎ印跡是用DNA探針檢測DNA片段，而Northern印跡則是:（