免疫組織化學及相關技術之鏈霉親和素－過氧化物酶法

《免疫組織化學相關技術》鏈霉親和素-過氧化物酶法

（SP法）一、實驗目的

掌握免疫組化染色的原理及步驟1

了解免疫組化實驗的設計及問題解決方法2

利用抗原（antigen,Ag），抗體（antibody）特異結合的原理，用已知抗體檢測未知抗原的一種方法。免疫組織化學原理

二、SP法基本原理（streptavidin-perosidase）

即鏈霉親和素-過氧化物酶連結法：（鏈霉抗生物素、鏈霉卵白素）抗原

＋

一抗

＋

生物素標記的二抗

＋HRP標記的鏈霉抗生物素蛋白（三抗）

＋DAB底物反應，顯色棕色底物HRP標記的鏈霉親和素生物素偶聯(lián)的二抗一抗抗原三、SP法優(yōu)點可檢測酶、多肽、蛋白質、蛋白多糖、激素等多種物質。三步法，同一試劑盒（含二抗、三抗、底物）可檢測多種抗原原位顯示可對檢測物質初步定位可半定量。淡黃－棕黃－深棕色，陽性細胞數。四、SP染色注意事項載玻片的處理（多聚賴氨酸等粘附劑）選擇對照(陽性對照、陰性對照、空白對照、自身對照）消除假陽性、假陰性染色過程不能干片抗體的選擇（選擇購買試劑）一抗最佳濃度的確定：預實驗，濃度梯度抗原的修復（酶/熱修復等，根據試劑說明書）顯色時間的控制：2-5min，鏡下觀察控制抗體的選擇和處理一抗特異性：物種（鼠抗人）單克隆抗體二抗特異性：先用二抗動物來源血清封閉羊抗鼠二抗，羊血清封閉三抗特異性：卵白素－生物素阻斷某些組織中的內源性生物素，如腎、肝等。底物反應的特異性：H2O2處理，阻斷某些組織中的內源性過氧化物酶

A.DDX27——表達于細胞核；B、IP3R3——表達于胞漿可檢測某物質在細胞中的分布情況。SP法結果:A.p53在消化道腺癌中的表達B.p53在正常癌旁組織中的表達可檢測同一物質在不同組織中的表達情況。SP法結果:（一）染色前石蠟組織切片的準備

取材與固定（4%多聚甲醛）脫水、透明與浸蠟包埋切片烤干（暫時不用時低溫干燥保存）SP法具體實驗步驟1.脫蠟至水（同HE染色）二甲苯Ⅰ二甲苯Ⅱ100％酒精Ⅰ100％酒精Ⅱ95％酒精Ⅰ95％酒精Ⅱ80％酒精70％酒精蒸餾水

7’7’7’7’3’2’2’2’1′

（二）SP法染色流程SP法具體實驗步驟PBS3%過氧化氫PBS山羊抗血清一抗PBS二抗PBS三抗

3m*38′

3m*38′37℃

50’3m*312′3m*312′（二）SP法染色流程勿洗PBS自來水沖洗DAB顯色蘇木精復染脫水返藍透明

3m*31′1’10‘封片SP法具體實驗步驟畫圈1.蘇木精復染1min,返藍10min2.脫水，透明，封片95％酒精Ⅰ、Ⅱ各1′100％酒精Ⅰ、Ⅱ各1′二甲苯Ⅰ、Ⅱ各1′中性樹膠封片顯微鏡觀察蘇木精復染后續(xù)SP法具體實驗步驟HE染色基本過程1.脫蠟：二甲苯Ⅰ

→二甲苯Ⅱ

2.復水:100%乙醇Ⅰ→100%乙醇Ⅱ→95%乙醇Ⅰ→95%乙醇Ⅱ→80%乙醇→70%乙醇→蒸餾水3.染蘇木精4.分化與返藍：鹽酸酒精分化→流水返藍5.脫水：蒸餾水→70%乙醇