植物細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法

植物細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法植物細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法共10頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!細(xì)胞凋亡（apoptosis）是指機(jī)體在一定的生理、病理?xiàng)l件下，為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，通過(guò)基因控制而使細(xì)胞主動(dòng)有序地死亡，且表現(xiàn)一系列形態(tài)和生化方面的特征。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞正常的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等作用，不造成炎癥和自體的損傷，是細(xì)胞為了更好地適應(yīng)自下而上環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的死亡過(guò)程。因這一死亡過(guò)程嚴(yán)格受到程序的控制，又稱為細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD)。與凋亡不同，細(xì)胞壞死是指細(xì)胞在各種致?lián)p傷因素的作用下無(wú)序死亡的過(guò)程，形態(tài)特征為細(xì)胞脹大，特別是細(xì)胞器腫大，胞膜破裂，胞漿內(nèi)容物外泄，而核變化較慢，DNA降解不充分，局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)等。植物細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法共10頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!近年來(lái)有不少綜述著作分別介紹了植物發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞凋亡、環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、植物細(xì)胞凋亡的機(jī)理及發(fā)育調(diào)控、在植物發(fā)育中的細(xì)胞凋亡作用、植物細(xì)胞凋亡與活性氧及抗氧化代謝的關(guān)系等，但對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法則很少報(bào)道。本文主要如要從以下方面對(duì)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的技術(shù)加以闡述。形態(tài)學(xué)觀察法生化及分子生物學(xué)法免疫學(xué)方法生理學(xué)檢測(cè)法植物細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法共10頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!二、生化及分子生物學(xué)法1.梯狀條帶法

細(xì)胞凋亡時(shí)，在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下，染色質(zhì)DNA在核小體間被切割成50-300kb長(zhǎng)的DNA片段，或180-200bp整倍數(shù)的單或寡核苷酸片段，在凝膠電泳時(shí)表現(xiàn)為特征性的梯形帶。對(duì)于壞死細(xì)胞的DNA而言，基因組DNA的降解隨機(jī)發(fā)生，在電泳膠上只能檢測(cè)到連續(xù)分布的DNA條帶。本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便易行，定性準(zhǔn)確，并可進(jìn)行定量檢測(cè)。但無(wú)法顯示組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，也不能反映凋亡細(xì)胞與周圍組織的關(guān)系。植物細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法共10頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!3.caspase活性檢測(cè)法caspase（胱冬酶）是一類半胱氨酸蛋白酶，同時(shí)具有半胱氨酸和天冬氨酸裂解位點(diǎn)，它已被證明在動(dòng)物的細(xì)胞凋亡中起著極其重要的作用，在植物中有可能也存在此類物質(zhì)。因此，可以把檢測(cè)caspase的活性作為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的輔助手段。植物細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法共10頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!2.細(xì)胞色素c釋放的檢測(cè)法在植物細(xì)胞凋亡的初期也檢測(cè)到細(xì)胞色素c的釋放，因此也可以用細(xì)胞色素c的釋放情況作為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的手段。3.多聚ADP核糖聚合酶降解情況檢測(cè)法多聚ADP核糖聚合酶在DNA修復(fù)中起著重要作用，它是caspase-3的底物，近年來(lái)有不少證據(jù)證明PRPP的降解是植物細(xì)胞凋亡的特征之一。PRPP被caspase-3水解后形成相對(duì)分子質(zhì)量分別為85000及25000的2個(gè)片段，用運(yùn)載相對(duì)分子質(zhì)量為85000片段的抗體可以觀察細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。植物細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法共10頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!一、形態(tài)學(xué)觀察法

凋亡細(xì)胞的主要特征為核染色質(zhì)致密，形成致密塊，有時(shí)可碎裂。在組織中凋亡細(xì)胞常以分散單個(gè)形式存在，凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離，不引起炎癥反應(yīng)。因此，可以對(duì)組織切片或細(xì)胞懸液進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察?？捎萌缦路椒ㄟM(jìn)行觀察：普通光鏡觀察法活細(xì)胞懸滴熒光染色鏡檢法凋亡小體電鏡觀察法等

在普通光學(xué)顯微鏡下很難獲得滿意效果；熒光顯微鏡檢測(cè)雖然簡(jiǎn)便易行，但其定量、定位并不可靠。而用透射電鏡可以觀察到凋亡不同時(shí)期的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，可對(duì)細(xì)胞凋亡提供最確切的證據(jù)。植物細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法共10頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!2.原位末端標(biāo)記法

原位末端標(biāo)記法的基本原理，是將滲入到凋亡細(xì)胞中的外源性核苷酸在酶的催化下與凋亡細(xì)胞因內(nèi)源性核酸酶激活而產(chǎn)生的單鏈或雙股斷鏈相結(jié)合，再通過(guò)一定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來(lái)。通常有2種方法：一、DNA聚合酶Ⅰ或Klenow大片段介導(dǎo)的原位缺口平移(ISNL)法。

ISNL是利用DNA聚合酶將帶有標(biāo)記物的外源摻入的核苷酸整合到凋亡細(xì)胞內(nèi)斷裂的DNA3’-OH末端，通過(guò)合適的顯示系統(tǒng)，觀察是否有核苷酸摻入到DNA的斷端。二、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶生物素-dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNNEL)。TUNNEL法是原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡最為敏感、快速、特異的方法，檢測(cè)原理與ISNL相似，所介導(dǎo)的酶是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，該酶能將帶有標(biāo)記物的外源性核苷酸無(wú)需DNA模板連接到凋亡細(xì)胞DNA斷裂的3’-OH末端上。由于其可靠性，TUNNEL檢測(cè)成為目前植物細(xì)胞凋亡檢測(cè)的首選手段。植物細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法共10頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!三、免疫學(xué)方法1.酶聯(lián)免疫吸附法本方法基于凋亡細(xì)胞內(nèi)裂解的DNA片段含組蛋白（核小體），而DNA與組蛋白結(jié)合緊密而不被核酸內(nèi)切酶切割。在微量板上吸附抗組蛋白抗體，加入細(xì)胞裂解后離心所得的含有核小體的上清液，核小體上的組蛋白與被包被的抗組蛋白抗體結(jié)合；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體，與核小體上的DNA結(jié)合；加酶的底物，測(cè)光吸收值。該法敏感性高，所需細(xì)胞少，可檢測(cè)到5×102的凋亡細(xì)胞，但缺點(diǎn)是不能定位。植物細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法共10頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!

植物細(xì)胞凋亡可被激素調(diào)控，乙烯和赤霉素可誘導(dǎo)并加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而脫落酸則抑制細(xì)胞凋亡。在大麥和小麥中，赤霉素誘導(dǎo)糊粉層細(xì)胞凋亡的開始，激發(fā)大麥糊粉層水解酶的累積，而脫落酸則能拮抗赤霉素的作用。因此，可以通過(guò)測(cè)定植物體內(nèi)的激素含量，作為檢測(cè)植物細(xì)胞凋亡的輔助標(biāo)準(zhǔn)。

隨著科學(xué)的不