單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性檢測試劑盒說明書- 微量法UPLC-MS-4387

電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網(wǎng)址：本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！請勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測等用途！-上海液質(zhì)檢測技術(shù)有限公司第第頁單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性檢測試劑盒說明書貨號(hào)：UPLC-MS-4387規(guī)格：100T/96S產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系工作人員。

微量法試劑名稱規(guī)格保存條件提取液液體110mL×1瓶4℃保存試劑一液體12mL×1瓶4℃保存試劑二粉劑×1瓶4℃保存試劑三粉劑×1瓶-20℃保存試劑四液體×1瓶-20℃保存溶液的配制：1、試劑二：臨用前加入2mL蒸餾水充分溶解，4℃保存；2、試劑三：臨用前加入3.33mL蒸餾水充分溶解待用，可溶解后分裝-20℃保存，避免反復(fù)凍融；3EP2mL試劑一充分溶解，可溶解后分裝-20℃復(fù)凍融。產(chǎn)品說明：MDHAR催化MDHA還原生成AsA，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。MDHAR催化NADH還原MDHA生成AsA和NAD+，NADH在340nm有特征吸收峰，但是NAD+沒有。通過測定340nm光吸收下降速率，來計(jì)算出MDHAR活性。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。需自備的儀器和用品：研缽/勻漿器、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍和雙蒸水。操作步驟：一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）1提取液體積的比例（0.1g1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。10000rpm，4℃10min，取上清置冰上待測。2（104個(gè)（5001mL提取液，冰浴超聲破碎細(xì)胞（300w3s7s3min10000rpm，4℃取上清置于冰上待測。二、測定步驟1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到340nm，蒸餾水調(diào)零。2、試劑一在25℃水浴鍋中預(yù)熱30min。3、依次在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列試劑試劑名稱（μL）空白管測定管試劑二2020試劑三2020試劑四2020試劑一8080蒸餾水60上清液60340nm30s150sA1ΔAΔA空白管。三、MDHAR活性計(jì)算使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下：按蛋白濃度計(jì)算MDHAR活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmolNADH為一個(gè)酶活單位。MDHAR(U/mgprot)=[(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反總×106]÷(Cpr×V樣)÷T=0.268×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷Cpr按樣本質(zhì)量計(jì)算MDHAR活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1μmolNADH為一個(gè)酶活單位。MDHAR(U/g質(zhì)量)=[(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反總×106]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=0.268×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷W按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算MDHAR活性單位定義：25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1μmolNADH為一個(gè)酶活單位。MDHAR(U/104cell)=[(ΔA測定管-ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×106]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=0.268×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷細(xì)胞數(shù)量ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6220L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；106：單位換算系數(shù)，1mol=1×106μmol；V0.2mL=2×10-4L；Vmg/mL2min；細(xì)胞數(shù)量：以104為單位計(jì)量，萬個(gè)。使用96孔UV板測定的計(jì)算公式如下：將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。注意事項(xiàng)：A0.3時(shí)（96A0.2，建議客戶稀釋樣本或者調(diào)整試劑一和上清液的比例（如400μL試劑一+300μL600μL試劑一+100μL上清液）后進(jìn)行測定。ΔA