淀粉脫分支酶（DBE）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)-可見(jiàn)分光光度法UPLC-MS-4175

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可見(jiàn)分光光度法UPLC-MS-417550T/24S試劑名稱規(guī)格保存條件提取液液體50mL×1瓶2-8℃保存試劑一液體15mL×1瓶2-8℃保存試劑二粉劑×2瓶2-8℃保存試劑三液體15mL×1瓶2-8℃保存試劑四液體42mL×1瓶2-8℃保存標(biāo)準(zhǔn)品粉劑×1支2-8℃保存溶液的配制：1、試劑二：臨用前取1瓶加入3mL試劑一，充分溶解后待用，用不完的試劑2-8℃保存4周；210mg1mL10mg/mL2-8℃（starchdebranchingα-1,6-DBE催化支鏈淀粉產(chǎn)生還原糖，其與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)生成棕紅色物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定其在540nm下吸光值變化可計(jì)算得DBE活性。Amylopectin

DBE

ReducingSugarReducingSugar+3,5-DinitrosalicylicAcid 3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)?？梢?jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式低溫離心機(jī)、水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）1（g）（mL）15~10（0.1g1mL提取液15000g，4℃10min2（104個(gè)500~1000︰1500萬(wàn)個(gè)1mL3715000g，4℃10min）3、液體：直接檢測(cè)。二、測(cè)定步驟1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，蒸餾水調(diào)零。2、將10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。序號(hào)（mg/mL）標(biāo)準(zhǔn)液體積（μL）蒸餾水體積（μL）稀釋后濃度（mg/mL）11010019000.520.54001000.430.53002000.340.52003000.250.51004000.1實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需200μL標(biāo)準(zhǔn)溶液。3、取250μL樣本沸水浴5min（蓋緊，防止水分散失），冷卻至室溫后，8000g，常溫離心5min，取上清備用。4、操作表(在1.5mL離心管中)：試劑名稱（μL）對(duì)照管測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管煮沸樣本200樣本-200--標(biāo)準(zhǔn)溶液--200-蒸餾水200試劑一200-200200試劑二-200--混勻，37℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱中準(zhǔn)確反應(yīng)2h試劑三200200200200試劑四600600600600540nmAAAAΔA=A-AΔA標(biāo)準(zhǔn)=A-A（1-2次。2h三、DBE活性計(jì)算1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x（mg/mL）。2、DBE活性的計(jì)算：酶活定義：每mg蛋白每小時(shí)分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位。DBE酶活（U/mgprot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=0.5x÷Cpr酶活定義：每g樣本每小時(shí)分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位。DBE酶活（U/g質(zhì)量）=x×V提取÷W÷T=0.5x÷W酶活定義：每104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位。DBE酶活（U/104cell）=x×V提取÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）÷T=0.5x÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）酶活定義：每mL樣本每小時(shí)分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位。DBE酶活（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T=0.5xV提?。禾崛∫后w積，1mL；V樣：加入的樣本體積，0.2mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg