結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（GBSS）活性檢測試劑盒說明書-微量法UPLC-MS-4165

電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網(wǎng)址：本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！請勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測等用途！-上海液質(zhì)檢測技術(shù)有限公司第第頁結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（GBSS）活性檢測試劑盒說明書注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。貨號(hào)：UPLC-MS-4165規(guī)格：100T/96S產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系工作人員。

微量法試劑名稱規(guī)格保存條件提取液液體100mL×2瓶4℃保存試劑一液體35mL×1瓶4℃保存試劑二粉劑×1瓶4℃保存試劑三粉劑×1瓶-20℃保存試劑四粉劑×2瓶-20℃保存試劑五粉劑×1瓶-20℃保存試劑六粉劑×3支-20℃保存試劑七液體250μL×2支-20℃保存試劑八液體12.5μL×2支4℃保存溶液的配制：1、試劑四：臨用前每支加入5mL試劑一。2、試劑五：臨用前每支加入10mL試劑一。3、試劑六：臨用前取1支加入208μL雙蒸水，充分溶解備用，用不完的試劑4℃保存。4、試劑八：每支臨用前加入溶解好的4mL試劑四。1反應(yīng)液Ⅰ14mL加入試劑三混合溶解，這樣可以分兩批配制并且測定。產(chǎn)品說明：GBSS（EC1）以束縛態(tài)存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長反應(yīng)，主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng),將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時(shí)生成ADP；進(jìn)一步通過反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為NADPH，其中NADPH生成量與前一步反應(yīng)生成的ADP數(shù)量呈正比，通過340nm下測定NADPH的增加量，可以計(jì)算GBSS活性。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。操作步驟：一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）0.1g1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃10min1mL取液充分混勻，置冰上待測。二、測定步驟1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。2、在EP管中按順序加入下列試劑試劑名稱（μL）測定管樣本100反應(yīng)液Ⅰ135混勻，30℃保溫20min，置沸水浴中1min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻試劑八75混勻，30℃保溫30min，置沸水浴中1min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，10000g常溫離心10min，取上清液（如果一次性測定樣本較多，可以將試劑四、五和六按比例配成混合液）上清液150試劑五100試劑六5試劑七5200μL96孔板中，340nmA12min后的吸光A2ΔA=A2-A1。注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。三、GBSS活性計(jì)算使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下：1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。GBSS活性（U/mgprot）=[ΔA÷（ε×d）×V測]÷(Cpr×V樣÷V反總×V上清)÷T=43.2×ΔA÷Cpr此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。GBSS活性（U/g質(zhì)量）=[ΔA÷（ε×d）×V測]÷(W÷V提取×V樣÷V反總×V上清)÷T=43.2×ΔA÷WV測：測量體積，0.26mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V反總：反應(yīng)體積，0.31mL；V上清：加入上清液1mL；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10-3mL/nmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。使用96孔板測定的計(jì)算公式如下：1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。GBSS活性（U/mgprot）=[ΔA÷（ε×d）×V測]÷(Cpr×V樣÷V反總×V上清)÷T=72×ΔA÷Cpr此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。GBSS活性（U/g質(zhì)量）=[ΔA÷（ε×d）×V測]÷(W÷V提取×V樣÷V反總×V上清)÷T=72×ΔA÷WV測：測量體積，0.26mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V反總：反應(yīng)體積，0.3