Exp重組質粒的酶切

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一、實驗目的學習和掌握重組質粒的少量酶切、電泳及分析插入DNA片段的大小

二、實驗原理EcoRI&PstI

BamHI單切器具和材料1.5mlEP管,移液器及槍頭(10、50l)恒溫水浴、電泳儀、電泳槽重組質粒pMD18-T三、實驗器具、藥品試劑限制酶:BamHI、EcoRI和PstI酶切buffer:10K、10HDNAmarker:-HindⅢ瓊脂糖,1TAE,

上樣buffer1.酶切反應步驟

ddH2O于EP管→10buffer→質粒DNA→限制酶→混勻,離心5s→37℃,50→65℃水浴10

四、實驗步驟(1)單酶切反應BamHI(15U/l)組/4人;30℃,50

成分ddH2O10KBufferDNABamHITotal需量(l)7.52100.520(2)雙酶切反應成分ddH2O10HBufferDNAEcoRIPstI需量(l)7.52100.250.25EcoRI&PstI(15U/l)組/4人;37℃,50

2.凝膠電泳檢測

0.8%Aga,30mlTAE,煮沸冷卻至55℃,2lEtBr倒膠,插梳子,凝固202l上樣液+樣品100V電泳,觀察酶切失敗的可能原因

不全切或基本未切緩沖體系不合適酶量過多樣品雜質含量高DNA被降解痕量DNase注意事項①吸量要準確②最后加酶③冰

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