谷類作物種子中賴氨酸含量的測定

谷類作物種子中賴氨酸含量的測定蛋白質(zhì)中賴氨酸（lysine，Lys）的含量是谷物品質(zhì)的主要指標(biāo)之一。由于動物及人類不能合成，須從食物中得以補(bǔ)充，為此培育高含量賴氨酸的谷物，對于提高營養(yǎng)價值有重要意義。本實驗分別用茚三酮溶液顯色法和染料結(jié)合法（dyebindinglysine，DBL）測定玉米種子中賴氨酸含量。Ⅰ茚三酮顯色法一、原理谷物蛋白中賴氨酸殘基有自由的c-NHz，它與茚三酮（ninhydrin）試劑可發(fā)生顏色反應(yīng)，生成紫紅色物質(zhì)，其顏色與賴氨酸殘基的數(shù)目成正相關(guān)。選用碳原子數(shù)目與賴氨酸相同的亮氨酸，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，可用以測定谷物蛋白內(nèi)賴氨酸的含量。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料不同品種的玉米種子，用粉碎機(jī)粉碎，過100目篩子，收集過篩后的細(xì)粉，放入廣口瓶內(nèi)，加入沸程60~90℃的石油醚，使其淹過粉面，浸泡8h，不時攪動進(jìn)行脫脂。然后過濾，并用石油醚淋洗沉淀若干次，棄去濾液。將脫脂玉米粉晾在干凈的濾紙上，置陰涼通風(fēng)處吹干石油醚。收集干粉，置干燥器內(nèi)，保存?zhèn)溆?。（二）儀器設(shè)備722型分光光度計、水浴鍋，試管，圓頭玻璃棒（圓頭大小要與試管大小配套）。（三）試劑（1）緩沖溶液，稱取30g甲酸鈉，溶解于約60mL蒸餾水中，加入10mL8%的甲酸，最后加水到100mL。（2）茚三酮試劑：稱取1g茚三酮和1g氯化鎘（CdCl2·H2O），加入25mL上述緩沖溶液和75mL乙二醇，室溫下放置一天、第二天使用。若出現(xiàn)沉淀、則過濾后使用。該溶液一定要頭一天配制，第二天使用，不宜放置過久，也不能現(xiàn)用現(xiàn)配。（3）4%和2%無水碳酸鈉溶液各50mL。（4）標(biāo)準(zhǔn)亮氮酸溶液，準(zhǔn)確稱取25mg亮氨酸，加數(shù)滴稀鹽酸，待溶解后定容至50mL，該溶液亮氨酸濃度為500μg/mL。準(zhǔn)確吸取上述母液1mL、3mL、5mL、7mL、9mL，分別稀釋至25mL，待用。三、實驗步驟（一）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確吸取已配好的標(biāo)準(zhǔn)濃度系列的亮氨酸溶液各0.5mL，分別放入5支試管中，每種濃度做三個重復(fù)。再取一支試管加入0.5mL蒸餾水做空白對照。向每支試管中各加人0.5mL的4%碳酸鈉溶液和2mL茚三酮試劑（頭一天配好的），混勻，在80℃恒溫水浴上保溫30min。取出后，立即放入冷水浴中冷卻3min，然后向每管內(nèi)加入5mL的95%乙醇，搖勻，在分光光度計上500nm波長處進(jìn)行比色，以空白做對照，讀取吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，亮氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出曲線的斜率。（二）樣品的測定準(zhǔn)確稱取已脫脂的各種玉米種子干粉各25mL，每個品種做三個重復(fù)。放入試管中（試管應(yīng)預(yù)先烘干），加入約300mg細(xì)石英砂（估計數(shù)字）和1mL2%碳酸鈉溶液，用圓頭玻棒充分?jǐn)嚢?min，注意切勿將試管擠破。將試管放入80℃恒溫水浴中，提取10min，應(yīng)常攪動。取出試管，向每管內(nèi)按順序加入2mL茚三酮試劑，混勻，放入80℃恒溫水浴中，保溫顯色30min，同時以蒸餾水做一空白對照，取出后，立即放入冷水浴中冷卻3min，以下步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線做法相同。加完乙醇后進(jìn)行過濾，用濾液進(jìn)行比色，讀取吸光度。若樣品顏色過深，則可取一定量的濾液用95%乙醇稀釋后比色，吸光度的數(shù)值以在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)為宜。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)?shù)牧涟彼岷?。一般作物的籽粒中，蛋白質(zhì)含量約為干重的10%~20%，富含蛋白的種子中則為30%~50%。賴氨酸含量約為3~7g/16g氮。四、結(jié)果計算按下列公式進(jìn)行計算：【注意事項】樣品要粉碎成細(xì)粉，稱量要精確到0.1mg。樣品與石英砂要充分研磨提取，每次操作要一致。茚三酮試劑要頭天配制，第二天使用，切不可久放。恒溫水浴上提取和顯色時間要嚴(yán)格控制。比色時的順序要與加茚三酮試劑的順序相同。Ⅱ染料結(jié)合法（DBL）一、原理谷物蛋白中都含有一定數(shù)量的堿性氨基酸，如Arg、His、Lys的堿性基團(tuán)分別是&'-胍基、β-咪唑基及ε-氨基，在pH2~3的緩沖液中，這些堿性基團(tuán)均帶正電荷，當(dāng)在此溶液中加入一定或過量的偶氮染料（如酸性橙-12），此染料以陰離子存在于溶液中，并與帶正電荷的堿性基團(tuán)作用，定量地生成不溶解的結(jié)合物。但由于染料與這三種堿性氨基酸均能結(jié)合，為此，可在樣品中加入微量的丙酸酐，使其在一定條件下（pH2~3）與賴氨酸的ε-氨基起特異的?；饔?，目的是掩蔽氨基酸中的ε-氨基，防止它與染料結(jié)合。同時，另取一份樣品，不經(jīng)?；幚?、并加入數(shù)量相同的染料。平衡后測定染料的結(jié)合量（DBL），根據(jù)兩次測定染料結(jié)合量的差值，即可求得賴氨酸的含量。此法適于大批分析樣品的快速篩選。其化學(xué)反應(yīng)式如下。1.氨基酸?；饔玫姆磻?yīng)式二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料同上。（二）儀器設(shè)備微型粉碎機(jī)（篩孔直徑為0.05cm）、分析天平，索氏振蕩器，GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀，離心機(jī)及離心管，容量瓶、移液管、滴定管及管架、加樣器、燒杯等。（三）試劑（1）磷酸緩沖液：3.40gKH，PO.和20.00g草酸（H2C2O4·2H2O）分別溶于水中，定量地轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中。然后再加入1，7mL.85%H3PO4、60mL冰醋酸和1mL丙酸，用蒸餾水定容至刻度。（2）染料溶液：準(zhǔn)確稱取1.363g酸性橙-12（Acidorange-12，相對分子質(zhì)量為350.37）。用磷酸緩沖液溶解并定容至1000mL。此溶液的濃度是3.89mmol/L，或每毫升含染料1.363mg。（由于染料的來源不同，它的純度也不同，故須對染料的純度進(jìn)行校正）。（3）半飽和醋酸鈉溶液：取263gNaAc+3H：0溶液后定容至1000mL。pH為3.5左右。（4）丙酸酐。三、實驗步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)回歸方程的制作用滴定管取出1.363mg/mL染料液分別為5mL、8mL、10mL、12mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mL至9個50mL容量瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度。用蛋白質(zhì)分析儀分別測出每一溶液的透光度（T），然后換算成吸光度。以吸光度y和染料溶液濃度x，求測y隨x而變的回歸方程?！ⅲ阂蛉玖系念伾^深，測定時不靈敏，為此，可將1.363mg/mL染料40mL加水25mL，讓其透光率為0；以40mL1.363mg/mL染料加水125mL，調(diào)其透光度為87%，然后再測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液求其T值，再換算成吸光度。樣品的測定1.粉碎將待測的各種谷物種子10g置微型粉碎機(jī)中分別粉碎（粉碎機(jī)轉(zhuǎn)速為8000r/min）約0.5min，回收全部樣品，充分混勻樣品，并在80℃烘箱中烘2h左右，然后放至干燥器中冷卻。2.稱重稱取樣品兩份，其中一份為?；瘶悠?，稱重為300mg；另一份為未?；臉悠罚Q重為250mg，分別倒至兩個離心管中。3.反應(yīng)（1）在?；瘶悠饭苤屑尤?mL半飽和醋酸鈉溶液及0.1mL丙酸酐。（2）在未酰化樣品管中加入1mL半飽和醋酸鈉溶液及0.1mL磷酸緩沖液。（3）各管搖勻后，加塞，在攪拌器或振蕩器上攪拌15min，使之充分酰化，然后分別用快速加樣器準(zhǔn)確加入10mL1.363mg/mL的染料液，塞緊塞子后，在振蕩機(jī)（水平式）上振蕩1h，反應(yīng)后的混合液立即以3000~3500r/min離心8~12min。4.測定將各管離心后的上清液用GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀測定透光度T值。四、結(jié)果計算（一）單位樣品結(jié)合的染料量根據(jù)所測定剩余染料的透光度換算成吸光度后，由標(biāo)準(zhǔn)回歸方程算出酰化管中和未?；苤惺Ｓ嗳玖系臐舛?，再根據(jù)下列公式計算出單位樣品結(jié)合的染料量。式中：C為加入染料溶液的濃度，mg/mL，即1.363mg/mL；V為加入染料的體積，10mL；Vc為染料濃度為1.363mg/mL時的體積；CA、CB分別為酰化樣品和未?；瘶悠放c染料作用