第15章DNA的生物合成和損傷修復課件

CrickWatsonCrickWatson1DNAReplicationTranscriptionTranslationTheCentralDogmabyFrancisCrickin1958DNAReplicationTranscriptionTr2

DNA的生物合成和損傷修復DNABiosynthesisandDNADamageRepair第十五章第三篇基因信息傳遞DNA的生物合成第3染色體DNA復制的一般特征ThegeneralfeaturesofreplicationofchromosomalDNA第一節(jié)染色體DNA復制的一般特征第一節(jié)4一、DNA復制是半保留復制一、DNA復制是半保留復制51958Meselson-Stahl實驗1958Meselson-Stahl實驗6雙螺旋DNA復制時，復制區(qū)生長點的結(jié)構(gòu)呈Y形或叉形，稱之為復制叉(replicationfork)。二、DNA復制的生長點形成復制叉目錄雙螺旋DNA復制時，復制區(qū)生長點的結(jié)構(gòu)呈Y形或叉形，稱之為復7三、DNA復制是雙向復制

一個起點，兩個復制叉，雙向復制。兩個起點，兩個生長點，單向復制。一個起點，一個復制叉，單向復制。三、DNA復制是雙向復制一個起點，兩個復制叉，雙向復制。835353535前導鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)解鏈方向?qū)槠?5四、DNA復制為半不連續(xù)復制前導鏈（leadingstrand）后隨鏈（laggingstrand）岡崎片段（Okazakifragments)DNA半不連續(xù)復制。35353535前導鏈后隨鏈解鏈方向?qū)槠?復制起點（origin）：五、復制起點由多個短重復序列組成原核生物單一復制起點真核生物多個復制起點復制子（replicon）從一個DNA復制起點起始的DNA復制區(qū)域。

復制起點（origin）：五、復制起點由多個短重復序列組成原10E.coli復制起始點oriC復制起點的一般特征:①多個短重復序列;②可被復制起始因子所識別;③一般富含AT，利于DNA解旋。Green:initiatorbindingsitesBlue:

unwoundregionRed:replicationinitiationsiteE.coli復制起始點oriC復制起點的一般特征:Gre11六、DNA復制必須有引物（一）多數(shù)DNA復制使用RNA引物（二）個別DNA復制以DNA或核苷酸為引物174等噬菌體以雙鏈環(huán)形DNA的一條鏈上產(chǎn)生切口處的3-OH為引物；腺病毒及某些線性DNA病毒以DNA末端蛋白上的dCTP的3-OH為引物。(三)體外DNA合成采用DNA作引物六、DNA復制必須有引物（一）多數(shù)DNA復制使用RNA引物12Proteinprimingasasolutiontotheendreplicationproblem.Proteinprimingasasolution13DNA聚合酶：催化合成DNADNA解旋酶（helicase）：解開DNA雙螺旋，暴露復制模板鏈引發(fā)酶：引發(fā)，即合成RNA引物，利用引物3’-OH開始延伸DNA連接酶：連結(jié)岡崎片段其它酶和蛋白因子七、DNA復制需要多種酶參與如：起穩(wěn)定作用的單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和改變DNA超螺旋狀態(tài)的DNA拓撲異構(gòu)酶（topoisomerase）等。DNA聚合酶：催化合成DNA七、DNA復制需要多種酶參與14DNA聚合酶的合成前誤差控制(presyntheticerrorcontrol)和校正控制(proofreadingcontrol)功能。細胞修復系統(tǒng)是DNA復制高度忠實性的重要因素。復制起始利用引物也是確保DNA復制忠實性的重要機制之一。八、DNA復制具有高度忠實性DNA聚合酶的合成前誤差控制(presyntheticer15

DNA聚合酶的特征

FeaturesofDNApolymerases第二節(jié) DNA聚合酶的特征第二節(jié)16一、DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板連接處dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）引物-模板復合物/連接處(primer-templatejunction)一、DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板連接處dNTP17CorrectlypairedbasesarerequiredforDNApolymerasecatalyzednucleotideaddition.二、DNA聚合酶的活性中心催化DNA合成Correctlypairedbasesarereq18SchematicillustrationofWHYrNTPcannotbeusedbyDNApolymeraseSchematicillustrationofWHY19三、DNA聚合酶半閉合右手結(jié)構(gòu)有3個結(jié)構(gòu)域聚合酶活性中心，位于手掌上部，即手指和拇指接合部；35外切酶活性中心，位于手掌底部。手掌結(jié)構(gòu)域手指結(jié)構(gòu)域拇指結(jié)構(gòu)拇指手掌引物鏈手指聚合酶活性中心外切酶活性中心模板鏈三、DNA聚合酶半閉合右手結(jié)構(gòu)有3個結(jié)構(gòu)域聚合酶活性中心，位20DNA聚合酶合成的進行性（processivity):DNA夾子（slidingclamp）可增強DNA聚合酶的進行性。四、可滑動的DNA夾子增強DNA聚合酶的進行性DNA聚合酶合成的進行性（processivity):四、可21DNA聚合酶35外切酶活性與校對功能(proofreading).五、DNA聚合酶還有一個3’5’外切酶活性中心DNA聚合酶35外切酶活性與校對功能(proofrea22大腸桿菌DNA復制過程DNAreplicationinE.coli第三節(jié)大腸桿菌DNA復制過程第三節(jié)23E.coliDNA復制起始

一、在復制起點解旋酶和多種因子形成復合物識別復制起點；解旋解鏈,形成復制叉單鏈DNA形成，SSB結(jié)合單鏈引發(fā)體組裝及引物合成。E.coliDNA復制起始一、在復制起點解旋酶和多種因24DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（gyrase，即拓撲異構(gòu)酶Ⅱ）、單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandbindingprotein,SSB)DNA復制起始需要6種蛋白因子：DnaA、DnaB、DnaC、HU、DNA復制起始需要6種蛋25E.coli中DnaB結(jié)合引發(fā)酶DnaG，催化合成RNA引物，其序列始于pppAG，模板鏈序列3-GTC-5，引物長度一般11~12個堿基。二、引發(fā)酶合成RNA引物E.coli中DnaB結(jié)合引發(fā)酶DnaG，催化合成RNA引26負責切除RNA引物。三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ可利用損傷尚未修復的DNA鏈作為模板合成DNA，但不能修復損傷。負責合成DNA。DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅱ負責切除RNA引物。三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合27TLS1Rev1TLS，體細胞高變1Pol相對準確的TLS（穿越環(huán)丁烷二聚體）1PolTLS1Pol體細胞高變（somatichypermutation）1Pol減數(shù)分裂相關的DNA損傷修復1PolTLS1PolDNA交聯(lián)損傷修復1PolDNA復制，核苷酸切除修復，堿基切除修復4PolDNA復制，核苷酸切除修復，堿基切除修復2~3Pol線粒體DNA復制和損傷修復3Pol堿基切除修復1Pol合成引物4Pol功能亞基數(shù)目真核生物TLS（translesionsynthesis）3PolⅤ(UmuC,UmuD)DNA損傷修復，穿越損傷合成（TLS）1PolⅣ(DinB)染色體DNA復制9PolⅢ全酶染色體DNA復制3PolⅢ核心酶DNA損傷修復1PolⅡ去除RNA引物，DNA損傷修復1PolⅠ功能亞基數(shù)目原核生物（E.coli）原核、真核細胞DNA聚合酶的類型和功能目錄TLS1Rev1TLS，體細胞高變1Pol相對準確的28DNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)核心酶由、和亞基組成：亞基（130000）主要功能是合成DNA亞基具有35外切酶活性（校正功能）亞基可增強其活性亞基可能起組裝作用γcomplex/clamploaderDNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)核心酶由、和亞基組成：2935353535前導鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)解鏈方向?qū)槠?5

在復制叉同時合成前導鏈和后隨鏈

同一個聚合酶如何同時合成兩條鏈?35353535前導鏈后隨鏈解鏈方向?qū)槠?0

在復制叉同時合成前導鏈和后隨鏈在復制叉同時合成前導鏈和后隨鏈31第15章DNA的生物合成和損傷修復課件32三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物33DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA連接酶（ligase）將兩個岡崎片段之間的缺口DNA聚合酶Ⅰ

53外切酶：去除RNA引物35外切酶：起校正作用DNA聚合酶活性：填補缺口DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ34323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段：Klenow片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端枯草桿菌蛋白酶DNA-polⅠ323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段：Kl35Ter(terminus)Tus(terminusutilizationsubstance).四、Tus蛋白識別復制終點使復制終止Ter(terminus)四、Tus蛋白識別復制終點使復制361)ParentDNAarefullymethylated;2)DaughterDNAarehemimethylated3)SeqAquicklybindstohemimethylatedsequences;4)InhibitsfullmethylationandbindingofOriCbyDnaA;DammethylasemethylatesDNAattheN6positionofalladenineswithinGATCsequences.五、DNA甲基化保證復制起點在每個復制周期中僅起一次作用1)ParentDNAarefullymethyla37E.ColiDNAreplicationisregulatedbyDnaA,ATPlevelsandSeqASeqAsequesterDnaAbindingofOriC;AdditionalDnaAbindingsitesinthechromosome(~300,afterreplicationitisduplicated)andthusdecreasetheDnaAlevelavailable;ATPlevelandthereplacementofDnaA-ADPtoDnaA-ATPisaslowprocess.E.ColiDNAreplicationisregu38復制過程中產(chǎn)生正超螺旋。拓撲異構(gòu)酶消除正超螺旋。六、DNA復制需要兩類DNA拓撲異構(gòu)酶復制過程中產(chǎn)生正超螺旋。六、DNA復制需要兩類DNA拓撲異構(gòu)39E.coIi的TopoⅠ只作用于負超螺旋DNA，消除負超螺旋。

DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的功能：E.coIi的TopoⅠ只作用于負超螺旋DNA，消除負超螺旋40E.coli的TopoⅡ?qū)⑶胺疆a(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨摮菪?。DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的功能E.coli的TopoⅡ?qū)⑶胺疆a(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨摮菪?1E.coli的TopoⅣ分離連環(huán)體E.coli的TopoⅣ分離連環(huán)體42ReplicationterminationinEukaryotes:

TheendreplicationproblemPage333ReplicationterminationinEuk43Solution1:Proteinprimingasasolutiontotheendreplicationproblem.Solution1:Proteinprimingas44Solution2:Replicationoftelomeresby

telomeraseSolution2:Replicationoftel45ReplicationoftelomeresbytelomeraseReplicationoftelomeresbyte46線粒體和噬菌體的DNA復制DNAreplicationinmitochondriaandphages第五節(jié)線粒體和噬菌體的DNA復制DNAreplicationi47一、線粒體DNA按D環(huán)方式復制環(huán)形、雙螺旋DNA分子、一條H鏈和一條L鏈dNTPDNA-polγ

線粒體DNA分子特點：兩條鏈具有不同的復制起點和相反的合成方向；一、線粒體DNA按D環(huán)方式復制環(huán)形、雙螺旋DNA分子、一條H48二、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復制環(huán)形雙螺旋DNA分子；一條為模板鏈，另一條為非模板鏈??E.coli噬菌體DNA的分子結(jié)構(gòu)特點：二、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復制環(huán)形雙螺旋DNA分子；E.co493-OH5-P55533335'滾環(huán)復制5'53353-OH5-P55533335'滾環(huán)復制550DNApolymeraseerrorratesInitialpairingerror=1/105Afterproofreading-Finalcopy=1/107Actualerrorrates~1/109Humangenome=3.2x109bp3errors/replication!DNApolymeraseerrorratesInit51MutationofDNAToofast:harmfultosurvivalandproliferation;Tooslow:lackofevolutionforce.MutationofDNAToofast:harmf52DNAdamageandrepairDNADamage:AnychangesintheDNAmoleculeisreferedtoas~.Mutation:ApermanentchangeinthenucleotidesequenceofDNAiscalledamutation.DNAdamageandrepairDNADamag53ImportanceofDNARepair?DNAistheonlybiologicalmacromoleculethatisrepaired.Allothersarereplaced.?Morethan100genesarerequiredforDNArepair,eveninorganismswithverysmallgenomes.?CancerisaconsequenceofinadequateDNArepair.ImportanceofDNARepair54DNA損傷修復TheRepairofDNADamage第六節(jié)DNA損傷修復第六節(jié)55一、復制差錯和化學/物理因素造成體內(nèi)DNA損傷DNA復制產(chǎn)生誤差化學或物理損傷轉(zhuǎn)座子（transposons）的轉(zhuǎn)座作用自發(fā)突變遺傳信息的突變來源：一、復制差錯和化學/物理因素造成體內(nèi)DNA損傷DNA復制產(chǎn)生56首先，在基因組中迅速找到錯配的核苷酸；然后，準確地校正錯配核苷酸。二、錯配修復系統(tǒng)修復DNA復制中出現(xiàn)的差錯錯配修復系統(tǒng)（mismatchrepairsystem）能夠發(fā)現(xiàn)和修復DNA復制中錯配的核苷酸，提高復制準確率。錯配修復系統(tǒng)：首先，在基因組中迅速找到錯配的核苷酸；二、錯配修復系統(tǒng)修復D57E.coli錯配修復系統(tǒng)修復復制差錯（一）E.coli依賴Dam甲基化酶識別錯配堿基所在的DNA鏈E.coli錯配修復系統(tǒng)修復復制差錯（一）E.coli依賴D58模板鏈的GATC序列甲基化MutH僅切割新合成的DNA鏈MutH僅切割新合成的DNA鏈模板鏈的GATC序列甲基化MutH僅切割新合成的DNA鏈59MSH（MutShomologs）蛋白與MutL同源的MLH和PMS蛋白（二）真核細胞利用岡崎片段連接前的DNA缺口辨別錯配堿基所在的DNA鏈真核細胞錯配修復系統(tǒng)無MutH，也無半甲基化標記母鏈。錯配修復系統(tǒng)利用岡崎片段連接前的DNA缺口辨別錯配堿基所在的DNA鏈。真核細胞核苷酸修復錯配系統(tǒng)：MSH（MutShomologs）蛋白（二）真核細胞利用岡60三、多種化學或物理因素造成細胞DNA損傷堿基丟失堿基改變核苷酸插入或缺失DNA鏈斷裂DNA鏈間共價交聯(lián)DNA損傷類型其一，導致復制或轉(zhuǎn)錄障礙其二，導致復制后產(chǎn)生基因突變DNA損傷的結(jié)果:三、多種化學或物理因素造成細胞DNA損傷堿基丟失DNA損傷類61四、DNA損傷修復系統(tǒng)有多種類型DNA聚合酶（Y-家族），如E.coli：UmuC嘧啶二聚體，無嘌呤位點跨損傷DNA合成E.coli：RecA和RecBCD雙鏈斷裂重組修復E.coli：UvrA,UvrB,UvrC,UvrD人：XPC,XPA,XPD,ERCCI-XPF,XPG嘧啶二聚體，堿基烷基化核苷酸切除修復DNA糖苷酶（即DNA糖基水解酶）堿基損傷堿基切除修復E.coli：DNA光裂合酶等嘧啶二聚體直接修復E.coli：MutS,MutL,MutH人：MSH,MLH,PMS復制差錯錯配修復酶損傷修復系統(tǒng)的類型四、DNA損傷修復系統(tǒng)有多種類型DNA聚合酶（Y-家族），如62修復對象：將DNA中因紫外線照射而形成的嘧啶二聚體分解。分布：分布廣泛，除哺乳動物外均有之。（一）直接修復（directrepair）系統(tǒng)利用酶簡單地逆轉(zhuǎn)DNA損傷光復活修復系統(tǒng)：修復對象：將DNA中因紫外線照射而形成的嘧啶二聚體分解。（一63修復對象：DNA中被甲基化修飾的鳥嘌呤（O6-甲基鳥嘌呤，與T配對）。特點：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶一旦接受甲基就不再具有催化活性，修復代價高昂。O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶修復修復對象：DNA中被甲基化修飾的鳥嘌呤（O6-甲基鳥嘌呤，與64E.coli堿基切除修復系統(tǒng)切除胞嘧啶自發(fā)脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶（二）堿基切除系統(tǒng)修復切除受損堿基Baseexcisionrepair,BERE.coli堿基切除修復系統(tǒng)（二）堿基切除系統(tǒng)修復切除受損堿65胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶；氧化的鳥嘌呤（oxoG）；脫氨基的腺嘌呤；開環(huán)堿基；碳原子之間雙鍵變成單鍵的堿基等。

DNA糖苷酶識別的異常堿基包括：胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶；DNA糖苷酶識別的異常堿基包括：66（三）核苷酸切除修復系統(tǒng)識別DNA雙螺旋變形nucleotideexcisionrepair,NERNER識別DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)變形而非特殊堿基UvrA識別DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)變形UvrB負責解鏈，募集核酸內(nèi)切酶UvrCUvrC在損傷部位的兩側(cè)切斷DNA鏈UvrD去除這兩個切點之間的DNA片段DNA聚合酶Ⅰ和連接酶填補缺口（三）核苷酸切除修復系統(tǒng)識別DNA雙螺旋變形nucleoti67（四）重組修復系統(tǒng)能夠修復雙鏈斷裂損傷（四）重組修復系統(tǒng)能夠修復雙鏈斷裂損傷68E.coli跨損傷DNA合成（五）跨損傷DNA聚合酶能夠跨越損傷部位合成DNAE.coli跨損傷DNA合成（五）跨損傷DNA聚合酶能夠跨69第七節(jié)逆轉(zhuǎn)錄概念：在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成DNA的過程。ReversetranscriptionRNA腫瘤病毒DNA原病毒（或前病毒）RNA腫瘤病毒1964年,Temin等提出，原病毒（provirus）DNA是RNA腫瘤病毒在復制過程中的中間物。第七節(jié)逆轉(zhuǎn)錄概念：在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成DN70逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)與功能逆轉(zhuǎn)錄酶有3種酶的活性：RNA指導的DNA聚合酶活性；DNA指導的DNA聚合酶活性；RNAseH的活性。逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)與功能逆轉(zhuǎn)錄酶有3種酶的活性：71第15章DNA的生物合成和損傷修復課件72逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組和原病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組和原病毒73二、逆轉(zhuǎn)錄酶以tRNA為引物合成雙鏈cDNA二、逆轉(zhuǎn)錄酶以tRNA為引物合成雙鏈cDNA74逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則。該酶是分子生物學研究中常用的工具酶.Reversetranscription逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則。Reversetranscr75DavidBaltimore

RenatoDulbecco

HowardMartinTemin

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1975DavidBaltimoreRenatoDulbecc76End!End!77Figure16.6MinusstrandDNAisgeneratedbyswitchingtemplatesduringreversetranscription.16.2TheretroviruslifecycleinvolvestranspositionlikeeventsFigure16.6MinusstrandDNAi78Figure16.7SynthesisofplusstrandDNArequiresasecondjump.16.2TheretroviruslifecycleinvolvestranspositionlikeeventsFigure16.7Synthesisofplus79第15章DNA的生物合成和損傷修復課件80TheCentralDogmaTheCentralDogma81CrickWatsonCrickWatson82DNAReplicationTranscriptionTranslationTheCentralDogmabyFrancisCrickin1958DNAReplicationTranscriptionTr83

DNA的生物合成和損傷修復DNABiosynthesisandDNADamageRepair第十五章第三篇基因信息傳遞DNA的生物合成第84染色體DNA復制的一般特征ThegeneralfeaturesofreplicationofchromosomalDNA第一節(jié)染色體DNA復制的一般特征第一節(jié)85一、DNA復制是半保留復制一、DNA復制是半保留復制861958Meselson-Stahl實驗1958Meselson-Stahl實驗87雙螺旋DNA復制時，復制區(qū)生長點的結(jié)構(gòu)呈Y形或叉形，稱之為復制叉(replicationfork)。二、DNA復制的生長點形成復制叉目錄雙螺旋DNA復制時，復制區(qū)生長點的結(jié)構(gòu)呈Y形或叉形，稱之為復88三、DNA復制是雙向復制

一個起點，兩個復制叉，雙向復制。兩個起點，兩個生長點，單向復制。一個起點，一個復制叉，單向復制。三、DNA復制是雙向復制一個起點，兩個復制叉，雙向復制。8935353535前導鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)解鏈方向?qū)槠?5四、DNA復制為半不連續(xù)復制前導鏈（leadingstrand）后隨鏈（laggingstrand）岡崎片段（Okazakifragments)DNA半不連續(xù)復制。35353535前導鏈后隨鏈解鏈方向?qū)槠?0復制起點（origin）：五、復制起點由多個短重復序列組成原核生物單一復制起點真核生物多個復制起點復制子（replicon）從一個DNA復制起點起始的DNA復制區(qū)域。

復制起點（origin）：五、復制起點由多個短重復序列組成原91E.coli復制起始點oriC復制起點的一般特征:①多個短重復序列;②可被復制起始因子所識別;③一般富含AT，利于DNA解旋。Green:initiatorbindingsitesBlue:

unwoundregionRed:replicationinitiationsiteE.coli復制起始點oriC復制起點的一般特征:Gre92六、DNA復制必須有引物（一）多數(shù)DNA復制使用RNA引物（二）個別DNA復制以DNA或核苷酸為引物174等噬菌體以雙鏈環(huán)形DNA的一條鏈上產(chǎn)生切口處的3-OH為引物；腺病毒及某些線性DNA病毒以DNA末端蛋白上的dCTP的3-OH為引物。(三)體外DNA合成采用DNA作引物六、DNA復制必須有引物（一）多數(shù)DNA復制使用RNA引物93Proteinprimingasasolutiontotheendreplicationproblem.Proteinprimingasasolution94DNA聚合酶：催化合成DNADNA解旋酶（helicase）：解開DNA雙螺旋，暴露復制模板鏈引發(fā)酶：引發(fā)，即合成RNA引物，利用引物3’-OH開始延伸DNA連接酶：連結(jié)岡崎片段其它酶和蛋白因子七、DNA復制需要多種酶參與如：起穩(wěn)定作用的單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和改變DNA超螺旋狀態(tài)的DNA拓撲異構(gòu)酶（topoisomerase）等。DNA聚合酶：催化合成DNA七、DNA復制需要多種酶參與95DNA聚合酶的合成前誤差控制(presyntheticerrorcontrol)和校正控制(proofreadingcontrol)功能。細胞修復系統(tǒng)是DNA復制高度忠實性的重要因素。復制起始利用引物也是確保DNA復制忠實性的重要機制之一。八、DNA復制具有高度忠實性DNA聚合酶的合成前誤差控制(presyntheticer96

DNA聚合酶的特征

FeaturesofDNApolymerases第二節(jié) DNA聚合酶的特征第二節(jié)97一、DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板連接處dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）引物-模板復合物/連接處(primer-templatejunction)一、DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板連接處dNTP98CorrectlypairedbasesarerequiredforDNApolymerasecatalyzednucleotideaddition.二、DNA聚合酶的活性中心催化DNA合成Correctlypairedbasesarereq99SchematicillustrationofWHYrNTPcannotbeusedbyDNApolymeraseSchematicillustrationofWHY100三、DNA聚合酶半閉合右手結(jié)構(gòu)有3個結(jié)構(gòu)域聚合酶活性中心，位于手掌上部，即手指和拇指接合部；35外切酶活性中心，位于手掌底部。手掌結(jié)構(gòu)域手指結(jié)構(gòu)域拇指結(jié)構(gòu)拇指手掌引物鏈手指聚合酶活性中心外切酶活性中心模板鏈三、DNA聚合酶半閉合右手結(jié)構(gòu)有3個結(jié)構(gòu)域聚合酶活性中心，位101DNA聚合酶合成的進行性（processivity):DNA夾子（slidingclamp）可增強DNA聚合酶的進行性。四、可滑動的DNA夾子增強DNA聚合酶的進行性DNA聚合酶合成的進行性（processivity):四、可102DNA聚合酶35外切酶活性與校對功能(proofreading).五、DNA聚合酶還有一個3’5’外切酶活性中心DNA聚合酶35外切酶活性與校對功能(proofrea103大腸桿菌DNA復制過程DNAreplicationinE.coli第三節(jié)大腸桿菌DNA復制過程第三節(jié)104E.coliDNA復制起始

一、在復制起點解旋酶和多種因子形成復合物識別復制起點；解旋解鏈,形成復制叉單鏈DNA形成，SSB結(jié)合單鏈引發(fā)體組裝及引物合成。E.coliDNA復制起始一、在復制起點解旋酶和多種因105DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（gyrase，即拓撲異構(gòu)酶Ⅱ）、單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandbindingprotein,SSB)DNA復制起始需要6種蛋白因子：DnaA、DnaB、DnaC、HU、DNA復制起始需要6種蛋106E.coli中DnaB結(jié)合引發(fā)酶DnaG，催化合成RNA引物，其序列始于pppAG，模板鏈序列3-GTC-5，引物長度一般11~12個堿基。二、引發(fā)酶合成RNA引物E.coli中DnaB結(jié)合引發(fā)酶DnaG，催化合成RNA引107負責切除RNA引物。三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ可利用損傷尚未修復的DNA鏈作為模板合成DNA，但不能修復損傷。負責合成DNA。DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅱ負責切除RNA引物。三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合108TLS1Rev1TLS，體細胞高變1Pol相對準確的TLS（穿越環(huán)丁烷二聚體）1PolTLS1Pol體細胞高變（somatichypermutation）1Pol減數(shù)分裂相關的DNA損傷修復1PolTLS1PolDNA交聯(lián)損傷修復1PolDNA復制，核苷酸切除修復，堿基切除修復4PolDNA復制，核苷酸切除修復，堿基切除修復2~3Pol線粒體DNA復制和損傷修復3Pol堿基切除修復1Pol合成引物4Pol功能亞基數(shù)目真核生物TLS（translesionsynthesis）3PolⅤ(UmuC,UmuD)DNA損傷修復，穿越損傷合成（TLS）1PolⅣ(DinB)染色體DNA復制9PolⅢ全酶染色體DNA復制3PolⅢ核心酶DNA損傷修復1PolⅡ去除RNA引物，DNA損傷修復1PolⅠ功能亞基數(shù)目原核生物（E.coli）原核、真核細胞DNA聚合酶的類型和功能目錄TLS1Rev1TLS，體細胞高變1Pol相對準確的109DNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)核心酶由、和亞基組成：亞基（130000）主要功能是合成DNA亞基具有35外切酶活性（校正功能）亞基可增強其活性亞基可能起組裝作用γcomplex/clamploaderDNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)核心酶由、和亞基組成：11035353535前導鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)解鏈方向?qū)槠?5

在復制叉同時合成前導鏈和后隨鏈

同一個聚合酶如何同時合成兩條鏈?35353535前導鏈后隨鏈解鏈方向?qū)槠?11

在復制叉同時合成前導鏈和后隨鏈在復制叉同時合成前導鏈和后隨鏈112第15章DNA的生物合成和損傷修復課件113三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物三、DNA聚合酶Ⅲ合成DNA，DNA聚合酶Ⅰ切除引物114DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA連接酶（ligase）將兩個岡崎片段之間的缺口DNA聚合酶Ⅰ

53外切酶：去除RNA引物35外切酶：起校正作用DNA聚合酶活性：填補缺口DNA聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ115323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段：Klenow片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端枯草桿菌蛋白酶DNA-polⅠ323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段：Kl116Ter(terminus)Tus(terminusutilizationsubstance).四、Tus蛋白識別復制終點使復制終止Ter(terminus)四、Tus蛋白識別復制終點使復制1171)ParentDNAarefullymethylated;2)DaughterDNAarehemimethylated3)SeqAquicklybindstohemimethylatedsequences;4)InhibitsfullmethylationandbindingofOriCbyDnaA;DammethylasemethylatesDNAattheN6positionofalladenineswithinGATCsequences.五、DNA甲基化保證復制起點在每個復制周期中僅起一次作用1)ParentDNAarefullymethyla118E.ColiDNAreplicationisregulatedbyDnaA,ATPlevelsandSeqASeqAsequesterDnaAbindingofOriC;AdditionalDnaAbindingsitesinthechromosome(~300,afterreplicationitisduplicated)andthusdecreasetheDnaAlevelavailable;ATPlevelandthereplacementofDnaA-ADPtoDnaA-ATPisaslowprocess.E.ColiDNAreplicationisregu119復制過程中產(chǎn)生正超螺旋。拓撲異構(gòu)酶消除正超螺旋。六、DNA復制需要兩類DNA拓撲異構(gòu)酶復制過程中產(chǎn)生正超螺旋。六、DNA復制需要兩類DNA拓撲異構(gòu)120E.coIi的TopoⅠ只作用于負超螺旋DNA，消除負超螺旋。

DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的功能：E.coIi的TopoⅠ只作用于負超螺旋DNA，消除負超螺旋121E.coli的TopoⅡ?qū)⑶胺疆a(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨摮菪NA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的功能E.coli的TopoⅡ?qū)⑶胺疆a(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨摮菪?22E.coli的TopoⅣ分離連環(huán)體E.coli的TopoⅣ分離連環(huán)體123ReplicationterminationinEukaryotes:

TheendreplicationproblemPage333ReplicationterminationinEuk124Solution1:Proteinprimingasasolutiontotheendreplicationproblem.Solution1:Proteinprimingas125Solution2:Replicationoftelomeresby

telomeraseSolution2:Replicationoftel126ReplicationoftelomeresbytelomeraseReplicationoftelomeresbyte127線粒體和噬菌體的DNA復制DNAreplicationinmitochondriaandphages第五節(jié)線粒體和噬菌體的DNA復制DNAreplicationi128一、線粒體DNA按D環(huán)方式復制環(huán)形、雙螺旋DNA分子、一條H鏈和一條L鏈dNTPDNA-polγ

線粒體DNA分子特點：兩條鏈具有不同的復制起點和相反的合成方向；一、線粒體DNA按D環(huán)方式復制環(huán)形、雙螺旋DNA分子、一條H129二、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復制環(huán)形雙螺旋DNA分子；一條為模板鏈，另一條為非模板鏈??E.coli噬菌體DNA的分子結(jié)構(gòu)特點：二、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復制環(huán)形雙螺旋DNA分子；E.co1303-OH5-P55533335'滾環(huán)復制5'53353-OH5-P55533335'滾環(huán)復制5131DNApolymeraseerrorratesInitialpairingerror=1/105Afterproofreading-Finalcopy=1/107Actualerrorrates~1/109Humangenome=3.2x109bp3errors/replication!DNApolymeraseerrorratesInit132MutationofDNAToofast:harmfultosurvivalandproliferation;Tooslow:lackofevolutionforce.MutationofDNAToofast:harmf133DNAdamageandrepairDNADamage:AnychangesintheDNAmoleculeisreferedtoas~.Mutation:ApermanentchangeinthenucleotidesequenceofDNAiscalledamutation.DNAdamageandrepairDNADamag134ImportanceofDNARepair?DNAistheonlybiologicalmacromoleculethatisrepaired.Allothersarereplaced.?Morethan100genesarerequiredforDNArepair,eveninorganismswithverysmallgenomes.?CancerisaconsequenceofinadequateDNArepair.ImportanceofDNARepair135DNA損傷修復TheRepairofDNADamage第六節(jié)DNA損傷修復第六節(jié)136一、復制差錯和化學/物理因素造成體內(nèi)DNA損傷DNA復制產(chǎn)生誤差化學或物理損傷轉(zhuǎn)座子（transposons）的轉(zhuǎn)座作用自發(fā)突變遺傳信息的突變來源：一、復制差錯和化學/物理因素造成體內(nèi)DNA損傷DNA復制產(chǎn)生137首先，在基因組中迅速找到錯配的核苷酸；然后，準確地校正錯配核苷酸。二、錯配修復系統(tǒng)修復DNA復制中出現(xiàn)的差錯錯配修復系統(tǒng)（mismatchrepairsystem）能夠發(fā)現(xiàn)和修復DNA復制中錯配的核苷酸，提高復制準確率。錯配修復系統(tǒng)：首先，在基因組中迅速找到錯配的核苷酸；二、錯配修復系統(tǒng)修復D138E.coli錯配修復系統(tǒng)修復復制差錯（一）E.coli依賴Dam甲基化酶識別錯配堿基所在的DNA鏈E.coli錯配修復系統(tǒng)修復復制差錯（一）E.coli依賴D139模板鏈的GATC序列甲基化MutH僅切割新合成的DNA鏈MutH僅切割新合成的DNA鏈模板鏈的GATC序列甲基化MutH僅切割新合成的DNA鏈140MSH（MutShomologs）蛋白與MutL同源的MLH和PMS蛋白（二）真核細胞利用岡崎片段連接前的DNA缺口辨別錯配堿基所在的DNA鏈真核細胞錯配修復系統(tǒng)無MutH，也無半甲基化標記母鏈。錯配修復系統(tǒng)利用岡崎片段連接前的DNA缺口辨別錯配堿基所在的DNA鏈。真核細胞核苷酸修復錯配系統(tǒng)：MSH（MutShomologs）蛋白（二）真核細胞利用岡141三、多種化學或物理因素造成細胞DNA損傷堿基丟失堿基改變核苷酸插入或缺失DNA鏈斷裂DNA鏈間共價交聯(lián)DNA損傷類型其一，導致復制或轉(zhuǎn)錄障礙其二，導致復制后產(chǎn)生基因突變DNA損傷的結(jié)果:三、多種化學或物理因素造成細胞DNA損傷堿基丟失DNA損傷類142四、DNA損傷修復系統(tǒng)有多種類型DNA聚合酶（Y-家族），如E.coli：UmuC嘧啶二聚體，無嘌呤位點跨損傷DNA合成E.coli：RecA和RecBCD雙鏈斷裂重組修復E.coli：UvrA,UvrB,UvrC,UvrD人：XPC,XP