微生物藥物產生菌菌種的保藏與質量控制課件

微生物藥物產生菌的保藏和質量控制劉紅宇微生物藥物產生菌的保藏和質量控制劉紅宇12微生物藥物產生菌微生物藥物產生菌菌種管理微生物藥物產生菌菌種退化微生物藥物產生菌菌種保藏與質量控制主要內容2微生物藥物產生菌主要內容微生物藥物產生菌主要包括細菌、放線菌和真菌。被描述的微生物藥物大約近兩萬種?？辜毦?青霉素(Penicillin)

P.notatum降血脂:他汀類(Statins)

P.brevicompactum,A.terreus,Monascusruber免疫抑制劑:環(huán)孢素(CyclosporinA)Tolypocladiuminflatum抗真菌:棘白霉素類(Echinocandins)

A.nidulans

一、微生物藥物產生菌微生物藥物產生菌主要包括細菌、放線菌和真菌。被描述的微生物藥3實驗室必須建立和保存其所有菌種的進出、收集、貯藏、確認試驗以及銷毀的記錄，應有菌種管理的程序文件—2015中國藥典標準菌種的申購記錄；從標準菌株到工作菌株操作及記錄；菌種必須定期轉種傳代，并做純度、特性等實驗室所需關鍵指標的確認，并記錄；每支菌種都應注明其名稱、標準號、接種日期、傳代數；菌種生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件；菌種保藏的位置和條件；其他需要的程序.二、微生物藥物產生菌菌種管理實驗室必須建立和保存其所有菌種的進出、收集、貯藏、確認試驗以4二、微生物藥物產生菌菌種管理對活純性狀穩(wěn)定

微生物菌種實物管理微生物菌種信息管理保證菌種實物與信息的一致性二、微生物藥物產生菌菌種管理對活純性狀5菌種一致菌種相關信息入庫菌株菌種基本信息數據庫保菌方法的研究與完善確定保藏方式-80℃低溫凍結、冷凍干燥、液氮保藏實物庫出庫錄入相關保藏過程信息如保護劑、凍干曲線等菌種入庫數據庫入庫信息錄入菌種入庫實物庫管理出庫數據庫菌種實物入庫復核復份用戶一致一致純度檢測和復核鑒定等分類鑒定審核實物管理信息管理菌種一致菌種相關信息入庫菌株菌種基本信息數據庫保菌方法的研究6二、微生物藥物產生菌菌種管理菌種的來源應來自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，使用與標準菌株所有相關特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株。-2015版中國藥典二、微生物藥物產生菌菌種管理菌種的來源7菌種一致菌種相關信息擬入庫菌株菌種基本信息數據庫保菌方法的研究與完善確定保藏方式-80℃低溫凍結、冷凍干燥、液氮保藏實物庫出庫錄入相關保藏過程信息如保護劑、凍干曲線等菌種入庫數據庫入庫信息錄入菌種入庫實物庫管理出庫數據庫菌種實物入庫復核復份用戶一致一致純度檢測和復核鑒定等分類鑒定審核實物管理信息管理菌種一致菌種相關信息擬入庫菌株菌種基本信息數據庫保菌方法的研8

純度檢測和復核純度檢測和復核標準儲備菌株標準儲備菌株標準菌株工作菌株純度檢測和復核使用標準儲備菌株制備工作菌株標準菌株的復蘇、復壯或培養(yǎng)物的制備應按供應商提供的說明或按已驗證的方法進行;標準菌株如果經過確認試驗證明已經老化、退化、變異、污染等或該菌株已無使用需要時，應及時滅菌銷毀；標準儲備菌株應進行純度和特性確認。-2015版中國藥典二、微生物藥物產生菌菌種管理純度檢測和復核純度檢測和復核標9菌種一致菌種相關信息擬入庫菌株菌種基本信息數據庫保菌方法的研究與完善確定保藏方式-80℃低溫凍結、冷凍干燥、液氮保藏實物庫出庫錄入相關保藏過程信息如保護劑、凍干曲線等菌種入庫數據庫入庫信息錄入菌種入庫實物庫管理出庫數據庫菌種實物入庫復核復份用戶一致一致純度檢測和復核鑒定等分類鑒定審核實物管理信息管理菌種一致菌種相關信息擬入庫菌株菌種基本信息數據庫保菌方法的研10微生物藥物產生菌菌種退化

微生物藥物產生菌經過多次傳代或長期保持菌種的一個或多個優(yōu)良特性逐步減退或消失，稱為微生物藥物產生菌菌種的退化。

三、微生物藥物產生菌菌種退化在實際生產中，培養(yǎng)條件的變化也會導致菌種形態(tài)和生理上的變化，但是只要培養(yǎng)條件恢復正常，菌種原有性能就能恢復正常，因此培養(yǎng)條件引起的菌種變化是不能稱為菌種退化的。藥用微生物產生菌菌種退化的鑒別微生物藥物產生菌菌種退化微生物藥物產生菌經過多次傳代或11微生物藥物產生菌菌種退化微生物藥物產生菌菌種退化主要表現(xiàn)在微生物的形態(tài)、生理特性及微生物藥物生產能力等方面的變化：1.細胞形態(tài)改變，產孢子能力下降。2.培養(yǎng)特征異常，典型性狀變?yōu)椴坏湫汀?.對不良環(huán)境如低溫、高溫條件或噬菌體的侵染的抵抗力下降。4.營養(yǎng)需求發(fā)生改變。5.在生產上常見的退化現(xiàn)象有：微生物藥物生產能力下降，生產的速度變慢。

三、微生物藥物產生菌菌種退化

微生物藥物產生菌菌種退化微生物藥物產生菌菌種退化主要表現(xiàn)在微12防止微生物藥物產生菌菌種退化的方法

三、微生物藥物產生菌菌種退化1.控制轉接傳代次數2.采用良好的培養(yǎng)條件3.采用有效保藏方法微生物藥物產生菌菌種退化的原因1.自發(fā)突變與回復突變2.細胞本身自我調節(jié)和修復3.環(huán)境條件的影響防止微生物藥物產生菌菌種退化的方法三、微生物藥物產生菌菌13適合的菌種保藏方法保證菌種的存活

并防止菌種退化冷凍干燥保藏法

-80度低溫冷凍法

液氮超低溫保藏法

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低溫冷凍（低于-30℃）等方法保存；低于-70℃或低溫冷凍干燥方法可以延長菌種保存時間。---2015版中國藥典適合的菌種保藏方法保證菌種的存活

并防止菌種退化四、微生物藥14四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法15冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法是將菌種懸液在凍結狀態(tài)下升華其中的水分,使得菌種處于干燥、低溫和缺氧的條件下，從而得以長期保存的菌種保藏法。原理：將含水量大的微生物菌種預先冷凍在真空條件下利用升華現(xiàn)象除去水分，細胞的生理活動趨于停止，從而能夠長期維持生活狀態(tài)。適用范圍：大多數細菌和放線菌。部分真菌和酵母菌。優(yōu)點：保存時間長、輸送、貯存方便等優(yōu)點。缺點：冷凍干燥過程對細胞有損傷,操作步驟繁多，需要一定設備。四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法是將菌種懸液在凍結狀態(tài)下升華其中16冷凍干燥保藏法四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法安瓿管準備酸洗水洗蒸餾水洗加標簽及棉塞滅菌菌種制備菌液培養(yǎng)（固體或液體）分裝安瓿管安瓿管預凍冷凍干燥開始適當升溫（促進干燥）凍干結束安瓿管封口檢查真空度保護劑的選擇與準備分裝滅菌保藏（低溫避光）冷凍干燥保藏法四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法安瓿17冷凍干燥過程的影響因素四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法冷凍干燥過程的影響因素四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏18冷凍干燥保藏法的影響因素

微生物菌種不同發(fā)育階段

菌體濃度

降溫速率

保護劑、抗誘變劑及修飾劑的使用合適的凍干曲線二次抽真空復水及培養(yǎng)條件四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法冷凍干燥保藏法的影響因素微生物菌種不同發(fā)育階段四、192022/12/16-80度低溫冷凍法將欲保存的菌種懸液密封于凍存管后儲藏于-80℃的冰箱中的保藏方法。原理：使微生物處于低溫狀態(tài)下使細胞的代謝減緩或趨于停止。

適應范圍：各種類型微生物。優(yōu)點：簡便有效，在沒有液氮的地區(qū)購置深凍冰箱保藏菌種較易推廣。缺點：斷電或機械故障菌種易融化死亡。

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法2022/12/12-80度低溫冷凍法將欲保存的菌種懸液密封202022/12/16液氮超低溫保藏法將欲保存的菌種懸液密封于凍存管中，經控制速度凍結后，儲藏于-196℃的液態(tài)氮或-150℃的氣態(tài)氮中的長期保藏方法稱為液氮超低溫保藏法。原理：微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止。在此溫度下保藏，微生物處于休眠狀態(tài)，可減少死亡或變異。

優(yōu)點：保存時間長,死亡率低,變異少,活性相對穩(wěn)定。缺點：某些地方液氮不易得到適用范圍：各類微生物

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法2022/12/12液氮超低溫保藏法將欲保存的菌種懸液密封于21-80度低溫凍結與液氮保藏比較

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法

-80度低溫凍結保藏液氮超低溫保藏

存活率（%）活力（%）存活率（%）活力（%）大觀霉素產生菌69806280中生菌素產生菌70836788麥迪霉素產生菌80818777-80度低溫凍結與液氮保藏比較

四、微生物藥物產生菌菌222022/12/16-80度低溫冷凍法&

液氮超低溫保藏法的影響因素

微生物菌種的發(fā)育階段

菌體濃度降溫速率保護劑、抗誘變劑及修飾劑的使用升溫速率及培養(yǎng)條件

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法2022/12/12-80度低溫冷凍法&液氮超低溫保藏法23微生物菌種不同發(fā)育階段

與保藏的關系細菌和酵母菌凍干靜止期菌齡的細胞，其存活率高于對數生長期和衰老期的細胞，幼齡和老齡細胞均不適用。對于放線菌要求形成成熟的孢子為宜，而幼齡和老齡的細胞對凍干比較敏感。

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素微生物菌種不同發(fā)育階段

與保藏的關系四、微生物藥物產生菌菌種24菌體濃度對于抗生素產生菌存活力的影響四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素菌體濃度對于抗生素產生菌存活力的影響四、微生物藥物產生菌菌種25控制降溫速率D.Smith等人應用溫控冷凍光顯微術（Temperature-controlledCrygenicLightmicroscopy）觀察真菌在冷凍與融化過程中引起細胞的損傷情況。發(fā)現(xiàn)不同種對于冷凍產生不同反應冷凍光顯微術的使用，可以更直接觀察到冷凍速率對細胞的影響，指導降溫速率的控制，提高菌種的遺傳穩(wěn)定性。四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素控制降溫速率D.Smith等人應用溫控冷凍光顯微術（Temp26控制降溫速率四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素據報道酵母合適的冷凍速度為3-10℃/min，乳酸菌為3-5℃/min，放線菌為1℃/min?？刂平禍厮俾仕?、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素據27使細胞在凍干過程中免于死亡或損傷，并減少在保藏過程中的死亡；作為支持物和受體在復水過程中為干物質提供一定的骨架結構，防止復水時引起的死亡，并使菌體容易從休眠狀態(tài)恢復為生長發(fā)育狀態(tài)。

據報道適合的保護劑可以使微生物細胞的成活率接近99.8%。保護劑是保護性溶質，通過氫和離子鍵對水和細胞所產生的親合力來穩(wěn)定細胞成分的構型，保護劑可替代結合水而穩(wěn)定細胞的構型。對某些微生物，加保護劑反而有害。保護劑的作用四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏影響因素使細胞在凍干過程中免于死亡或損傷，并減少在保藏過程中的死28很多菌種保藏機構如美國ATCC采用的保護劑多達有100多種。如脫脂牛奶、甘油、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸等通常與其他物質混合使用。保護劑的種類四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏影響因素很多菌種保藏機構如美國ATCC采用的保護劑多達有100多種。29

不同保護劑對冷凍干燥后抗生素產生菌存活率的影響

不同保護劑對冷凍干燥后抗生素產生菌生產能力的影響牛奶明膠10%甘油20%甘油DMSOStreptomycesclavuligerus突變株克拉維酸產生菌81%63%13%0.25%0.12%Streptomycesmycarofaciens分離株麥迪霉素85%60%76%38%74%Streptomycesmycarofaciens突變株麥迪霉素58%65%25%20%47%Streptomycessp.（Streptomyceskitasatoensis）突變株

71%23%35%23%11%四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏影響因素不同保護劑對冷凍干30

牛奶明膠10%甘油20%甘油DMSOStreptomycesclavuligerus突變株98%96%94%80%80%Streptomycesmycarofaciens分離株83%60%80%82%73%Streptomycesmycarofaciens突變株82%91%80%50%55%Streptomycessp.（Streptomyceskitasatoensis）突變株85%57%85%不同保護劑對冷凍干燥后抗生素產生菌生產力的影響

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏影響因素牛奶明膠31抗誘變劑及修飾劑的使用在菌種保藏過程中添加抗誘變劑可以減少突變體產生，阻礙誘變劑同DNA的相互作用。抗誘變劑具有高度特異性?？拐T變劑主要有：嘌呤核苷酸、錳離子、L-甲硫氨酸、組氨酸、精胺、多氨、咖啡因等。近年來還發(fā)現(xiàn)一些修飾劑（如對氨基苯甲酸）對于鏈霉菌性狀的穩(wěn)定有實際意義。四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素抗誘變劑及修飾劑的使用四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響32共晶點的概念四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素溶液隨溫度降低而發(fā)生凝固凍結，達到全部凝固凍結的溫度稱為凝固點或稱共晶點。不同物質的凝固點不同。由于凍干是在真空狀態(tài)下進行的，只有制品全部凍結后才能在真空下進行升華。共晶點的概念四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素溶33保護劑與共晶點四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏影響因素LyoprotectantTeut(°C)Tg(°C)Tprim.dr.phase(°C)12%(w/v)sm?16?18?2312%(w/v)sm+7%(w/v)tr?17?25?3012%(w/v)sm+7%(w/v)tr+1%(w/v)Na-gl?24?29?34EutecticTemperature,Glass-TransitionTemperature,andTemperaturePrimaryDryingPhaseofVariousLyoprotectants

Na-gl,Na-glutamate;sm,skimmilk;Teut,eutectictemperature;Tg,glass-transitiontemperature;Tprim.Dr.phase,primarydryingphase;tr,trehalose.保護劑與共晶點四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏影響因素34共晶點的測定四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏影響因素當溫度降低時電阻增大，當降到共熔點時電阻即出現(xiàn)突然增大現(xiàn)象，此時的溫度即是該溶液物質的共熔點。共晶點的測定四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏影響因素當351.保藏方法各個環(huán)節(jié)的細化和完善降溫速率的控制保護劑抗誘變劑的種類增多共晶點測定適合的凍干曲線2.玻璃化速凍部分真菌保藏四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法新進展四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法新進展36網址:

地址:北京市天壇西里1號，中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所郵編:100050

微生物菌種購買和保藏,email:cpcc@Tel:01063161934微生物菌種鑒定email:taxonomy@Tel:01083167110歡迎與我中心合作研究！網址:

地址:37微生物藥物產生菌的保藏和質量控制劉紅宇微生物藥物產生菌的保藏和質量控制劉紅宇3839微生物藥物產生菌微生物藥物產生菌菌種管理微生物藥物產生菌菌種退化微生物藥物產生菌菌種保藏與質量控制主要內容2微生物藥物產生菌主要內容微生物藥物產生菌主要包括細菌、放線菌和真菌。被描述的微生物藥物大約近兩萬種?？辜毦?青霉素(Penicillin)

P.notatum降血脂:他汀類(Statins)

P.brevicompactum,A.terreus,Monascusruber免疫抑制劑:環(huán)孢素(CyclosporinA)Tolypocladiuminflatum抗真菌:棘白霉素類(Echinocandins)

A.nidulans

一、微生物藥物產生菌微生物藥物產生菌主要包括細菌、放線菌和真菌。被描述的微生物藥40實驗室必須建立和保存其所有菌種的進出、收集、貯藏、確認試驗以及銷毀的記錄，應有菌種管理的程序文件—2015中國藥典標準菌種的申購記錄；從標準菌株到工作菌株操作及記錄；菌種必須定期轉種傳代，并做純度、特性等實驗室所需關鍵指標的確認，并記錄；每支菌種都應注明其名稱、標準號、接種日期、傳代數；菌種生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件；菌種保藏的位置和條件；其他需要的程序.二、微生物藥物產生菌菌種管理實驗室必須建立和保存其所有菌種的進出、收集、貯藏、確認試驗以41二、微生物藥物產生菌菌種管理對活純性狀穩(wěn)定

微生物菌種實物管理微生物菌種信息管理保證菌種實物與信息的一致性二、微生物藥物產生菌菌種管理對活純性狀42菌種一致菌種相關信息入庫菌株菌種基本信息數據庫保菌方法的研究與完善確定保藏方式-80℃低溫凍結、冷凍干燥、液氮保藏實物庫出庫錄入相關保藏過程信息如保護劑、凍干曲線等菌種入庫數據庫入庫信息錄入菌種入庫實物庫管理出庫數據庫菌種實物入庫復核復份用戶一致一致純度檢測和復核鑒定等分類鑒定審核實物管理信息管理菌種一致菌種相關信息入庫菌株菌種基本信息數據庫保菌方法的研究43二、微生物藥物產生菌菌種管理菌種的來源應來自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，使用與標準菌株所有相關特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株。-2015版中國藥典二、微生物藥物產生菌菌種管理菌種的來源44菌種一致菌種相關信息擬入庫菌株菌種基本信息數據庫保菌方法的研究與完善確定保藏方式-80℃低溫凍結、冷凍干燥、液氮保藏實物庫出庫錄入相關保藏過程信息如保護劑、凍干曲線等菌種入庫數據庫入庫信息錄入菌種入庫實物庫管理出庫數據庫菌種實物入庫復核復份用戶一致一致純度檢測和復核鑒定等分類鑒定審核實物管理信息管理菌種一致菌種相關信息擬入庫菌株菌種基本信息數據庫保菌方法的研45

純度檢測和復核純度檢測和復核標準儲備菌株標準儲備菌株標準菌株工作菌株純度檢測和復核使用標準儲備菌株制備工作菌株標準菌株的復蘇、復壯或培養(yǎng)物的制備應按供應商提供的說明或按已驗證的方法進行;標準菌株如果經過確認試驗證明已經老化、退化、變異、污染等或該菌株已無使用需要時，應及時滅菌銷毀；標準儲備菌株應進行純度和特性確認。-2015版中國藥典二、微生物藥物產生菌菌種管理純度檢測和復核純度檢測和復核標46菌種一致菌種相關信息擬入庫菌株菌種基本信息數據庫保菌方法的研究與完善確定保藏方式-80℃低溫凍結、冷凍干燥、液氮保藏實物庫出庫錄入相關保藏過程信息如保護劑、凍干曲線等菌種入庫數據庫入庫信息錄入菌種入庫實物庫管理出庫數據庫菌種實物入庫復核復份用戶一致一致純度檢測和復核鑒定等分類鑒定審核實物管理信息管理菌種一致菌種相關信息擬入庫菌株菌種基本信息數據庫保菌方法的研47微生物藥物產生菌菌種退化

微生物藥物產生菌經過多次傳代或長期保持菌種的一個或多個優(yōu)良特性逐步減退或消失，稱為微生物藥物產生菌菌種的退化。

三、微生物藥物產生菌菌種退化在實際生產中，培養(yǎng)條件的變化也會導致菌種形態(tài)和生理上的變化，但是只要培養(yǎng)條件恢復正常，菌種原有性能就能恢復正常，因此培養(yǎng)條件引起的菌種變化是不能稱為菌種退化的。藥用微生物產生菌菌種退化的鑒別微生物藥物產生菌菌種退化微生物藥物產生菌經過多次傳代或48微生物藥物產生菌菌種退化微生物藥物產生菌菌種退化主要表現(xiàn)在微生物的形態(tài)、生理特性及微生物藥物生產能力等方面的變化：1.細胞形態(tài)改變，產孢子能力下降。2.培養(yǎng)特征異常，典型性狀變?yōu)椴坏湫汀?.對不良環(huán)境如低溫、高溫條件或噬菌體的侵染的抵抗力下降。4.營養(yǎng)需求發(fā)生改變。5.在生產上常見的退化現(xiàn)象有：微生物藥物生產能力下降，生產的速度變慢。

三、微生物藥物產生菌菌種退化

微生物藥物產生菌菌種退化微生物藥物產生菌菌種退化主要表現(xiàn)在微49防止微生物藥物產生菌菌種退化的方法

三、微生物藥物產生菌菌種退化1.控制轉接傳代次數2.采用良好的培養(yǎng)條件3.采用有效保藏方法微生物藥物產生菌菌種退化的原因1.自發(fā)突變與回復突變2.細胞本身自我調節(jié)和修復3.環(huán)境條件的影響防止微生物藥物產生菌菌種退化的方法三、微生物藥物產生菌菌50適合的菌種保藏方法保證菌種的存活

并防止菌種退化冷凍干燥保藏法

-80度低溫冷凍法

液氮超低溫保藏法

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低溫冷凍（低于-30℃）等方法保存；低于-70℃或低溫冷凍干燥方法可以延長菌種保存時間。---2015版中國藥典適合的菌種保藏方法保證菌種的存活

并防止菌種退化四、微生物藥51四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法52冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法是將菌種懸液在凍結狀態(tài)下升華其中的水分,使得菌種處于干燥、低溫和缺氧的條件下，從而得以長期保存的菌種保藏法。原理：將含水量大的微生物菌種預先冷凍在真空條件下利用升華現(xiàn)象除去水分，細胞的生理活動趨于停止，從而能夠長期維持生活狀態(tài)。適用范圍：大多數細菌和放線菌。部分真菌和酵母菌。優(yōu)點：保存時間長、輸送、貯存方便等優(yōu)點。缺點：冷凍干燥過程對細胞有損傷,操作步驟繁多，需要一定設備。四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法是將菌種懸液在凍結狀態(tài)下升華其中53冷凍干燥保藏法四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法安瓿管準備酸洗水洗蒸餾水洗加標簽及棉塞滅菌菌種制備菌液培養(yǎng)（固體或液體）分裝安瓿管安瓿管預凍冷凍干燥開始適當升溫（促進干燥）凍干結束安瓿管封口檢查真空度保護劑的選擇與準備分裝滅菌保藏（低溫避光）冷凍干燥保藏法四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法安瓿54冷凍干燥過程的影響因素四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法冷凍干燥過程的影響因素四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏55冷凍干燥保藏法的影響因素

微生物菌種不同發(fā)育階段

菌體濃度

降溫速率

保護劑、抗誘變劑及修飾劑的使用合適的凍干曲線二次抽真空復水及培養(yǎng)條件四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法冷凍干燥保藏法的影響因素微生物菌種不同發(fā)育階段四、562022/12/16-80度低溫冷凍法將欲保存的菌種懸液密封于凍存管后儲藏于-80℃的冰箱中的保藏方法。原理：使微生物處于低溫狀態(tài)下使細胞的代謝減緩或趨于停止。

適應范圍：各種類型微生物。優(yōu)點：簡便有效，在沒有液氮的地區(qū)購置深凍冰箱保藏菌種較易推廣。缺點：斷電或機械故障菌種易融化死亡。

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法2022/12/12-80度低溫冷凍法將欲保存的菌種懸液密封572022/12/16液氮超低溫保藏法將欲保存的菌種懸液密封于凍存管中，經控制速度凍結后，儲藏于-196℃的液態(tài)氮或-150℃的氣態(tài)氮中的長期保藏方法稱為液氮超低溫保藏法。原理：微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止。在此溫度下保藏，微生物處于休眠狀態(tài)，可減少死亡或變異。

優(yōu)點：保存時間長,死亡率低,變異少,活性相對穩(wěn)定。缺點：某些地方液氮不易得到適用范圍：各類微生物

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法2022/12/12液氮超低溫保藏法將欲保存的菌種懸液密封于58-80度低溫凍結與液氮保藏比較

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法

-80度低溫凍結保藏液氮超低溫保藏

存活率（%）活力（%）存活率（%）活力（%）大觀霉素產生菌69806280中生菌素產生菌70836788麥迪霉素產生菌80818777-80度低溫凍結與液氮保藏比較

四、微生物藥物產生菌菌592022/12/16-80度低溫冷凍法&

液氮超低溫保藏法的影響因素

微生物菌種的發(fā)育階段

菌體濃度降溫速率保護劑、抗誘變劑及修飾劑的使用升溫速率及培養(yǎng)條件

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏方法2022/12/12-80度低溫冷凍法&液氮超低溫保藏法60微生物菌種不同發(fā)育階段

與保藏的關系細菌和酵母菌凍干靜止期菌齡的細胞，其存活率高于對數生長期和衰老期的細胞，幼齡和老齡細胞均不適用。對于放線菌要求形成成熟的孢子為宜，而幼齡和老齡的細胞對凍干比較敏感。

四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素微生物菌種不同發(fā)育階段

與保藏的關系四、微生物藥物產生菌菌種61菌體濃度對于抗生素產生菌存活力的影響四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素菌體濃度對于抗生素產生菌存活力的影響四、微生物藥物產生菌菌種62控制降溫速率D.Smith等人應用溫控冷凍光顯微術（Temperature-controlledCrygenicLightmicroscopy）觀察真菌在冷凍與融化過程中引起細胞的損傷情況。發(fā)現(xiàn)不同種對于冷凍產生不同反應冷凍光顯微術的使用，可以更直接觀察到冷凍速率對細胞的影響，指導降溫速率的控制，提高菌種的遺傳穩(wěn)定性。四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素控制降溫速率D.Smith等人應用溫控冷凍光顯微術（Temp63控制降溫速率四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素據報道酵母合適的冷凍速度為3-10℃/min，乳酸菌為3-5℃/min，放線菌為1℃/min。控制降溫速率四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-影響保藏因素據64使細胞在凍干過程中免于死亡或損傷，并減少在保藏過程中的死亡；作為支持物和受體在復水過程中為干物質提供一定的骨架結構，防止復水時引起的死亡，并使菌體容易從休眠狀態(tài)恢復為生長發(fā)育狀態(tài)。

據報道適合的保護劑可以使微生物細胞的成活率接近99.8%。保護劑是保護性溶質，通過氫和離子鍵對水和細胞所產生的親合力來穩(wěn)定細胞成分的構型，保護劑可替代結合水而穩(wěn)定細胞的構型。對某些微生物，加保護劑反而有害。保護劑的作用四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏影響因素使細胞在凍干過程中免于死亡或損傷，并減少在保藏過程中的死65很多菌種保藏機構如美國ATCC采用的保護劑多達有100多種。如脫脂牛奶、甘油、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸等通常與其他物質混合使用。保護劑的種類四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏影響因素很多菌種保藏機構如美國ATCC采用的保護劑多達有100多種。66

不同保護劑對冷凍干燥后抗生素產生菌存活率的影響

不同保護劑對冷凍干燥后抗生素產生菌生產能力的影響牛奶明膠10%甘油20%甘油DMSOStreptomycesclavuligerus突變株克拉維酸產生菌81%63%13%0.25%0.12%Streptomycesmycarofaciens分離株麥迪霉素85%60%76%38%74%Streptomycesmycarofaciens突變株麥迪霉素58%65%25%20%47%Streptomycessp.（Streptomyceskitasatoensis）突變株

71%23%35%23%11%四、微生物藥物產生菌菌種質量控制-保藏影響因素不同保護劑對冷凍干67

牛奶明膠10%甘油20%甘油DMSOStreptomycesclavuligerus突變株98%96%94%80%80%Streptomycesmycarofaciens分離株83%60%80%82%73%Streptomycesmycarofaciens突變株82%91%80%50%