文娟課件2整理版

產(chǎn)前診斷技術及羊水、絨毛細胞培養(yǎng)中南大學醫(yī)學遺傳學國家重點實驗室湖南家輝遺傳?？漆t(yī)院

文娟wenjuan@產(chǎn)前診斷技術及羊水、絨毛細胞培養(yǎng)中南大學醫(yī)學遺傳學國家重點實產(chǎn)前診斷的定義產(chǎn)前診斷(prenataldiagnosis)

又稱宮內(nèi)診斷，指先天性疾病或遺傳性疾病的胎兒期的診斷，分為無創(chuàng)產(chǎn)前檢測和有創(chuàng)產(chǎn)前診斷。通過產(chǎn)前診斷可以在早孕期或中孕期對異常胎兒做出診斷，以便及時治療或處理。產(chǎn)前診斷的定義產(chǎn)前診斷(prenataldiagnos無創(chuàng)性檢查

1.母體血清三項篩查（

AFP、-hCG、uE3）

2.超聲影像檢查（B超、CT、MRI）

3.母體血中的胎兒細胞檢測（無創(chuàng)產(chǎn)前染色體非整倍體綜合征檢測技術）

無創(chuàng)性檢查

基于新一代測序技術的非侵入性產(chǎn)前染色體非整倍體綜合征檢測技術抽取外周血分離血漿文庫制備生物信息分析新一代測序基于新一代測序技術的非侵入性產(chǎn)前染色體非整倍體綜合征檢測技術無創(chuàng)產(chǎn)前檢測指征

高齡（年齡≥35歲），不愿選擇有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦；唐篩結果為高風險或者單項指標值改變，不愿選擇有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦；孕期B超胎兒NT值增高或其它解剖結構異常,不愿選擇有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦；具有創(chuàng)產(chǎn)前診斷禁忌癥的孕婦，如病毒攜帶者、胎盤前置、胎盤低置、羊水過少或過多、RH血型陰性、流產(chǎn)史、先兆流產(chǎn)或珍貴兒等；羊水穿刺細胞培養(yǎng)失敗不愿意再次接受或不能再進行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦；希望排除胎兒21三體、18三體、13三體綜合征，自愿選擇行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的孕婦。

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測指征

高齡（年齡≥35歲），不愿選擇有創(chuàng)產(chǎn)前診斷有創(chuàng)產(chǎn)前診斷

包括采用絨毛穿刺術、羊膜腔穿刺術、臍帶血穿刺術獲取胎兒細胞，利用染色體技術、微陣列技術（SNParray）和基因檢測技術對胎兒進行染色體病、基因組病和基因病的產(chǎn)前診斷，結合終止妊娠技術阻止患兒的出生。有創(chuàng)產(chǎn)前診斷包括采用絨毛穿刺術、羊膜腔穿刺術有創(chuàng)產(chǎn)前診斷

1.絨毛膜穿刺（

孕10周-13周+6）

2.羊膜腔穿刺（孕16周-22周+6）

3.臍靜脈穿刺（18周之后）

4.胎兒鏡檢查（根據(jù)檢查目的確定檢查時間）

有創(chuàng)產(chǎn)前診斷有創(chuàng)產(chǎn)前診斷指征1、夫婦雙方家系中曾出生過有染色體病和基因組病患兒的孕婦；2、既往有生育智力低下、多發(fā)畸形、發(fā)育遲緩患兒的不良孕產(chǎn)史的孕婦；3、孕期曾接觸過可能導致胎兒先天缺陷的物質(zhì)（如放射線、毒物、化學藥劑、微生物等）的孕婦；4、希望通過一次性檢測排除染色體異常和基因組異常所致的嚴重致愚、致殘、致死性遺傳病的孕婦（發(fā)生率達2-3%）。5、可疑有單基因病或有單基因病家族史的孕婦。有創(chuàng)產(chǎn)前診斷指征1、夫婦雙方家系中曾出生過有染色體病和基因

羊膜腔穿刺（amniocentesis）

羊水細胞主要來自胎兒的皮膚、胃腸道、呼吸道和泌尿生殖道或羊膜內(nèi)層（表皮細胞、羊膜細胞、未分化細胞、吞噬細胞等），可用于核型分析、DNA診斷,羊水則可用于生化分析。羊膜腔穿刺（amniocentesis）文娟課件2整理版人羊水細胞培養(yǎng)及染色體制備

人的羊水細胞能長成單層并可連續(xù)進行傳代培養(yǎng)（50代），羊水中存在著各種不同類型的胎兒細胞，根據(jù)細胞形態(tài)和生長特征分為三類：上皮樣細胞（E）、成纖維樣細胞（F）和羊水細胞（AF）。人羊水細胞培養(yǎng)及染色體制備人的羊水細胞E細胞：呈致密生長，細胞集落邊界清晰，在胰酶消化的連續(xù)培養(yǎng)中不再生長，僅在原代培養(yǎng)時可見到，生長期最短。AF細胞：呈鳥眼狀，不同的孕婦的羊水中細胞體積可變化。F細胞：呈梭型，生長期最長，細胞分裂旺盛，在較老的羊水培養(yǎng)物中占優(yōu)勢。三種細胞的生長特性三種細胞的生長特性細胞接種在無菌條件下抽得3-4管（約20-30ml）羊水后，注入10ml離心管中，立即送檢；1500rpm，室溫離心10min；在無菌操作臺上吸去上清液，每管約留0.5ml，吸管打散細胞。制成細胞懸液，再加入約4.5ml完全培養(yǎng)基入管內(nèi)，吸管吹打，盡量將細胞打散，移至25cm2方形培養(yǎng)瓶中置含5%CO2的37℃溫箱行開放式培養(yǎng)。細胞接種在無菌條件下抽得3-4管（約20-30ml）羊水后，

一般5-6天后鏡下觀察，可見成纖維樣或上皮樣細胞生長，當細胞生長旺盛，在貼壁細胞層的背景上出現(xiàn)圓形細胞時，視情況換液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，如細胞生長狀況好，細胞密度適中，即可加入秋水仙素0.04ug-0.08ug/ml(20ug/

ml)，4-6小時左右行細胞學處理。細胞培養(yǎng)一般5-6天后鏡下觀察，可見成纖細胞收獲吸出瓶中細胞液入10ml離心管，生理鹽水沖洗細胞壁兩遍；0.25%EDTA-trypsin消化3-5分鐘，待細胞面出現(xiàn)肉眼可見皺形改變時即用吸管吹打細胞，直至全部脫落；收集細胞懸液：1500rpm，室溫離心10min，去上清；細胞收獲低滲：加入0.075MKCl6ml-7ml，吸管吹打，37℃水浴5min-10min;預固定：加入1.5ml左右3:1固定液，輕混勻,37℃水浴5min,1500rpm,室溫離心10min；固定：加入3:1固定劑8ml左右，輕混勻，37℃水浴10min；1500rpm,室溫離心10min，去上清，約留0.5ml；重復固定：同上；低滲：加入0.075MKCl6ml-7ml，吸管吹打，31500rpm，室溫離心10min，去上清；調(diào)懸液：視管底細胞量加入幾滴新鮮固定劑，并吹打混勻;滴片：每片1-2滴,滴片4-6張;烤片：75℃烤箱烘烤3小時;第二天行顯帶處理：同外周血。1500rpm，室溫離心10min，去上清；注意事項在抽取羊水前先引導孕婦做超或翻身，使胎兒脫落細胞懸浮在羊水中；羊水標本應及時送檢，送檢過程中不宜受熱或冰凍，實驗人員收到羊水后應先觀察羊水是否清亮，含胎脂的多少及是否為血性羊水；羊水中少量紅細胞不需處理；離心時，一定要注意離心機內(nèi)溫度，必須達到室溫方可離心；接種細胞密度很重要，離心后應根據(jù)細胞沉淀來決定幾管接種一瓶；注意事項在抽取羊水前先引導孕婦做超或翻身，使胎兒脫落細胞懸羊水培養(yǎng)首先必須有好的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH為7.2-7.4也是羊水細胞開放式培養(yǎng)成功的關鍵；注意接種時培養(yǎng)基不能加得過多，臥倒瓶子時，培養(yǎng)基不能接觸瓶蓋；抓住細胞生長旺盛時期相當重要，如羊水為血性羊水或胎質(zhì)較多須給予不同的處理。羊水培養(yǎng)首先必須有好的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH為7.2-7.4也是絨毛膜穿刺絨毛膜穿刺術(CVS）

絨毛組織位于胚囊之外且又具有和胚胎同樣的遺傳性，故早孕期絨毛活檢被廣泛應用于胎兒遺傳性疾病的產(chǎn)前診斷。1983年Simoni首次將其用于產(chǎn)前診斷，至今孕早期絨毛活檢已成為國內(nèi)外早期產(chǎn)前診斷常用的最有效的方法之一。

Fetus(10-13+6weeks)叢密絨毛膜平滑絨毛膜絨毛膜穿刺絨毛膜穿刺術(CVS）Fetus(10-13+6文娟課件2整理版絨毛活檢量

不同診斷目的所需的絨毛量不同，染色體分析約需絨毛10mg，DNA分析5mg即可,生化測定僅需3～5mg。故一次絨毛活檢獲取20mg左右的絨毛組織可滿足任何產(chǎn)前診斷的需要。絨毛活檢量優(yōu)點

1、早期診斷，減輕孕婦及家人的心理壓力；

2、取材簡便易行；3、培養(yǎng)方法及條件成熟，易掌握。優(yōu)缺點優(yōu)點優(yōu)缺點缺點1、有2%的絨毛樣本由于染色體嵌合，結果不能判斷，需進一步行羊膜腔穿刺確定是否有染色體異常；2、并發(fā)癥多：流產(chǎn)、出血、

宮內(nèi)感染、刺破胎膜、胎兒肢體發(fā)育缺陷。

優(yōu)缺點缺點優(yōu)缺點絨毛細胞培養(yǎng)與染色體制備方法直接法（優(yōu)點：不易污染。缺點：染色體形態(tài)不佳，分裂極少而不穩(wěn)定。）干貼壁法（優(yōu)點：操作簡便。缺點：絨毛要新鮮，相對于消化法其細胞生長稍慢。）消化法（產(chǎn)前診斷和流產(chǎn)絨毛培養(yǎng)常使用本方法。）絨毛細胞培養(yǎng)與染色體制備方法直接法（優(yōu)點：不易污染。缺點：染接種漂洗：1、

取3個平皿,編號1、2、3號，分別加入10mlPBS(無菌生理鹽水也可)，向三個平皿中依次加入終濃度為500U/ml、300U/ml、100U/ml的雙抗（氨芐青霉素+硫酸鏈霉素

），輕混勻。2、打開滅菌手術器械，用鑷子夾取標本至1號平皿中，再在三個平皿中依次進行漂洗。接種漂洗：分離：

用鑷子、剪刀等去掉多余血凝塊及蛻膜組織，在3號平皿中用眼科剪將組織均勻剪成小塊，用鑷子夾取一塊組織至15ml離心管口，用眼科剪盡量剪碎至大小約1-3mm3。分離：干貼壁：

用鑷子夾取一塊組織至T25方形瓶口，用眼科剪盡量剪碎至大小約1-3mm3，將剪碎的絨毛枝涂抹鋪平至平底貼壁面，平放3-5min后在其背面加入5ml培養(yǎng)基，置溫箱中行開放式培養(yǎng)，5小時后或次日早上翻瓶培養(yǎng)。干貼壁：消化法：

用吸管吸取3ml0.25%胰酶+0.02%EDTA沿管壁輕輕注入同時將管口組織沖至管底部，輕搖混勻，放至37℃水浴消化，每隔2min搖動一次。消化10-15min后，觀察液體如變渾濁、呈粘稠狀，立即加3ml培養(yǎng)基終止消化。消化法：細胞培養(yǎng)

一般3-7天在碎絨毛枝周圍可見成纖維樣細胞生長，細胞致密，形成的細胞集落小而多，根據(jù)生長情況決定換液次數(shù)（必要時進行原瓶消化）。培養(yǎng)6-20天，待細胞生長旺盛時，收獲細胞。絨毛細胞收獲與制片同羊水細胞。細胞培養(yǎng)

一般3-7天在碎絨毛枝周圍可見成纖維樣細胞生長，細注意事項由于接種時操作步驟較多，嚴格無菌操作是培養(yǎng)成功的關鍵；絨毛細胞由于生長致密，大多要進行原瓶消化，使得細胞盡量呈散在均勻生長，有利于細胞同步，收獲到的分裂相也較多；低滲之后每一步均應輕吹打，用力過大可能損失掉較多細胞。注意事項由于接種時操作步驟較多，嚴格無菌操作是培養(yǎng)成功的關鍵產(chǎn)前診斷技術及羊水、絨毛細胞培養(yǎng)中南大學醫(yī)學遺傳學國家重點實驗室湖南家輝遺傳?？漆t(yī)院

文娟wenjuan@產(chǎn)前診斷技術及羊水、絨毛細胞培養(yǎng)中南大學醫(yī)學遺傳學國家重點實產(chǎn)前診斷的定義產(chǎn)前診斷(prenataldiagnosis)

又稱宮內(nèi)診斷，指先天性疾病或遺傳性疾病的胎兒期的診斷，分為無創(chuàng)產(chǎn)前檢測和有創(chuàng)產(chǎn)前診斷。通過產(chǎn)前診斷可以在早孕期或中孕期對異常胎兒做出診斷，以便及時治療或處理。產(chǎn)前診斷的定義產(chǎn)前診斷(prenataldiagnos無創(chuàng)性檢查

1.母體血清三項篩查（

AFP、-hCG、uE3）

2.超聲影像檢查（B超、CT、MRI）

3.母體血中的胎兒細胞檢測（無創(chuàng)產(chǎn)前染色體非整倍體綜合征檢測技術）

無創(chuàng)性檢查

基于新一代測序技術的非侵入性產(chǎn)前染色體非整倍體綜合征檢測技術抽取外周血分離血漿文庫制備生物信息分析新一代測序基于新一代測序技術的非侵入性產(chǎn)前染色體非整倍體綜合征檢測技術無創(chuàng)產(chǎn)前檢測指征

高齡（年齡≥35歲），不愿選擇有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦；唐篩結果為高風險或者單項指標值改變，不愿選擇有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦；孕期B超胎兒NT值增高或其它解剖結構異常,不愿選擇有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦；具有創(chuàng)產(chǎn)前診斷禁忌癥的孕婦，如病毒攜帶者、胎盤前置、胎盤低置、羊水過少或過多、RH血型陰性、流產(chǎn)史、先兆流產(chǎn)或珍貴兒等；羊水穿刺細胞培養(yǎng)失敗不愿意再次接受或不能再進行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦；希望排除胎兒21三體、18三體、13三體綜合征，自愿選擇行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的孕婦。

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測指征

高齡（年齡≥35歲），不愿選擇有創(chuàng)產(chǎn)前診斷有創(chuàng)產(chǎn)前診斷

包括采用絨毛穿刺術、羊膜腔穿刺術、臍帶血穿刺術獲取胎兒細胞，利用染色體技術、微陣列技術（SNParray）和基因檢測技術對胎兒進行染色體病、基因組病和基因病的產(chǎn)前診斷，結合終止妊娠技術阻止患兒的出生。有創(chuàng)產(chǎn)前診斷包括采用絨毛穿刺術、羊膜腔穿刺術有創(chuàng)產(chǎn)前診斷

1.絨毛膜穿刺（

孕10周-13周+6）

2.羊膜腔穿刺（孕16周-22周+6）

3.臍靜脈穿刺（18周之后）

4.胎兒鏡檢查（根據(jù)檢查目的確定檢查時間）

有創(chuàng)產(chǎn)前診斷有創(chuàng)產(chǎn)前診斷指征1、夫婦雙方家系中曾出生過有染色體病和基因組病患兒的孕婦；2、既往有生育智力低下、多發(fā)畸形、發(fā)育遲緩患兒的不良孕產(chǎn)史的孕婦；3、孕期曾接觸過可能導致胎兒先天缺陷的物質(zhì)（如放射線、毒物、化學藥劑、微生物等）的孕婦；4、希望通過一次性檢測排除染色體異常和基因組異常所致的嚴重致愚、致殘、致死性遺傳病的孕婦（發(fā)生率達2-3%）。5、可疑有單基因病或有單基因病家族史的孕婦。有創(chuàng)產(chǎn)前診斷指征1、夫婦雙方家系中曾出生過有染色體病和基因

羊膜腔穿刺（amniocentesis）

羊水細胞主要來自胎兒的皮膚、胃腸道、呼吸道和泌尿生殖道或羊膜內(nèi)層（表皮細胞、羊膜細胞、未分化細胞、吞噬細胞等），可用于核型分析、DNA診斷,羊水則可用于生化分析。羊膜腔穿刺（amniocentesis）文娟課件2整理版人羊水細胞培養(yǎng)及染色體制備

人的羊水細胞能長成單層并可連續(xù)進行傳代培養(yǎng)（50代），羊水中存在著各種不同類型的胎兒細胞，根據(jù)細胞形態(tài)和生長特征分為三類：上皮樣細胞（E）、成纖維樣細胞（F）和羊水細胞（AF）。人羊水細胞培養(yǎng)及染色體制備人的羊水細胞E細胞：呈致密生長，細胞集落邊界清晰，在胰酶消化的連續(xù)培養(yǎng)中不再生長，僅在原代培養(yǎng)時可見到，生長期最短。AF細胞：呈鳥眼狀，不同的孕婦的羊水中細胞體積可變化。F細胞：呈梭型，生長期最長，細胞分裂旺盛，在較老的羊水培養(yǎng)物中占優(yōu)勢。三種細胞的生長特性三種細胞的生長特性細胞接種在無菌條件下抽得3-4管（約20-30ml）羊水后，注入10ml離心管中，立即送檢；1500rpm，室溫離心10min；在無菌操作臺上吸去上清液，每管約留0.5ml，吸管打散細胞。制成細胞懸液，再加入約4.5ml完全培養(yǎng)基入管內(nèi)，吸管吹打，盡量將細胞打散，移至25cm2方形培養(yǎng)瓶中置含5%CO2的37℃溫箱行開放式培養(yǎng)。細胞接種在無菌條件下抽得3-4管（約20-30ml）羊水后，

一般5-6天后鏡下觀察，可見成纖維樣或上皮樣細胞生長，當細胞生長旺盛，在貼壁細胞層的背景上出現(xiàn)圓形細胞時，視情況換液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，如細胞生長狀況好，細胞密度適中，即可加入秋水仙素0.04ug-0.08ug/ml(20ug/

ml)，4-6小時左右行細胞學處理。細胞培養(yǎng)一般5-6天后鏡下觀察，可見成纖細胞收獲吸出瓶中細胞液入10ml離心管，生理鹽水沖洗細胞壁兩遍；0.25%EDTA-trypsin消化3-5分鐘，待細胞面出現(xiàn)肉眼可見皺形改變時即用吸管吹打細胞，直至全部脫落；收集細胞懸液：1500rpm，室溫離心10min，去上清；細胞收獲低滲：加入0.075MKCl6ml-7ml，吸管吹打，37℃水浴5min-10min;預固定：加入1.5ml左右3:1固定液，輕混勻,37℃水浴5min,1500rpm,室溫離心10min；固定：加入3:1固定劑8ml左右，輕混勻，37℃水浴10min；1500rpm,室溫離心10min，去上清，約留0.5ml；重復固定：同上；低滲：加入0.075MKCl6ml-7ml，吸管吹打，31500rpm，室溫離心10min，去上清；調(diào)懸液：視管底細胞量加入幾滴新鮮固定劑，并吹打混勻;滴片：每片1-2滴,滴片4-6張;烤片：75℃烤箱烘烤3小時;第二天行顯帶處理：同外周血。1500rpm，室溫離心10min，去上清；注意事項在抽取羊水前先引導孕婦做超或翻身，使胎兒脫落細胞懸浮在羊水中；羊水標本應及時送檢，送檢過程中不宜受熱或冰凍，實驗人員收到羊水后應先觀察羊水是否清亮，含胎脂的多少及是否為血性羊水；羊水中少量紅細胞不需處理；離心時，一定要注意離心機內(nèi)溫度，必須達到室溫方可離心；接種細胞密度很重要，離心后應根據(jù)細胞沉淀來決定幾管接種一瓶；注意事項在抽取羊水前先引導孕婦做超或翻身，使胎兒脫落細胞懸羊水培養(yǎng)首先必須有好的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH為7.2-7.4也是羊水細胞開放式培養(yǎng)成功的關鍵；注意接種時培養(yǎng)基不能加得過多，臥倒瓶子時，培養(yǎng)基不能接觸瓶蓋；抓住細胞生長旺盛時期相當重要，如羊水為血性羊水或胎質(zhì)較多須給予不同的處理。羊水培養(yǎng)首先必須有好的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH為7.2-7.4也是絨毛膜穿刺絨毛膜穿刺術(CVS）

絨毛組織位于胚囊之外且又具有和胚胎同樣的遺傳性，故早孕期絨毛活檢被廣泛應用于胎兒遺傳性疾病的產(chǎn)前診斷。1983年Simoni首次將其用于產(chǎn)前診斷，至今孕早期絨毛活檢已成為國內(nèi)外早期產(chǎn)前診斷常用的最有效的方法之一。

Fetus(10-13+6weeks)叢密絨毛膜平滑絨毛膜絨毛膜穿刺絨毛膜穿刺術(CVS）Fetus(10-13+6文娟課件2整理版絨毛活檢量

不同診斷目的所需的絨毛量不同，染色體分析約需絨毛10mg，DNA分析5mg即可,生化測定僅需3～5mg。故一次絨毛活檢獲取20mg左右的絨毛組織可滿足任何產(chǎn)前診斷的需要。絨毛活檢量優(yōu)點

1、早期診斷，減輕孕婦及家人的心理壓力；

2、取材簡便易行；3、培養(yǎng)方法及條件成熟，易掌握。優(yōu)缺點優(yōu)點優(yōu)缺點缺點1、有2%的絨毛樣本由于染色體嵌合，結果不能判斷，需進一步行羊膜腔穿刺確定是否有染色體異常；2、并發(fā)癥多：流產(chǎn)、出血、

宮內(nèi)感染、刺破胎膜、胎兒肢體發(fā)育缺陷。

優(yōu)缺點缺點優(yōu)缺點絨毛細胞培養(yǎng)與染色體制備方法直接法（優(yōu)點：不易污染。缺點：染色體形態(tài)不佳，分裂極少而不穩(wěn)定。）干貼壁法（優(yōu)點：操作簡便。缺點：絨毛要新鮮，相對于消化法其