雜交瘤細(xì)胞的保存與復(fù)蘇技術(shù)介紹

雜交瘤細(xì)胞的保存與復(fù)蘇技術(shù)介紹篩選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備，因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長，發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時(shí)甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。接種細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)適當(dāng)，一般為5×105/鼠，可根據(jù)腹水生長情況適當(dāng)增減。選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存于液氮的細(xì)胞株活性僅有輕微的降低，而凍存在－70℃冰箱則活性改變較快。細(xì)胞不同于菌種，凍存過程中需格外小心。二甲亞砜（DMSO）是普遍應(yīng)用的凍存保護(hù)劑。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活性多在50％～95％之間。如果低于50％，則說明凍存復(fù)蘇過程有問題。當(dāng)獲得產(chǎn)生所需的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞后，必須將一部分雜交瘤細(xì)胞保存，否則在連續(xù)傳代的過程中，可能產(chǎn)生突變或染色體的漂移以至喪失固有特性或丟失產(chǎn)生抗體的特性。另外在長期的培養(yǎng)過程中，難免不發(fā)生污染以至于毀滅。所以必須冷藏保存一部分。保存方法如下：1．材料

(1)細(xì)胞：取對數(shù)生長期的細(xì)胞。

(2)10％二甲基亞砜保護(hù)液（二甲基亞砜能損壞濾器，而又被高壓所破壞，所以不能過濾或高壓消毒。其本身就是毒品，無菌）：含10％二甲基亞砜、20％滅活胎牛血清，70％RPMI—1640液。

(3)20％FCS—1640培養(yǎng)液：含青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml。

(4)滅菌的2ml安瓶等

2．操作方法

(1)去掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的舊的培養(yǎng)液，加入10％FCS—1640液，使細(xì)胞懸浮。

(3)1000r/min離心10min，去上清。細(xì)胞沉淀用10％二甲基亞砜保護(hù)液制成懸液，使成1.0×107細(xì)胞／ml。

(3)取樣，臺盼蘭染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，應(yīng)在95％以上。

(4)用注射器將細(xì)胞分裝安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。

(5)放4℃2h。

(6)放液氮罐氣態(tài)部分（-70℃）15h。

(7)轉(zhuǎn)入液氮部分。雜交瘤細(xì)胞的凍存及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊]有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時(shí)，一孔就可以裝一支安瓿凍存。細(xì)胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降至0℃后放入－70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長時(shí)間。

雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇

1．從液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。

2．無菌操作打開安瓶，取出細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入組織培養(yǎng)瓶。

3．逐滴緩慢加入20％FCS－1640培養(yǎng)液3.5ml，這個(gè)過程延續(xù)3min。

4．5％CO2飽和濕度，37℃培養(yǎng)。

5．4h后棄去培養(yǎng)液上清，加入新鮮的20％FCS－1640培養(yǎng)液。

6．繼續(xù)培養(yǎng)，換液，以至形成單層。細(xì)胞復(fù)蘇方法將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中