卷柏降糖作用的實驗研究(精)

卷柏降糖作用的實驗研究李玉潔a,鄭曉珂b，馮衛(wèi)生a(河南中醫(yī)學(xué)院a.藥學(xué)院；b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南，鄭州450008)摘要：目的：研究了不同提取方法對卷柏降糖活性的影響，并進(jìn)一步探討了卷柏降糖作用的有效部位。方法：首先，采用HepG2細(xì)胞體外細(xì)胞篩選方法，觀察卷柏醇提物和卷柏水提物兩種不同提取方法對 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖消耗量的影響，并用四甲基偶氮唑鹽(MTT)方法檢測HepG2細(xì)胞的增殖；同時結(jié)合整體動物實驗的方法，比較了醇提物和水提物對高糖高脂飼料加小劑量鏈脲佐菌素( STZ)造成的大鼠糖尿病模型的降糖活性，以及對糖尿病大鼠葡萄糖耐量的影響。進(jìn)而將卷柏醇提物上聚酰胺柱所得不同部位流份，以HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗實驗作為指標(biāo)對降糖的有效部位進(jìn)行了探討，并采用MTT法檢測受試藥物對HepG2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：體外實驗結(jié)果顯示：醇提物和水提物在一定的濃度范圍內(nèi)均能顯著促進(jìn) HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗，醇提物比水提物作用活性強(qiáng)；整體動物實驗結(jié)果顯示：卷柏醇提物和水提物均能降低糖尿病大鼠的血糖，并能在一定程度升高糖尿病大鼠的葡萄糖耐量，且卷柏醇提物降糖作用明顯優(yōu)于卷柏水提物；卷柏活性部位的的篩選結(jié)果顯示：卷柏50%EtOH部位能夠顯著促進(jìn)培養(yǎng)液中HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗，與正常組比較有極顯著性差異(P<0.01)，水部位和80%EtOH部位次之，95%EtOH部位作用不明顯。結(jié)論：細(xì)胞實驗結(jié)合動物實驗結(jié)果提示醇提物比水提物具有更好的降糖效果；卷柏醇提物上聚酰胺柱所得50%EtOH部位體外降糖活性最高。關(guān)鍵詞：卷柏；HepG2細(xì)胞；糖尿病大鼠；葡萄糖消耗；血糖AntihyperglycemicactivityofSelaginellaTamariscinaa b aLIYu-jiea，ZHENGXiao-keb，F(xiàn)ENGWei-shenga(HenanCollegeofTraditionalChineseMedicinea.SchoolofPharmacy；b.BasicMedicalCollege，zhengzhou450008)ABSTRACT:OBJECTIVE:ToinvestigatethehypoglycemiceffectsofSelaginellaTamariscinaextractedbytwomethods,andtoobservetheactivepartsofofSelaginellatamariscina.METHODS:HereweinvestigatedtheeffectsofSelaginellaTamariscinaextractedbytheEtOHandH2OonglucoseconsumptioninHepG2,andMTTassaywasusedtomonitortheproliferationoftheHepG2cells.Inaddition,thehypoglycemiceffectsoftheEtOHextractandH2Oextractinvivowereevaluatedinstreptozotocin(STZ)andahigh-fatdietinduceddiabeticrats.Serumglucoseandoralglucosetolerancetest(OGTT)wasobservedafterthetreatmentoftheannimals.Furthermore,thedifferentpartsoftotalSelaginellatamariscinaextractedbyEtOHfrompolyamidecolumnonglucoseconsumptioninHepG2wereevaluated,andMTTassaywasusedtomonitortheproliferationoftheHepG2cells.RESULTS:TheresultsinvitroindicatethatboththeEtOHandH2OextractscanincreasetheglucoseconsumptiononHepG2cellswithincertainconcentration,andtheeffectsofEtOHextractwerehigherthanH2Oextract;TheresultsinvivoindicatethatboththeEtOHandH2Oextractscanlowerthefastingbloodglucoselevelsandimproveoralglucosetoleranceondiabeticrats,andtheEtOHextracthadabetterremarkablehypoglycemiceffectsondiabeticrats.TheactivityofdifferentrefactionsweretestedagainstHepG2cells.Andtheresultsshowthatthe50%EtOHportionexhibitsastrongerhypoglycemiceffectthanthewaterportionand80%EtOHportionfrompolyamidecolumninHepG2.Thereweresigniferentdifferencescomparedwithsolventcontrolgroup(P<0.01).95%EtOHportiondidnotsigniferentlyaffecttheglucoseconsumptioninHepG2.CONCLUSION:TheresultssuggestedthattheEtOHextracthadabetterhypoglycemiceffectthantheH2OextractinHepG2cellsanddiabeticrats.The50%EtOHportionfrompolyamidecolumnhadastronghypoglycemicactivityinHepG2.KEYWORDS:SelaginellaTamariscina;HepG2cell;diabeticrats;glucoseconsumption;bloodglucose.卷柏(Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring)為多年生草本植物，為蕨類卷柏科(Selaginellaceae)卷柏屬(Selaginella)植物卷柏的全草。早在《本經(jīng)》中即有記載，注明其性辛平，功能破血散瘀，活血止血，主治腹痛、閉經(jīng)、癥瘕淋結(jié)以及吐血便血尿血等癥，將其列為上品。歷代名家對其也有論述和研究，對卷柏的功能主治記為活血通經(jīng)。2005年版中華人民共和國藥典將卷柏(Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring)和墊狀卷柏(Selaginellapulvinata(HooketGrev.)Maxim.)收載，作為臨床規(guī)范藥材使用[1]?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明卷柏具有防癌治癌、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、降血壓等作用 [2]。本實驗室前期對卷柏化學(xué)成分進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究，從中分離得到大量的黃酮類、木脂素類、核苷類和其他多酚類化合物成分[3-6]。本實驗室前期實驗在采用去卵巢大鼠模型研究卷柏降血脂作用時，意外發(fā)現(xiàn)該模型血脂升高的同時出現(xiàn)了高血糖癥狀，而卷柏組在降低血脂的同

時還有非常好的降糖作用[7]。文獻(xiàn)報道及現(xiàn)代研究表明卷柏亦具有降血糖作用：卷柏對四氧嘧啶和鏈脲佐菌素高血糖模型鼠具有顯著的降血糖作用, 并可較好地恢復(fù)其體質(zhì)[8,9]。為研究卷柏的降糖作用及其物質(zhì)基礎(chǔ),我們前期主要采用HepG2細(xì)胞體外降糖活性篩選模型,對卷柏水提物上D101大孔吸附樹脂柱,用不同濃度含水乙醇梯度洗脫,對各部位降糖作用進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,研究發(fā)現(xiàn)卷柏50%乙醇部位可能是其降糖活性部位,同時結(jié)合HPLC指紋圖譜,發(fā)現(xiàn)卷柏50%乙醇部位含有大量的卷柏黃酮。同時還發(fā)現(xiàn)卷柏乙醇提取物比卷柏水提物黃酮含量高[10]。本實驗是在前期實驗的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過體外細(xì)胞篩選結(jié)合整體動物實驗的方法,探討不同提取方法對卷柏降糖活性的影響,以期優(yōu)化提取方法,為下一步的新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。為進(jìn)一步探討卷柏降糖成分所在部位,考慮工業(yè)化大生產(chǎn)的工藝,本實驗選用聚酰胺柱,采用不同濃度含水乙醇梯度洗脫,得卷柏不同部位流份,利用HepG2細(xì)胞,建立體外降糖活性篩選模型,從細(xì)胞水平上比較卷柏醇提物不同部位降糖作用,以期篩選出卷柏降糖活性部位,為卷柏的有效部位的進(jìn)一步提取、醇化和分離提供實驗依據(jù)。1實驗材料與儀器實驗材料DMEM培養(yǎng)基、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、小牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品；MTT、DMSO為Amresco公司產(chǎn)品；葡萄糖檢測試劑盒(葡萄糖氧化酶法)為中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品；鏈脲佐菌素,為sigma公司產(chǎn)品；其他各種化學(xué)試劑均為市售分析純?；A(chǔ)飼料為鄭州大學(xué)實驗動物中心提供,高糖高脂飼料配方[11]：10%豬油、20%蔗糖、10%蛋黃、60%基礎(chǔ)飼料,由鄭州大學(xué)動物實驗中心加工制成。實驗藥物卷柏采自河南西峽,經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授、董誠明教授鑒定為卷柏屬植物卷柏(Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring)。卷柏8.98kg70%乙醇回流提取3次,過濾,合并濾液,減壓濃縮,真空干燥得卷柏醇提物823.5g(EtOHextract)；卷柏40kg加10倍量水煎煮3次，過濾，合并濾液，減壓濃縮，真空干燥得卷柏水提物6.5kg(H2Oextract),卷柏水提物提取由河南中醫(yī)研究院協(xié)助完成。取醇提物350g上聚酰胺柱,依次以水和50%、80%、95%乙醇梯度洗脫,洗脫液減壓濃縮、干燥得各洗脫部位，干重分別為100.78、66.34、86.06、33.26g。水部位、50%乙醇部位水溶解，80%、95%部位DMSO溶解，經(jīng)0.22m微孔濾膜過濾除菌， 4C保存。臨用前以DMEM培養(yǎng)基配制成各用藥濃度,終濃度DMSO含量小于0.1%。實驗儀器倒置顯微鏡(NIKONECLIPSETS100)；KDC-160HR高速低溫冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；酶標(biāo)儀(BIO-RADModel680)；超凈工作臺(江蘇蘇凈集團(tuán))；電子讀數(shù)分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品)等。細(xì)胞和動物SD大鼠80SD大鼠80只，體重實驗方法HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)HepG2實驗方法HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%滅活小牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入100ml培養(yǎng)瓶中，在

C,5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁長滿后，傾去培養(yǎng)基，用 0.25%胰蛋白酶消化，每3d22.137按1:3比例傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。2.2葡萄糖消耗實驗[12,13]將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入96孔板中,細(xì)胞貼壁后，更換無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育12h待細(xì)胞適應(yīng)無血清的環(huán)境后再將培養(yǎng)基移出，換上無小牛血清的含藥培養(yǎng)基，孵育 36h后，用葡萄糖檢測試劑盒檢測培養(yǎng)基上清的葡萄糖含

量，以不鋪細(xì)胞的空白孔為空白對照，計算 36h葡萄糖消耗量（GC），并計算各藥物葡萄糖消耗率（GCrate=各劑量組葡萄糖消耗量/正常組葡萄糖消耗量）。2.3MTT實驗[14]葡萄糖消耗實驗結(jié)束后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20訕,37C繼續(xù)培養(yǎng)4小時，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150訕DMSO，震蕩5~10分鐘，使結(jié)晶物完全溶解。以DMSO調(diào)零，用酶標(biāo)儀在490nm下測定各孔吸光度值（A）,以監(jiān)測細(xì)胞的數(shù)目與活力，通過計算 GC/MTT可以扣除由于細(xì)胞增殖對培養(yǎng)液中葡萄糖消耗的影響。10只做為正常對照組，給予基礎(chǔ)飼料4周后，大鼠禁食10只做為正常對照組，給予基礎(chǔ)飼料4周后，大鼠禁食12h,高糖高脂飼料（STZ臨用前用0.1mol/l檸檬酸-檬酸pH值至4.21，操作均在冰浴中進(jìn)行）建立糖尿病大鼠模型；正常-檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ3天后大鼠禁食12h，剪尾取血，3500檢測空腹血糖，空腹血糖大于或等于 11.1mmo1/l的動物為造模80只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按體重均衡原則隨即抽出喂養(yǎng)；其余70只，給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水。組一次性腹腔注射2%鏈脈佐菌素（STZ）溶液35-檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ3天后大鼠禁食12h，剪尾取血，3500檢測空腹血糖，空腹血糖大于或等于 11.1mmo1/l的動物為造模2.5動物分組和給藥方法將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型對照組、卷柏醇提物組、卷柏水提物組、二甲雙胍組。正常對照組與模型對照組： 每天清晨蒸餾水灌胃； 二甲雙胍組：每天清晨以200mg/kg二甲雙胍灌胃；卷柏醇提物和卷柏水提物均按臨床用藥的 20倍換算，卷柏醇提物組：每天清晨 210mg/kg卷柏醇提物灌胃，卷柏水提物組：每天清晨 312mg/kg卷柏水提物灌胃，連續(xù)灌胃 3周，灌胃體積均不大于4ml，所有大鼠喂養(yǎng)期間均自由進(jìn)食飲水。大鼠給藥前和給藥 3周禁食12h，末次給藥后2小時，尾靜脈取血，用葡萄糖檢測試劑盒測定血糖值。兩天后進(jìn)行口服葡萄糖耐量實驗[17]:于檢測前大鼠灌胃后禁食，12h后，給各組大鼠灌胃葡萄糖溶液 2g/kg,分別測定，0min、30min,60min,120min的血糖，0min血糖即空腹血糖。2.6統(tǒng)計方法測定的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以 X±5表示，組間差異的顯著性采用單項方差分析（One-WayANOVA）處理，給藥前后血糖比較采用雙因素 t檢驗。3結(jié)果3.1卷柏醇提物及卷柏水提物對 HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響卷柏醇提物在0.7~1.5mg/ml劑量時，均能明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗，與正常對照組比有顯著性差異（P<0.01，P<0.05），與二甲雙胍組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義（ P>0.05）;卷柏水提物在0.9~1.5mg/ml劑量時對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗有明顯的促進(jìn)作用， 與正常對照組比有顯著性差異（P<0.05）（見表1），與二甲雙胍組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義（ P>0.05）。扣除由于細(xì)胞增殖對培養(yǎng)液中葡萄糖消耗的影響，用 MTT校正后，卷柏醇提物在0.6、0.7、2.0mg/ml時均可增加培養(yǎng)液中HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗， 與正常對照組比有極顯著性差異 （P<0.01），在0.7mg/ml時與二甲雙胍組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義（ P>0.05）；卷柏水提物對HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗沒有明顯的促進(jìn)作用，與正常對照組比沒有統(tǒng)計學(xué)意義（ P>0.05），與二甲雙胍組相比均有顯著性差異（P<0.01，P<0.05）（見表2）。Tab1EffectsoftheextractsfromSelaginellaTamariscinaonglucoseconsumptioninHepG2cell.（X Dose(mg/ml)EtOH-extractGC(mmol/l)EtOH-extractGCrateH2O-extractGC(mmol/l)H2O-extractGCrateNormal5.3571±).43394)11.8693±).59184)1controlmetformin8.2057±).56872)1.533.9976±).40302)2.14hydrochloride

-4 (104mol/L)0.14.9903±0.19514)0.931.6104±0.79314)0.860.26.3228+1.14411.181.5753±0.85294)0.840.35.4057±0.75154)1.011.0763±0.76984)0.580.46.0531±0.37244)1.131.5052±0.70844)0.800.55.7132+0.90901.071.9503±0.66834)1.040.66.3768+0.65681.191.7965±0.56974)0.960.77.2588+).3347)1.351.8855±0.94094)1.010.86.8785+12576)1.282.0393±0.67024)1.090.97.6877±1.79221)1.432.3468±0.44151)1.721.07.7120±).34602)1.443.2208±1.08431)1.671.57.7363±0.44972)1.443.1317±0.83341)1.592.06.1016±0.48554)1.142.9780±1.09234)1.03與 〔丿表示PV0.05,2）表示P<0.01;與二甲雙胍組比較,1Tab2EffectsoftheextractsfromSelaginellaTamariscinaonHepG2cellproliferationactivity.(X±0DoseEtOH-extractEtOH-extractH2O-extractH2O-extract(mg/ml)MTTGC/MTTMTTGC/MTTNormal0.81275+0.01692.300013+0.364control0.5593+0.01149.5777+0.38794)280694)metforminhydrochloride(10'4mol/L)0.5783+0.050114.1885±).49172)0.7788+0.05375.1334+0.2580)0.10.56+0.09248.9112+0.20124)0.695+0.0222.4798+0.7752)0.20.5613+0.014611.2639+1.176L0.6353+0.07851.5475±0.55344)0.30.495+0.028310.9206+D.75914)0.6955+0.00992.1464+0.50514)0.40.5393+).054211.2232+D.34524)0.7013+0.00742.7527+0.4716)0.50.554+0.067210.3126+0.82044)0.7085+0.01272.9892+0.4739)0.60.5207+).045112.2473+0.63O72)0.601+0.06942.4842+0.6190)0.70.5663+).014312.8172±).29552)0.759+0.06572.2226+0.36500.80.7187+).03949.5712+0.17924)0.9175+0.01112.7472±0.25844)0.90.7967±^.02021)9.64988+1.12484)0.8543+0.01823.5697+0.6000)1.00.7517+).039410.2598+0.23014)0.9023+0.02263.0840+0.410單1.50.7797+).03159.9225+0.28834)1.0155+0.0204)3.2662+0.599J)2.00.5123+).01630.9118+0.02002.4436+0.1600)3.2卷柏醇提物及卷柏水提物對糖尿病大鼠模型血糖的影響注射STZ72小時后，糖尿病模型組大鼠血糖明顯升高，與正常組比有極顯著性差異（P<0.01），其高血糖水平可維持3周以上。二甲雙胍灌胃 3周后，空腹血糖明顯降低，與模型組比有極顯著性差異（P<0.01），與治療前比有極顯著性差異（ P<0.01），與正常組比無差異（P>0.05）。卷柏醇提物和卷柏水提物給藥 3周后，均在不同程度上改善了糖尿病大鼠的高血糖癥狀，同模型組比有極顯著性差異（ P<0.01），與治療前比有極顯著性差異（P<0.01）,但其空腹血糖仍明顯高于正常組（P<0.05或0.01）；且與卷柏水提物相比，卷柏醇提物降糖效果明顯優(yōu)于卷柏水提物（P<0.05）（見表3）。與正常對照組比較，1）表示Pv0.05,2）表示P<0.01;與二甲雙胍組比較，3）表示PV0.05;4）表示P<0.01Tab3Effectsof3-weektreatmentwiththeextractsofSelaginellaTamariscinaonglucoselevelsindiabeticrats(n=10).(xis)GroupBloodglucose(mmol/l)0days21daysNormalcontrol6.020.925.90.844)Diabeticcontrol16.88±492)22.66土.272)6)metforminhydrochloride16.86±40，8.583.31))EtOH-extract17.29±302)10.003.431)4)6)H2O-extract16.65±592)13.392.872)6)7)注：與同一時間點(diǎn)正常組比較: ［丿表示PV0.05,2）表示PV0.01;與同一時間點(diǎn)模型組比較: 3）表示Pv0.05,4）表示PV0.01;與治療前（注射STZ后72小時）比較：5）表示P<0.05,6）表示P<0.01;卷柏水提物與卷柏醇提物比較7）表示P<0.05,8）表示P<0.01。3.3卷柏醇提物與卷柏水提物對糖尿病模型大鼠葡萄糖耐量的影響表4結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠灌糖水后血糖升高， 60min時達(dá)最大值，然后隨時間血糖呈下降趨勢，各時間點(diǎn)血糖與正常組比均有極顯著性差異 （P<0.01），灌糖水后120min血糖比0min血糖升高約32.9%;二甲雙胍組大鼠灌糖水后各時間點(diǎn)血糖比模型組明顯降低 （P<0.01）,120min血糖基本恢復(fù)空腹血糖水平；卷柏醇提物組大鼠灌糖水后 0~60min時血糖變化不明顯，與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但120min時，血糖明顯下降，與模型組相比差異極顯著 （P<0.01）.卷柏水提物組0~30min時，血糖下降，與模型組相比差異顯著（ P<0.05），但60,120min時，血糖變化不明顯，與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（ P>0.05）。卷柏醇提物和水提物對糖尿病大鼠葡萄糖耐量的影響均不及二甲雙胍組，與其相比均有極顯著性差異（ P<0.01）。Tab4EffectsoftheextractsfromSelaginellaTamariscinaonglucosetoleraneeindiabeticrats（n=10）.（xis） （mmol/l）Group0min30min60min120minNormalcontrol6.531曲6）6.940.284)6)8.770.774)6)7.15:0.394)6)Diabeticcontrol20.00±612)24.53±462)6)32.06±.722)6)25.882.762)6)metforminhydrochloride18.670;692)20.492;782)4)26.714.242)4)17.925.712)4)EtOH-extract18.49±152)22.64±172)6)31.49土.112)6)21.882.382)4)6)H2O-extract18.0021.99曲)3)6)31.652.532)6)26.782.212)6)注：與同一時間點(diǎn)正常組比較：1）表示P<0.05,2）表示PV0.01;與同一時間點(diǎn)模型組比較：3）表示PV0.05,4）表示Pv0.01;與同一時間點(diǎn)二甲雙胍組比較 5）表示Pv0.05,6）表示PV0.01。3.4卷柏醇提物上聚酰胺柱所得各部位對 HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響體內(nèi)實驗和體外實驗提示：卷柏醇提物具有很好的降糖活性，為進(jìn)一步探討卷柏降糖成分所在部位，本實驗選用聚酰胺柱，采用不同濃度含水乙醇梯度洗脫，分別得到水、 50%EtOH、80%EtOH、95%EtOH部位，并以HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗實驗作為指標(biāo)對降糖的有效部位進(jìn)行了篩選。表5結(jié)果顯示：卷柏水部位在 0.4、0.6、0.9、1.0mg/ml劑量時不同程度促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖的消耗，與正常對照組相比有極顯著差異（ P<0.01），0.4mg/ml劑量時作用最強(qiáng)。但各劑量作用均不及二甲雙胍組，與其相比均有極顯著性差異（ P<0.01）;50%乙醇部位在0.05~0.7mg/ml濃度范圍內(nèi)不同程度促進(jìn) HepG2細(xì)胞葡萄糖的消耗，并呈一定的劑量依賴性，與正常對照組相比有顯著差異（ P<0.05，P<0.01），在0.4mg/ml劑量時作用最強(qiáng)。在0.3、0.4、0.5、0.7mg/ml齊U量時，與二甲雙胍作用相當(dāng)，與其相比沒有顯著性差異（P>0.05）;80%乙醇部位在0.1~1.0mg/ml濃度范圍內(nèi)不同程度促進(jìn) HepG2細(xì)胞葡萄糖的消耗，與正

常對照組比有極顯著差異(P<0.05,P<0.01)，并呈一定的劑量依賴性，在1.0mg/ml劑量時作用最強(qiáng)。在0.4~1.0mg/ml濃度范圍內(nèi)與二甲雙胍作用相當(dāng)，與其相比沒有顯著性差異(P>0.05);95%乙醇部位作用不明顯，僅在 0.6mg/ml劑量時有作用，與正常對照組相比有顯著差異(P<0.05)。與二甲雙胍組相比，各劑量組均有極顯著性差異( P<0.01)。Tab5EffectsofthedifferentpartsofEtOH-extractfrompolyamidecolumnonglucoseconsumptioninHepG2(xis)Dose(mg/ml)WaterportionGC(mmol/l)waterportionGCrate50%-EtOHGC(mmol/l)50%-EtOHGCrate80%-EtOHGC(mmol/l)80%-EtOHGCrate95%-EtOHGC(mmol/l)95%-EtOHGCrateNormal3.90330.76012.64000;9414.7400±1d3.18750;79dcontrol54)864)406)1854)1metforminhydrochloride8.2625±0472.126.64250;898.44750;66.31000;55(10-4mol/l)22)732)2.524402)1.78522)1.980.0012.20750;93-----104)0.84-0.012.4900±30--984)0.94-0.053.80500;49--241)4)1.44■■■-0.14.16670.2825.27500;217.13000;83.75000;4794)1.07382)3)2.001552)3)1.50514)1.180.24.00750.4015.37500;096.1075±13.79670;5794)1.03402)3)2.041)4)5421)1.29734)1.190.34.92750.9567.26250;556.69250;82.81000;2954)1.26782)2.750572)4)1.41054)0.880.46.48000.3977.47000;398.0600 0;83.01750;6822)4)1.66252)2.83216)1.70504)0.950.55.04670.8076.23000;587.70250;33.73330;2204)1.29132)2.36853)1.6355)1.170.65.82750.6105.25250;697.80750;54.3225±0722)4)1.49082)3)1.995542)1.65701)4)1.360.74.80750.5216.0275±178.86750;53.04000;5244)1.23622)2.281382)1.87224)0.950.84.87250.4629.34750;42.69670;4694)1.25--3902)1.97314)0.850.95.46250.9218.94250;62.98000;4732)4)1.40--8312)1.89124)0.931.05.34750.5899.46000;73.14000;6332)4)1.37--1592)2.00424)0.99與正常對照組比較，1)表示Pv0.05,2)表示P<0.01;與二甲雙胍組比較，3)表示PV0.05;4)表示P<0.01表6結(jié)果顯示：卷柏50%乙醇、80%乙醇和 95%乙醇部位分別在 0.05~0.5mg/ml、0.3~1.0mg/ml、0.8~1.0mg/ml濃度范圍內(nèi)對HepG2細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。另外卷柏水和 50%乙醇部位分別在 0.6~1.0mg/ml和0.6~0.7mg/ml濃度范圍內(nèi)對 HepG2細(xì)胞的增殖有抑制作用，與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。Tab6EffectsofthedifferentpartsofEtOH-extractfrompolyamidecolumnonHepG2cellproliferationactivity(xis)

Dose(mg/ml)waterportionMTT50%-EtOHMTT80%-EtOHMTT95%-EtOHMTTNormalcontrol0.5475±).02750.5250±).05920.6425±).02870.5200+0.0455metforminhydrochloride(10-4mol/L)0.5500±).03560.5425±).03100.5950±).02380.4800±).02160.0010.5775±).02631)0.01-0.5725±).0359--0.05-0.6225^0.055$)4)--0.10.6075±).04271)3)O.6625±).O25C2)4)0.6050±).05320.5100±)0.20.6350±).1109O.6125±O.O2872)4)O.6675±).O45C3)0.5250+0.01290.30.5850±).0592O.61OO±).O2832)3)0.7100±).04551)4)0.5100±).03370.40.6150±).0520O.6225±).O1712)4)O.7525±).O4272)4)0.4825±).01710.5O.5767±).O2523)O.65OO±).O356')4O.665O±).O42C3)0.5150±).03420.6O.4425±).O4862)4)0.4575±).0290)4)O.6725±).O2753)0.5350+0.03000.7O.385O±).O4O42)4)O.425O±).O289')4)O.74OO±).O2452)4)0.5250+0.07330.8O.3O75±).O2222)4)-O.7275±).O4792)4)0.5950±).02381)4)0.9O.275O±).O4O42)4)-0.7100±).00821)4)0.6500+0.095住4)1.0O.3O5O±).O42O2)4)-0.7050±).07331)4)0.6625±).071卑4)表7結(jié)果顯示：扣除由于細(xì)胞增殖對培養(yǎng)液中匍萄糖消耗的影響，用 MTT校正后。卷柏水、50%乙醇、80%乙醇部位分別在0.4~1.0mg/ml、0.05~0.7mg/ml、0.1~1.0mg/ml濃度范圍內(nèi)不同程度地促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖的消耗，并呈一定的劑量依賴性，與正常對照組相比有顯著差異（P<0.05，P<0.01）。卷柏水、50%乙醇、80%乙醇部位分別在0.6、0.8mg/ml劑量，0.3、0.4、0.7mg/ml劑量，0.8~1.0mg/ml劑量時與二甲雙胍組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義（ P>0.05）,另外卷柏水、50%乙醇部位分別在0.7、0.9、1.0mg/ml劑量，0.7mg/ml劑量時葡萄糖消耗量高于二甲雙胍組，與二甲雙胍組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。95%乙醇部位僅在0.6mg/ml劑量時有作用，與正常對照組相比有顯著差異（ P<0.05），各劑量組作用均不及二甲雙胍組，與二甲雙胍組相比均有極顯著差異（ P<0.01）。Tab7EffectsofthedifferentpartsofEtOH-extractfrompolyamidecolumnonglucoseconsumptioninHepG2aftercorrectedbyMTT（X±）與正常對照組比較,卩表示PvO.O5,2）表示P<0.01;與二甲雙胍組比較,3）表示P<0.05;4）表示P<0.01Dose(mg/ml)waterportionGC/MTT50%-EtOHGC/MTT80%-EtOHGC/MTT95%-EtOHGC/MTTNormalcontrol7.O733±1.46844)4.9563±1.48764)7.3586±.61OO4)6.O725±1.O2564)metforminhydrochloride(10-4mol/L)15.O225±1.64242)12.2115±1.17382)14.189O±).71862)13.1575±1.21112)0.001-4.5576±).49354)--0.014.2720±1.89884)0.05-6.1387±0.88614)--0.16.8467±1.00133)4)7.9741±).51172)4)11.8643+1.71911)7.3529±0.93154)0.26.4675±1.33674)8.7888±).41352)4)9.1007±1.09311)7.2559±1.10484)0.38.4325±1.40634)11.9068±).72612)9.4247±).94712)5.4719±0.32894)0.410.5800±0.932矽4)11.9953±).37262)10.7186±1.02532)6.2295±1.25484)0.58.7267±1.12884)9.5878±).75962)4)11.6033±).65552)7.4866±0.74934)0.68.1378±2.32471)13.1825±).38052)11.5313±1.87692)11.6127±).74202)4)0.712.5600±1.47872)3)14.1361±2.34682)3)11.9902±).74462)5.7998±0.73064)0.815.9725i2.51272)-12.8810±).88212)4.6214±0.78314)0.919.8600±1.94172)4)-12.6034±.08962)4.7063±1.31554)1.017.6500±1.735矽3)12.7603±.75232)4.7679±0.97354)與正常對照組比較, 1）表示PV0.05,2）表示PV0.01;與二甲雙胍組比較,3）表示P<0.05;4）表示P<0.014討論HepG2細(xì)胞是一種與人肝細(xì)胞表型極為相似的肝胚胎瘤細(xì)胞株 [18]，它能夠表達(dá)胰島素受體和胰島素樣生長因子的代謝反應(yīng)[19]，另外，HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗模型利用多靶點(diǎn)和胞內(nèi)多條信號通路的同時激活，能全面模擬肝細(xì)胞對周圍環(huán)境中葡萄糖的攝入和消耗，肝臟是體內(nèi)物質(zhì)代謝的中心，在糖代謝中自然也起著樞紐作用。因此，我們采用 HepG2細(xì)胞探討不同提取方法對卷柏降糖活性的影響，以期篩選出卷柏降糖作用最佳的提取工藝。MTT法是檢測細(xì)胞數(shù)及活力的綜合性指標(biāo)， MTT數(shù)值的高低主要代表細(xì)胞數(shù)的多寡，因此可以通過MTT法觀察細(xì)胞增殖的情況，計算 GC/MTT的比值可扣除細(xì)胞增殖的作用對培養(yǎng)液中葡萄糖消耗的影響，實驗結(jié)果顯示：在高糖環(huán)境中，卷柏醇提物和水提物均可明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖的消耗，用 MTT校正后，卷柏醇提物在0.7~2.0mg/ml濃度范圍內(nèi)能明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖的消耗；卷柏水提物對培養(yǎng)液中肝細(xì)胞的葡萄糖消耗量無明顯影響， 這一結(jié)果提示卷柏醇提物可能比卷柏水提物具有更好的降糖活性。為進(jìn)一步探討卷柏不同溶劑提取物對整體動物血糖的影響，本實驗室又采用高糖高脂飼料加小劑量鏈脲佐菌素復(fù)制的糖尿病動物模型，通過體外實驗結(jié)合體內(nèi)實驗，來探討卷柏降糖作用。用此種方法制造的糖尿病動物模型與人類 2型糖尿病發(fā)病機(jī)理相似，常用于糖尿病的研究及治療糖尿病藥物的篩選。實驗結(jié)果顯示糖尿病模型組大鼠注射 STZ72小時后血糖明顯升高，與正常對照組相比有極顯著性差異，達(dá)到糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)，且高血糖狀態(tài)可維持 3周以上。卷柏醇提物與卷柏水提物給藥3周分別將血糖降低55.9%和40.9%。此結(jié)果提示卷柏卷柏醇提物和卷柏水提物均具有很好的降糖效果，并且卷柏醇提物可能比卷柏水提物具有更好降糖效果，這一實驗結(jié)果與體外篩選的結(jié)果一致。葡萄糖耐量實驗是檢測機(jī)體血糖調(diào)節(jié)的一種方法，用以了解人體對進(jìn)食葡萄糖后的血糖調(diào)節(jié)能力，正常人給予一定量葡萄糖后，血糖濃度暫時升高，機(jī)體刺激胰島素分泌，促使合成糖原，儲存能量，在兩個小時內(nèi)，血糖將會降至空腹水平。葡萄糖耐量實驗結(jié)果顯示：卷柏醇提[19][19]物與卷柏水提物對糖尿病大鼠服糖后血糖降低的作用時間不同，可能與實驗誤差及大鼠的個體差異有關(guān)，另一方面，卷柏不同提取物對灌糖水后各時間點(diǎn)降糖作用均不及二甲雙胍，可能與中藥起效慢，作用緩和有關(guān)，還需我們進(jìn)一步的驗證和探討。體內(nèi)實驗和體外實驗提示：卷柏醇提物具有很好的降糖活性，因此我們進(jìn)一步對其進(jìn)行活性追蹤，結(jié)果顯示50%乙醇部位的降糖活性最佳。數(shù)據(jù)顯示水部位在顯增加HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗，作用甚至優(yōu)于二甲雙胍，但其在HepG2細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，因此導(dǎo)致GC/MTT值升高，細(xì)胞毒作用。50%乙醇部位在0.1~0.5mg/ml濃度范圍能明顯增加一濃度范圍對HepG2細(xì)胞增殖沒有明顯的抑制作用，甚至有促進(jìn)增殖的作用，乙醇部位降糖作用最明顯，其明確的作用成分還需進(jìn)一步的追蹤、分離和鑒定。0.7、0.9、1.0劑量時能明0.6~1.0mg/ml濃度范圍對這說明其在高濃度下有一定的HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗，在這這一結(jié)果提示50%REFERENCES[1][2][3][4][5][6][7][8][9][10][11][12][13][14][15][16][17][18]Ch.P(2005)VolI(中國藥典2005年版.一部)[S].2005:157.ChenK,PlumbaGWf,BennettaRN,BaoY.Antioxidantactivitiesofextractsfromfiveanti-viralmedicinalplants[J].JEthnopharmacol2005,96:201-205ZHENGXK,SHISP,BIYF,etal.TheisolationandidentificationofanewllignanosidefromSelaginellatamariscina(Beauv.)Spring[J].ActaPharmSin(藥學(xué)學(xué)報),2004,39(9):719-721ZHENGXK,BIYF,FENGWS,etal.StudyonthechemicalconstituentsofSelaginellatamariscina(Beauv.)Spring[J].ActaPharmSin(藥學(xué)學(xué)報),2004,39(4):266-268ZHENGXK,LiJ,FENGWS,etal.StudiesontheFlavonesandFlavonoidsfromSelaginellatamariscina(Beauv.)Spring[J].ChinTraditandHerbalDrugs(中草藥),2004,35(7):742-743BIYF,ZHENGXK,FENGWS,IsolationandstructuralidentificationofchemicalconstituentsfromSelaginellatamariscina(Beauv.)Spring[J].ActaPharmSin(藥學(xué)學(xué)報),2004,39(1):41-45.LvPF.ExperimentstudyofestrogenicactivitiesofChineseherbalmedicineandtheresearchofchemicalconstituentfromBeoahygrometrica(Bge.)R.Br[D].Henan:Univ.ofTCM,2006.(河南中醫(yī)學(xué)院碩士畢業(yè)論文)，YULP,ZHANGX,WANGYZ.EffectofSelaginellaLamariscineSpringonFFRInsulinSensitivity[J].ChinTraditPatMed(中成藥),2001,23(4):291-292MiaoN,TaoH,TongC,XuanH,ZhamgG.TheSelaginellatamariscina(Beauv.)Sp