HBVDNA檢測在乙肝治療中的應(yīng)用

為什么進行HBVDNA檢測HBVDNA檢測帶給我們的益處目前HBVDNA的檢測方法羅氏COBASAmplicor系統(tǒng)的優(yōu)點新一代技術(shù)COBASTaqMan主要內(nèi)容乙型肝炎：全球性的健康問題目前HBV攜帶者超過350million25–40%HBsAg陽性人群會死于肝硬化或肝癌全球350millionHBV攜帶者,75%在亞洲

中表面抗原（S+preS2）核蛋白殼HBcAg(HBeAg)DNA聚合酶膜蛋白基因組DNA小表面抗原HBsAg(S)RNA引物大表面抗原（S+preS2+preS1)乙肝病毒顆粒示意圖慢性乙肝檢測指標HBsAg–確定慢性乙肝HBeAg/anti-HBe–區(qū)分感染的不同時期HBV聚合酶–檢測病毒的酶活性HBVDNA–檢測病毒載量(病毒轉(zhuǎn)錄活性)HBcAg–檢測病毒蛋白(病毒翻譯活性)HBV病毒基因慢性乙型肝炎暴露后時間滴度ALTAnti-HBcSymptoms

5

601234

6

71

2

345

8

9

10HBsAgHBeAg月年HBVDNAAnti-HBe慢性乙肝的三種臨床表現(xiàn)HBeAg陽性慢性乙肝

HBeAg,ALT升高,HBV-DNA107to1011

拷貝每毫升，病理切片指征明顯HBeAg陰性慢性乙肝

Anti-HBe,ALT升高，HBV-DNA104to108拷貝每毫升,病理切片指征明顯HBsAg陰性攜帶期

Anti-HBe,ALT正常,HBV-DNA<101to104拷貝每毫升,病理切片變化極小EASL（歐洲肝病學(xué)會）將顯著的復(fù)制水平定為HBV-DNA105

拷貝每毫升

HBV保持復(fù)制活性（HBVDNA≥105copies/mL）,轉(zhuǎn)氨酶3－6月內(nèi)

持續(xù)升高，建議進行治療對于e抗原陽性的慢性乙肝患者而言，采用干擾素治療結(jié)束后，應(yīng)該

檢測e抗原、e抗體和HBVDNA水平，并且每6個月評估病毒學(xué)反應(yīng)對于e抗原陰性的慢性乙肝患者而言，在經(jīng)過抗病毒治療后，檢測血

清HBVDNA水平是評估病毒學(xué)反應(yīng)的唯一方式歐洲肝病學(xué)會（EASL）2003乙肝防治指南HBV-DNA血清陽性病人，如果ALT>2ULN,要考慮治療治療期間，ALT、e抗原和HBV-DNA至少每3個月檢測一次

亞太乙肝防治共識2003JournalofGastroenterologyandHepatology(2003)18,239–245抗病毒一般適應(yīng)癥主要指標：HBVDNA≥105

拷貝/mL病毒學(xué)應(yīng)答重要指標包括血清HBV，DNA檢測不到(PCR法)

或低于檢測下限，或較基線下降≥2log10

中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會/中華醫(yī)學(xué)會感染病分會－慢性乙肝防治指南為什么進行HBVDNA檢測HBVDNA檢測帶給我們的益處目前HBVDNA的檢測方法羅氏COBASAmplicor系統(tǒng)的優(yōu)勢新一代技術(shù)COBASTaqMan主要內(nèi)容HBVDNA檢測帶給我們的益處監(jiān)測抗病毒治療效果早期確定病毒學(xué)應(yīng)答預(yù)測治療后反應(yīng)(HBsAg消失)預(yù)測耐藥突變預(yù)測肝移植后復(fù)發(fā)檢測HBsAg攜帶者的病毒的活動情況指標正常/HBeAg陽性(n.31)anti-HBe陽性(n.15)轉(zhuǎn)陰ALT

12

7HBeAg

12

NDdot-blothybridization.

12

7IgManti-HBc

ND

5AmplicorHBVMonitor

5

2HBsAg

3

2經(jīng)治療生化指標正常病人中病毒清除率治療中/后，應(yīng)答者與不應(yīng)答者HBVDNA水平的比較baseline1-3wks4-7wks8-11wks12-15wks16-24wks0-5mths6-11mths12-18mths1x1021x1041x1061x1081x1010HBVDNA

levelscopies/mlmean±SEMp=0.07p=0.2p<0.01p<0.001p<0.001p<0.001p<0.001p<0.001p<0.001-不應(yīng)答者--應(yīng)答者-治療中治療后監(jiān)測抗病毒治療，預(yù)測耐藥Puchhammer-StocklE.atal.JInfectDis181:2063,2000HBVDNA載量顯示攜帶者處于活動或非活動狀態(tài)HBVDNAcopies/mlManesisK.etal.Gastroenterology122(7):2092-3,2002.1.E+021.E+031.E+041.E+051.E+061.E+071.E+081.E+09非活動狀態(tài)活動狀態(tài)HBVDNA載量在肝移植中的應(yīng)用

在肝移植中(LiverTransplantation)

為防治肝移植后的復(fù)發(fā)所采取的預(yù)防性治療需要達到HBVDNA<104copies/mL的指標為什么進行HBVDNA檢測HBVDNA檢測帶給我們的益處目前HBVDNA的檢測方法羅氏COBASAmplicor系統(tǒng)的優(yōu)勢新一代技術(shù)COBASTaqMan主要內(nèi)容目前HBVDNA的檢測方法羅氏COBASAmplicorHBVMonitorDigeneHybridCapture雜交捕捉AbbottGenostix已消失BayerbDNA3.0國產(chǎn)HBVDNA檢測試劑及方案羅氏COBASTaqManHBVmonitor靈敏度比較TechnologyLODcopies/mLRocheAMPLICOR300DigeneHybridCapture~140,000AbbottGenostix~500,000BayerbDNA3.0~2,000RocheCobasTaqman~35國產(chǎn)試劑？BranchedDNA(bDNA)靶探針*Preamplifier*Microwell靶DNA捕獲探針微孔板捕獲探針Amplifier*withhybridizedLabelProbes**componentscontainingIso-C/Iso-G信號擴增BranchedDNA(bDNA)國內(nèi)Realtime方法HBV的檢測現(xiàn)狀

PCR反應(yīng)Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNAPolymeraseAmpErase?TargetDNAPCR模板擴增1cycle=22cycle=43cycle=84cycle=165cycle=326cycle=647cycle=128SinglestrandRNA水解探針

(TaqMan)模式淬滅基團報告熒光激發(fā)熒光淬滅激發(fā)熒光檢測到信號實時熒光定量模式0510152025300102030405060相對熒光強度None1ThresholdCycleThreshold(Ct)for108C/PCRHBVDNALogC/PCR2876543循環(huán)數(shù)需要關(guān)注的國內(nèi)實時熒光PCR檢測的問題儀器90％源于進口，ABI、ROCHE、Bio-Rad…試劑100％國產(chǎn)，匹基、達安、科華、復(fù)星…需要關(guān)注的國內(nèi)實時熒光PCR檢測的問題目前國內(nèi)使用的進口RealtimePCR儀全部是針對科研用途研發(fā)的，缺乏臨床診斷所需的質(zhì)控系統(tǒng)所有進口PCR儀均為開放系統(tǒng)，除Roche外均不提供臨檢用試劑儀器廠家僅負責(zé)儀器運行是否正常，不對檢測結(jié)果做任何保障均采用外部標準曲線定量，標準品為重組質(zhì)粒，與臨床標本有無差異－－？質(zhì)控品及標準品有無朔源性－－？試劑是否標明“域值”或“CrossBand”取值范圍－？陽性質(zhì)控是否給出標準值范圍－－？標準品濃度是否覆蓋聲明的檢測靈敏度－－？是否提供內(nèi)部質(zhì)控品－－？純化產(chǎn)率如何控制－－？需要關(guān)注的國內(nèi)實時熒光PCR檢測的問題檢測結(jié)果標準化的問題標準化的各要素校準品試劑分析儀為什么進行HBVDNA檢測HBVDNA檢測帶給我們的益處目前HBVDNA的檢測方法羅氏COBASAmplicor系統(tǒng)的優(yōu)點新一代技術(shù)COBASTaqMan主要內(nèi)容COBASAmplicor檢測原理雜交(37C)PCR擴增變性雜交清洗加AV-HRP加TMB內(nèi)部標準品(QS)全程監(jiān)控樣本制備/PCR過程

兼作定量參照BBBB

內(nèi)部標準品DNA

模板DNA模板DNA內(nèi)部標準品DNACOBASAmplicor：與固定在磁珠上的探針雜交內(nèi)對照防止假陰結(jié)果，精確定量PCRCOBASAMPLICORHBVMonitor特點檢測下線300copies/mL,>95%檢出率線性范圍300-200,000copies/mL同等定量亞型A-F血清或血漿100ul樣本6小時檢測時間,30分鐘手工準備內(nèi)部定量標準防污染系統(tǒng)COBASAmplicorVSbDNACOBASAmplicorvsbDNACOBASAmplicorvsbDNACobasAmplicorbDNA標本準備乙醇沉淀磁珠吸附擴增靶序列光信號線性范圍300－200,0002000-100,000,000特異性100%99.2%（96-98%)亞型A－FA－F污染控制有無定量方案內(nèi)部標準品外部標準曲線Control數(shù)量3個12個報告時間8小時24小時COBASAmplicorHBV靈敏度vs其它測試?-預(yù)測反跳？-預(yù)測突變？-預(yù)測肝移植復(fù)發(fā)風(fēng)險？其他測試的靈敏度COBASAmplicorHBV靈敏度1101001,00010,000100,0001,000,00010,000,000100,000,000048122024WeeksoftherapyHBVDNAcopies/mL為什么進行HBVDNA檢測HBVDNA檢測帶給我們的益處目前HBVDNA的檢測方法羅氏COBASAmplicor系統(tǒng)的優(yōu)勢新一代技術(shù)COBASTaqMan主要內(nèi)容COBASTaqMan實時熒光檢測系統(tǒng)COBASTaqMan特點及益處動態(tài)PCR整合定量標準，不需外標準曲線檢測管封閉，無需開蓋四色熒光通道(計劃升級到六色) 檢測管:k-tubeork-plate寬廣的動力學(xué)范圍連續(xù)檢測檢測時間從6小時減少到2～3小時 增加通量提供內(nèi)質(zhì)控減少污染風(fēng)險允許多重PCR靶標檢測可用于其他檢測模式(雜交探針)處理過程簡單可與Ampli