HRM高分辨率熔解曲線分析技術(shù)百替生物

HRM(HighResolutionMelting):

于2003年發(fā)明，是一項近年來備受關(guān)注的創(chuàng)新的技術(shù)，實現(xiàn)了通過研究PCR產(chǎn)物依賴于序列的熔解溫度而對PCR產(chǎn)物進行鑒定。可用于檢測樣品中存在的雙鏈DNA的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）基因變異（Mutation）、多態(tài)性（Polymorphisms）和表觀遺傳學(xué)（Epigenetic）差異。RealTimePCRHRMTM值：當(dāng)前溫度下50%的雙鏈解鏈為單鏈HRM與RealTimePCR的異同點：需要加入熒光染料檢測獲取熒光信號采用的染料類型不同（Sybr和LC）熒光信號檢測時機不同分辨率不同數(shù)據(jù)處理方式不同飽和染料有效避免了檢測熒光信號中的假陽性新的飽和染料降低了傳統(tǒng)染料對PCR反應(yīng)的抑制作用LCGREEN高分辨率：DNA的熔解曲線取決于DNA堿基序列。理論上任何一個堿基的改變，都會造成TM值的差異，但是單個堿基改變造成的差異是極小的，通常只有零點幾度。因此要精確檢測TM值的差異，就至少需要保證每0.1℃獲取一次熒光信號。LightScannerHRM原理示意圖HRM的技術(shù)優(yōu)勢：1.整體操作方法簡單，檢測靈敏度高，可檢測出單個堿基的改

變，檢測效率高，5-10分鐘即可完成對96/384孔板的檢測。2.從PCR到檢測熒光信號，整個過程在同一個管中進行，最大

程度的避免了污染。3.無需事先知道突變位點，無需設(shè)計探針，大大簡化實驗設(shè)計

時間和研究成本。HRM在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用：1)疾病相關(guān)基因（癌基因）特定區(qū)段突變位點的掃描，新突

變的發(fā)現(xiàn)

2)HRM在序列配對中的應(yīng)用。

3)HRM在基因分型中的應(yīng)用。

4)HRM在甲基化分析中的應(yīng)用。

在胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）中新發(fā)現(xiàn)的7個c-kit激活型(c-kit-activating)突變基因位于第11號外顯子中，為從基因水平診斷GIST提供了新的方法。(Willmoreetal.,2004)AnatomicPathology在非小細胞性肺癌（NSCLC）患者中發(fā)現(xiàn)第19號外顯子中存在有(L747-P753insS)突變，為以后針對性的分子診斷以及設(shè)計藥物有潛在意義。(Smithetal.,2008)ClinicalPathologyHRM在突變掃描中的應(yīng)用舉例HRM在序列配對中的應(yīng)用舉例HumanLeucocyteAntigen(HLA)人類白細胞抗原：

位于第六號染色體的短臂6P21.31區(qū)，長3600KB，根據(jù)功能和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的不同分成3組：經(jīng)典HLA基因、免疫功能相關(guān)基因和免疫無關(guān)基因。其中經(jīng)典HLA基因與輸血和移植急性排斥反應(yīng)密切關(guān)聯(lián)。在器官移植中，通過檢測樣本的HLA，以便了解樣本組織與宿主是否相容。利用HRM技術(shù)，直接觀察溶解曲線，可以迅速的找到最匹配的器官組織，為挽救患者的生命爭取寶貴的時間。HRM在基因分型中的應(yīng)用舉例在拉米夫定抗病毒治療過程中，病毒合成的DNA聚合酶會在YMDD序列出發(fā)生變異。利用HRM和DNA測序法同時檢測45例樣本，其中HRM檢測結(jié)果與測序法檢測結(jié)果幾乎一致，符合率為93.3%。因此利用HRM大規(guī)模檢測YMDD變異是簡單有效的方法。（實用醫(yī)技雜志2008）HRM在甲基化中的應(yīng)用甲基化是蛋白質(zhì)和核酸的一種重要修飾，對調(diào)節(jié)基因表達，癌癥、老年癡呆等許多疾病相關(guān)，因此檢測甲基化在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有重要作用。

利用亞硫酸氫鹽將未甲基化的DNA中的胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶之后，處理過的DNA產(chǎn)物將比甲基化的DNA產(chǎn)物的TM值要低，通過HRM可以將二者區(qū)分開來。

由于HRM