放射性免疫藥盒本科課程

第七章放射免疫分析試劑盒的制備一、概要二、放射免疫分析試劑盒主要組分的制備技術三、典型放射免疫分析試劑盒的制備四、免疫分析技術進展

放射性同位素在醫(yī)學上的應用

γ相機1體內診斷（核醫(yī)學影像學)SPECTPET2治療（放射治療藥物、種子源）

3體外檢測（放射免疫分析）

一、概要概要概念與原理主要的放射標記免疫分析方法放射標記免疫分析方法的特點◆放射免疫分析技術（RIA）是基于免疫分析的特異性與放射性測量的高靈敏性而建立的一種超微量分析方法，能夠定量檢測生物體內成百上千種活性物質，是現(xiàn)代生物、醫(yī)學和臨床診斷的重要手段。1概念與原理以放射性核素（主要為125I,57Co,3H,14C等）標記抗原，抗體，配基或受體，在體外條件下，經(jīng)過不同的結合反應（競爭或非競爭性的），再將結合和未結合的標記物分開，測量其放射性活度，從而計算各種生物活性物質的含量。

◆基本原理抗原(Antigen)：能刺激動物機體的免疫活性細胞產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞，并在體內外與其發(fā)生特異性反應（結合）的物質。一般為異種或異體物質（即機體的免疫活性細胞從未接觸過的異物）。完全抗原：具有上述兩種特性，即單獨能刺激動物機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞，又能與這些產(chǎn)物在體內外發(fā)生特異性結合生成抗原-抗體復合物。大多為大分子量的蛋白質。半抗原(HalfAntigen,Hapten)：單獨不能刺激動物機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞，但能與相應的抗體或致敏淋巴細胞起特異性結合反應生成抗原-抗體復合物的物質。與載體結合后注入動物體內能誘導抗體形成，即成為完全抗原?？贵w(Antibody)：由抗原誘導形成的一種血清球蛋白，與抗原結合形成抗原-抗體復合物。特異性(Specificity)：抗體抗原反應具有特異性，即一種抗體（抗原）只能與相應的抗原（抗體）結合，不能與其它無關的抗原（抗體）結合。哺乳動物IgGIgAIgM人體IgGIgAIgMIgDIgE主要的放射免疫分析方法放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA）

免疫放射量度分析（Immunoradiometricassay,IRMA）

受體放射性配體結合分析（ReceptorRadio-ligandBondingAssay,PRLBA）

放射受體分析（Radio-ReceptorAssay,RRA）2主要的放射標記免疫分析方法1958-1960年由YalowRSandBresonSA創(chuàng)建，為最早的放射標記免疫分析方法。（1977年獲得了諾貝爾生物醫(yī)學獎）。

原理：用放射性核素標記抗原，標記抗原與非標記抗原同時競爭結合物（如抗體）上有限的結合位點。然后將結合與未結合的游離抗原分離，測定其放射性分布，利用標準曲線確定樣本中待測物的含量。1)放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA）Ag*+Ag+AbAg*-Ab+

Ag-Ab游離物（F）復合物（B）對于RIA，應滿足以下條件：◆抗原是純一的，只由一種化學成分組成；◆抗體也僅由一種化學成分組成；◆抗原與抗體均為單價，即一分子抗原只能和一分子抗體反應；◆標記的和未標記的抗原具有相同的物理-化學性質；◆抗原-抗體反應遵循質量作用定律；◆反應達到平衡；◆結合抗原和未結合的游離抗原能完全分開，且不破壞反應平衡；◆能準確測量結合抗原和游離抗原之比，或結合抗原與總抗原之比。K1Ag+AbAgAb

k-1

K（親和常數(shù)）==(AgAb）/[Ag][Ab]

k-1

b/f=（AgAb）/(Ag)=K(Ab)b/f=K(AbT-B)K1放射免免疫分分析的的Scatchard圖圖2)免免疫疫放射射量度度分析析（Immunoradiometricassay,IRMA）在RIA基基礎上上建立立起來來的標標記免免疫分分析方方法。。原理：：用放射射性核核素標標記抗抗體，，以過過量的的標記記抗體體與抗抗原結結合建建立的的方法法.免疫放放射量量度分分析原原理示示意圖圖IRMA劑劑量反反映曲曲線RIA反映映曲線線RIA與IRMA反反應式式比較較方法反應式分離方法RIAAg*+Ag+AbAg*-Ab+

Ag-Ab（定量抗體）液相分離固相分離IRMAAg+Ab*Ag-Ab*+

Ab*Ag+Ab*+固相Ab固相Ab-Ag-Ab*+Ab*（過量抗體）免疫吸附劑或固相分離RIA與IRMA的的工作作原理理主要要區(qū)別別RIAIRMA1競爭性免疫結合分析2反應體系中有抗原、標記抗原和抗體3標記抗原4在標準曲線劑量反應體系中結合率越大，劑量越小，反之，則越大5免疫結合反應慢1非競爭性免疫結合分析2反應體系中有固相抗原、抗原與標記抗體3標記抗體4在標準曲線劑量反應體系中隨結合率增高劑量值也隨之增大5免疫結合反應快特點特異性很強，即使化學結構很接近；靈敏度高，可達10-14mol/L;精確度較高，放射性活度探測不易受干擾；應用范圍較廣，適用于多種化學結構；操作簡單，分析速度快，樣品不需預處理。3放放射標標記免免疫分分析方方法的的特點點主要組分標記物標準品抗血清分離劑質控血清二、放射標標記免免疫試試劑盒盒主要要組分分的制制備技技術（一））標記記物的的制備備技術術核素半衰期衰變方式及分支比主要射線及能量(keV,%)生產(chǎn)方式3H12.3yβ-(100)β-18.61(100)6Li(n,a)3H14C5730yβ+(99.8)EC(0.2)β-155(100)14N(n,p)14C35S87.5dβ-(100)β-167.4(100)35Cl(n,p)35S57Co271.8dIT(100)γ122(85.5)56Fe(d,n)57Co75Se119.8dEC(100)γ136(58)74Se(n,r)75Se125I60.1dEC(100)γ28-35124Xe(n,r)125Xe125I可用于于放射射免疫疫分析析的放放射性性核素素射線易于探測半衰期適中易于標記蛋白質的I標記直接氧化親電法間接標記法氯胺T法（Chloramine-T,Ch-T）酶促標記法Iodogen(氯甘尿法)Bolton-Hunter（BH））方法法其它間間接標標記法法1125I的標標記2標標記物物的分分離純純化分離純化方法離子交換色譜法凝膠色譜(Sephadex)法薄層色譜法高效液相色譜(HPLC)3標標記物物的質質量鑒鑒定質量評價參數(shù)核素(125I)利用率放化純(≥85%)比活度(≥80%)免疫活性(過量抗體結合率)4標標記物物的穩(wěn)穩(wěn)定性性及貯貯存條條件多肽類類標記記物通通常采采用冷冷凍干干燥方方法貯貯存;小分子子化合合物及及單抗抗標記記物可可以液液體狀狀態(tài)貯貯存;標記物物通常常在2-8℃條條件下下保存存，有有效期期約５５周。。（二））抗原原和抗抗體的的制備備技術術１免疫疫原（（抗原原）的的制備備免疫原原的制制備采用生生化技技術提提取(人體體器官官或體體液））采用偶偶聯(lián)技技術制制備親和層析法分子篩法離子交換法高效液相色譜法2抗抗體制制備抗體多克隆抗體單克隆抗體◆動物種種屬選選擇動物家兔綿羊豚鼠等◆免疫增增強劑劑注射方式皮內注射皮下注射腹腔注射靜脈注射凡可增增強被被免疫疫動物物免疫疫應答答反應應的物物質均均可稱稱為免免疫增增強劑劑，其其種種類眾眾多。?！裘庖咦⑸洳课槐巢扛构蓽献銐|◆抗血清清的質質量鑒鑒定質量鑒定親和性特異性滴度◆抗體貯貯存抗血清清加入入0.1%-0.2%防防腐劑劑，按按需要要量分分裝、、凍干干，-50℃貯貯存。。（三））單克克隆抗抗體的的制備備1975年年由Kohler和和Milsten采采用雜雜交瘤瘤技術術第一一次獲獲得。。基本原原理：：利用動動物脾脾細胞胞即淋淋巴細細胞可可以分分泌特特異抗抗體，，而骨骨髓瘤瘤能夠夠在體體外連連續(xù)培培養(yǎng)的的性質質，將將兩種種細胞胞在融融合劑劑（通通常為為PEG））的作作用下下進行行融合合，獲得既既可分分泌特特異抗抗體又又可在在體外外連續(xù)續(xù)進行行培養(yǎng)養(yǎng)的雜雜交瘤瘤細胞胞。因此，，這種種雜交交瘤細細胞就就能在在細胞胞培養(yǎng)養(yǎng)中產(chǎn)產(chǎn)生大大量單單一類類型的的高純純度抗抗體。。單克隆隆抗體體是僅僅由一一種類類型的的細胞胞制造造出來來的抗抗體，，對應應于多多克隆隆抗體體/多多株抗抗體———由由多種種類型型的細細胞制制造出出來的的一種種抗體體。小鼠免疫細胞融合篩選克隆化擴大培養(yǎng)注如小鼠誘發(fā)腹水單克隆抗體制備過過程質量鑒定抗體滴度親和常數(shù)交叉反應免疫球蛋白類型、亞類特點高度勻質性高度特異性來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)缺點熱穩(wěn)定性較差親和性較低價格較高與多克克隆抗抗體比比較（四））分離離劑分離劑劑的作作用是是將分分析體體系中中游離離部分分與結結合部部分進進行有有效的的分離離，直直接影影響RIA測量量結果果的準準確性性。分離劑PR試劑(雙抗體與聚乙二醇沉淀法)磁性分離劑試管固相法分離效果好操作簡便易于大批量自動化分析（五））標準準品與與參考考血清清的制制備1標標準品品要求與被測物具有相同的化學結構和免疫活性來源充足、價格便宜穩(wěn)定、均勻一致量值準確標準品化學純品制備（被測物質結構清楚、可用化學方法合成）類似物制備（被測物質結構不確定、難以用化學方法合成）2參參考血血清一般含含一個個或幾幾個分分析物物，是是免疫疫分析析中用用來比比較和和評價價不同同測定定系統(tǒng)統(tǒng)的偏偏倚和和重復復性的的血清清，也也是用用于內內部或或外部部質量量評價價的主主要試試劑。。作用計算實驗結果誤差（批內、批間精密度）分析誤差原因并進行處理監(jiān)督放免試劑盒穩(wěn)定性判斷分析數(shù)據(jù)可靠性要求與待測物質相近配制的濃度應在測定的工作范圍之內（配制高、中、低三種劑量水平）穩(wěn)定、數(shù)量能滿足較長時間使用（六））數(shù)據(jù)據(jù)處理理與分分析方方法的的有效效性評評估評估的內容特異性靈敏度精密度準確性健全性穩(wěn)定性非特異結合最大結合三、幾幾種典典型放放射免免疫分分析試試劑盒盒的制制備（一））甲狀狀腺素素放射射免疫疫分析析試劑劑盒的的制備備（二））游離離甲狀狀腺素素FT4試劑盒盒的制制備（三））人血血清促促甲狀狀腺激激素免免疫放放射分分析試試劑盒盒的制制備四、免免疫分分析技技術進進展國際市市場市場規(guī)規(guī)模接接近300億美美元，，近期期每年年增長長率在在7-9%左右右。特點◆檢測品品種多多，達達近千千種，，并且且還在在持續(xù)續(xù)增加加；◆同一公公司有有多個個產(chǎn)品品技術術平臺臺；◆多種免疫分析析方法并存，，相互競爭，，相互補充；；◆大公司產(chǎn)品系系列全，小公公司產(chǎn)品有特特色；◆高度集成、自自動化的儀器器診斷與簡單單、快速便于于普及的快速速診斷。國內◆200余廠家家；北京北方生物物技術研究所所濰坊三維生物物工程集團有有限公司北京科美東雅雅生物技術有有限公司原子高科股份份有限公司◆100余種系系列產(chǎn)品；◆市場規(guī)模40億元（國內內與國外各占占一半）；◆年增長率10-16%；；面臨的挑戰(zhàn)◆酶免疫分析(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)◆時間分辨熒光光免疫分析(Time-resolvedFluoroimmunoassay,TRF)◆化學學發(fā)發(fā)光光免免疫疫分分析析(Chemiluminesentimmunoassay,CLIA）放射射免免疫疫分分析析和和非非放放射射免免疫疫分分