五胚胎工程課件

第14章胚胎工程

2013.10

胚胎工程是指以動物胚胎為研究對象而產生的一系列技術操作，它主要包括胚胎移植技術、胚胎冷凍保存技術、體外受精技術、胚胎分割技術和性別控制技術等。在畜牧業(yè)生產和臨床上具有廣泛的應用，近30年來，隨著生物技術的發(fā)展，胚胎工程技術也日新月異，在促進畜牧業(yè)發(fā)展及其相關領域研究中取得了令人矚目的成就。理論基礎：哺乳動物的受精卵和早期胚胎的發(fā)育規(guī)律.

主要內容胚胎發(fā)育的基本過程（※）胚胎移植的意義及原則（※）胚胎移植技術胚胎冷凍保存技術體外受精技術動物克隆技術

一、精卵發(fā)生哺乳動物的生殖是一個相當復雜的生命現(xiàn)象，在胚胎早期，生殖細胞首先與體細胞分離，形成的細胞為原生殖細胞(PGCs),其后，經過性別決定和將要進行的性別分化，形成兩種生殖細胞。生殖細胞經過增殖期、生長期和成熟期,最終形成精子和卵子。1、精子的發(fā)生3）過程：1）場所:2）時期:睪丸的曲細精管初情期生殖機能衰退分三個階段第１階段—初級精母細胞的形成精原細胞大量精原細胞多個初級精母細胞

數(shù)次有絲分裂第２階段：精子細胞的生成初級精母細胞次級精母細胞精子細胞MⅠMⅡ減數(shù)分裂第３階段：精子細胞變形成精子3）過程：精子細胞精子

1.細胞核2.高爾基體3.中心體4.線粒體5.細胞內其他物質精子頭的主要部分頭部的頂體精子的尾線粒體鞘膜(尾的基部)

原生質滴(球狀,最后脫落)精子細胞變形總結4)精子的結構頭部：頂體、細胞核尾部：頸、中段、主段和末端。頂體內部含有水解酶，能協(xié)助精子穿入卵周圍的卵膜。精子質膜外表面存在有多種凝集素受體。鞭毛為9＋2微管結構2.卵子的發(fā)生卵子的發(fā)生與精子不同。在哺乳類，所有卵原細胞成熟后和卵原細胞轉變?yōu)槌跫壜涯讣毎窃谔悍置淝巴瓿伞Ｂ涯讣毎纬呻A段是從胎兒誕生開始一直到性成熟排卵為止。直到青春期卵母細胞才進行生長，以后每個性周期后有一批新的卵母細胞繼續(xù)發(fā)育，而多數(shù)卵母細胞在每個周期發(fā)育中未成熟就退化。卵母細胞的成熟過程受MPF(成熟促進因子）和CSF（細胞生長抑制因子）的相互調節(jié)。1)場所：卵巢2、過程卵原細胞發(fā)生時間：胎兒期，地點：卵巢多個卵原細胞初級卵母細胞ＭⅠ在雌性動物排卵前后完成次級卵母細胞和第一極體ＭⅡ在受精過程中完成地點：輸卵管卵子和兩個極體有絲分裂

卵子的形成增殖期生長期成熟期

3）卵子的結構卵細胞內部物種空間結構排列具有極性，卵內組分沿著卵的主軸分布不均勻，形成動物級和植物級。卵黃積聚在植物級。卵細胞分布在兩個固定的區(qū)域，質膜下細胞質稱為皮層，皮層是高度粘滯、半硬的凝膠狀，內含有皮層顆粒和色素顆粒。大部分卵細胞質——內質是液體狀態(tài)，內含線粒體和生殖質。卵細胞排出卵巢后，有卵膜包被。二、受精作用受精(fertilization)

精子與卵子的融合形成受精卵，這個過程就是受精。精子和卵子的質膜融合，但精子細胞核還未與卵子的核發(fā)生融合，這時卵子被激活，繼續(xù)II減數(shù)分裂的后期，變成卵原核，之后精原核和卵原核發(fā)生融合產生合子。標志:在卵黃膜和透明帶的間隙可以觀察到兩個極體時.場所:輸卵管

2、卵子的成熟與排放哺乳動物的卵發(fā)育與卵母細胞的周圍卵泡細胞的有密切關系。卵母被卵泡細胞包被，成熟在卵泡腔。后卵泡破裂，卵細胞、透明帶等隨卵泡液一起排出經腹膜腔到輸卵管。在排卵到輸卵管前，完成I減，產生卵母細胞和一個小的第一極體，隨后終止在II中期。卵泡細胞發(fā)育為黃體釋放孕酮促使胚胎發(fā)育，如果未完成受精，則促使黃體退化，如果完成受精則在下丘腦分泌的促性腺激素等的作用下使得子宮發(fā)生改變，有利于子宮著床。3、精子的行進在正常生殖過程中，精子在陰道和子宮內的運動速度很快，十幾分鐘即達到輸卵管，積聚在輸卵管峽部下2－3cm處，在此停留十幾到幾十個小時，然后繼續(xù)上行，只有少數(shù)精子可以達到卵管壺峽連接部，在此與剛排出的卵相遇，完成受精過程5、精卵融合過程A頂體反應后，精子穿過透明帶進入卵周隙B以赤道段與卵質膜相融合C融合后卵母細胞皮質顆粒（CGs）胞吐，核開始去致密D精子頭部完全入卵，將一部分卵質膜帶入。6、卵子的激活精子一旦與卵子接觸，卵子本身就開始發(fā)生一系列深刻的變化，即卵子的激活。卵子激活時，皮層顆粒首先于接觸點發(fā)生破裂，然后波及整個卵子的皮層，發(fā)生皮層反應。皮層顆粒內含物被排出，一部分與卵外的卵黃膜一起形成受精膜，防止多精受精。另一部分留在卵子和受精膜間的卵周隙中，吸收水分，結果使受精膜逐漸與卵子分開而舉起。另外，皮層顆粒排放出的粘多糖形成一種粘性的透明膜物質，與卵表面緊密相粘，作用是保持隨后的分裂球聚集在一起。7、透明帶的形成阻斷了其他精子的進入第一個精子進入到卵子后，刺激卵子在質膜的下層顆粒釋放到質膜外側，質膜的外層包被與質膜間產生透明帶。透明帶將阻止其他精子的進一步進入卵子。胚泡：哺乳動物的胚胎處于16細胞期的桑椹期時，胚胎是球型細胞團，細胞之間形成充滿液體的腔隙，然后它們聯(lián)合形成一個大腔位于胚胎的一端，即為胚泡結構。囊胚：桑椹胚隨著卵裂出現(xiàn)充滿液體的囊胚腔，圍繞囊胚腔的細胞組成囊胚層原腸胚：囊胚繼續(xù)發(fā)育、分化，形成雙胚層或三胚層的原腸胚。外層為外胚層、遷到里面的稱為內胚層和中胚層。早期胚胎發(fā)育早期胚胎發(fā)育卵裂：合子發(fā)生分裂形成無數(shù)小細胞。卵裂細胞不生長而連續(xù)分裂。主要是卵裂球的有絲分裂器與表層胞質變化的過程。桑椹胚：卵裂數(shù)次后，出現(xiàn)實心細胞團，形似桑椹得名哺乳動物胚泡著床

內細胞團：在胚泡胚極一端，能夠發(fā)育成為胚胎主體的一團細胞滋養(yǎng)層細胞：外層發(fā)育成為胎盤的細胞。著床：胚泡和子宮壁相互接觸并侵入子宮組織的過程。

第一節(jié)胚胎移植的意義及原則一、胚胎移植的意義二、胚胎移植發(fā)展簡史三、胚胎移植的生理學基礎及原則一、胚胎移植的意義及原則（一）定義

胚胎移植(embryotransfer，ET)：是指對優(yōu)良雌性動物進行超數(shù)排卵處理，在其發(fā)情配種后一定時間內，從其生殖道取出早期胚胎，移植到同期發(fā)情的普通雌性動物生殖道的相應部位，讓其生產后代的技術。

(二)胚胎移植的意義

1.提高優(yōu)良母畜繁殖力，加快優(yōu)良品種改良和動物育種步伐

哺乳動物卵母細胞多達幾十萬個，但在正常情況下，大部分卵泡在發(fā)育中閉鎖，只有一部分能夠形成胚胎，最終發(fā)育成個體。采用超數(shù)排卵(superovulation)技術可以使將要閉鎖的卵泡內的卵子得以利用,增加正常排卵數(shù)和胚胎數(shù),再把胚胎移植到代孕受體，獲得優(yōu)良個體，提高優(yōu)良動物的繁殖力。

2.瀕危動物的拯救與保護瀕危動物的種群數(shù)量急劇下降，近親繁殖嚴重，繁殖力及生活力減退。采取超數(shù)排卵的方法，使有限的雌性動物獲得較多的卵子，輔以體外受精，得到較多胚胎。再將這些胚胎移入同種或近緣種生殖體內，以獲得存活動物。以改善目前瀕危動物的現(xiàn)狀。

3.使不孕母畜獲得生育能力對部分因器質性或內分泌缺陷而不能妊娠的母畜,可以根據(jù)情況專門作為供體或受體,繼續(xù)發(fā)揮其繁殖作用。

4.保存品種資源胚胎長期保存是保存動物品種資源的理想方法。冷凍胚胎還可以和冷凍精液共同構成動物優(yōu)良性狀的基因庫。5.胚胎移植是胚胎工程操作的重要步驟胚胎移植是動物胚胎工程操作的最終目的和必要的技術手段。胚胎工程技術，如卵母細胞及胚胎冷凍保存、體外受精、性別控制、胚胎分割、嵌合、細胞核移植、轉基因動物等，目的均在于改良動物品種，擴大動物種群，造福于人類，所有這些技術最終都必須通過胚胎移植手段，以獲得活的目的動物。

二、胚胎移植發(fā)展簡史人們研究胚胎移植的歷史已有100多年。1、研究初始階段：

1890年，英國劍橋大學WalterHeape將4-細胞期的安哥拉兔胚胎，移植到一只已交配過的比利時野兔的輸卵管內，這只受體兔共產出6只仔兔，其中2只是移植的安哥拉兔胚胎發(fā)育的仔兔。該實驗首次證實了受精卵在受體母畜體內發(fā)育的可能性。

20世紀30年代后，先后在山羊(Wariwick,1934年)、綿羊（Lopyrin,1950年)、豬(,Kvansnickii,1951年)、牛(Willett,1953年）、馬、小鼠、大鼠、人(體外受精胚胎)、貓和犬等多種動物中獲得胚胎移植后代。2、發(fā)展階段：。

3、實用化階段：20世紀70年代，胚胎移植開始被應用于生產實踐。

1971年，首家商業(yè)性胚胎移植公司(Alberta公司)成立。

1973年，牛凍胚移植成功。（英）

1974年國際胚胎移植協(xié)會(IETS)成立。80年代以后，一些國家的胚胎移植應用研究發(fā)展極為迅速，如澳大利亞的安哥拉山羊胚胎移植、日本的奶牛和肉牛胚胎移植等。發(fā)展到目前，一些畜牧業(yè)發(fā)達國家已建立了完整的經營性胚胎移植的企業(yè)和公司，并向國外出售胚胎。

我國的情況：

我國家畜胚胎移植研究始于20世紀70年代,先后獲得兔、綿羊、牛、山羊、馬和豬的胚胎移植成功。

80年代末期以來，胚胎移植生產應用技術逐漸發(fā)展成熟，奶牛、肉牛及一些優(yōu)秀品種的山羊和綿羊的胚胎移植開始逐漸在生產中推廣應用，并已在這些優(yōu)良品種的引種、快速擴繁、品種改良工作中發(fā)揮了巨大的作用。三、胚胎移植的生理學基礎及原則

（一）胚胎移植的生理學基礎

1.供體與受體的同步化供體(受孕)與受體(不受孕)在胚胎移植之前，生理生化狀態(tài)一致,處于相同時期，進行胚胎移植較為適宜。

2.胚胎的游離狀態(tài)胚胎在發(fā)育早期有相當一段時間(附植前)是游離于輸卵管和子宮腔內，其發(fā)育靠本身卵胞質和吸收子宮乳提供營養(yǎng)。所以在離體的培養(yǎng)液環(huán)境下可以存活，當移植回與供體相同的環(huán)境中時又會繼續(xù)發(fā)育。

3.胚胎與受體的關系以及胚胎移植中的免疫問題胚胎必須和受體的子宮內膜建立起生理上和組織上的聯(lián)系才能保證其以后的發(fā)育。一般認為，在同一物種之間移植的胚胎沒有免疫排斥現(xiàn)象，所以當胚胎由供體轉移到受體時可以存活下來。但在生產實際中，移植的胚胎有時不能存活，這除了其他因素之外，可能還涉及復雜的妊娠免疫問題，仍然值得進一步研究闡明。(二)胚胎移植的原則

1.胚胎移植的同一性（1）供體和受體在分類學上的相同屬性

二者屬于同一個物種；

不同種之間(在動物進化史上血緣關系較近，生理和解剖特點相似)。

（2）分類關系較遠的不同種動物間存在很大差異，它們之間的胚胎移植不能存活或只能存活很短時間。

差異點：胚胎組織結構發(fā)育條件(營養(yǎng)、環(huán)境)

發(fā)育速度(附植的時間和妊娠期)

例如：

綿羊、山羊、牛的幼齡胚胎，移植到兔輸卵管內，可以存活數(shù)日并能夠發(fā)育，但最終不能發(fā)育為個體。

2.供體和受體生理狀態(tài)及解剖部位的一致性

發(fā)情時間同期性；空間環(huán)境相似性。受體和供體在發(fā)情時間上的同期性才能保證受體和供體生理一致性，而且移植后的胚胎應與其在供體所處的空間環(huán)境相似。發(fā)育著的胚胎對母體生殖道的環(huán)境變化非常敏感，而生殖道又在卵巢類固醇激素等多種因素作用下，處于時刻變化的動態(tài)之中。一旦胚胎發(fā)育與生殖道環(huán)境的協(xié)調一致性發(fā)生脫節(jié)和錯亂，即意味著相互關系的破壞，導致胚胎死亡。

3.胚胎發(fā)育的期限

(1)從生理學上講，胚胎采集和移植的期限（胚胎的日齡)不能超過母畜發(fā)情周期黃體的壽命，須在受體周期黃體退化之前數(shù)日進行移植；

(2)不能在胚胎開始附植之時進行,通常在供體發(fā)情配種后3-8d內收集胚胎,受體也在相同時間接受胚胎移植。如果超過周期的黃體期進行胚胎移植，由于受體的子宮內環(huán)境發(fā)生未孕的退行性變化，胚胎不能存活。4.胚胎的質量

在整個胚胎移植操作中，胚胎不應受到任何不良因素(物理、化學、微生物)的影響而危及生命力。

移植的胚胎經過鑒定必須是確認發(fā)育正常者。

第二節(jié)胚胎移植技術

供體和受體的選擇供體的超數(shù)排卵處理受體的同期發(fā)情處理供體胚胎回收胚胎檢查及質量鑒定胚胎移植一、供體和受體的選擇

1.供體的選擇（1）具有遺傳學價值；應選擇生產性能優(yōu)良的無遺傳缺陷的品種或個體；（2）最好有一胎以上的正常繁殖史，既往繁殖力記錄較高的母畜，或已充分發(fā)育成熟的后備母畜；（3）健康狀況良好，無生殖器官疾病，發(fā)情周期正常。

2.受體的選擇

1)健康狀況良好、無生殖器官疾病、發(fā)情周期正常的適繁母畜；2)體型過小的母畜不宜作受體。二、供體的超數(shù)排卵

超數(shù)排卵（superovulation）：在動物發(fā)情周期的適當時期，用促性腺激素進行處理，誘發(fā)其卵巢上大量卵泡同時發(fā)育并排出具有受精能力的卵子的技術稱為超數(shù)排卵，簡稱超排（superovulation）。（一）供體超排中常用的生殖激素

促性腺激素孕激素前列腺素1．促性腺激素（1）促卵泡素(folliclestimulatinghormone,FSH)

（2）促黃體素(luteinazinghormone,LH)（3）孕馬血清促性腺激素(pregnantmareserumgonadotropin,PMSG）（4）人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)（5）促排卵3號(luteinizinghormonereleasinghormoneA3，LRH-A3)：國內人工合成的一種促性腺激素釋放素的類似物。（1）促卵泡素(folliclestimulatinghormone,FSH)

由動物腺垂體嗜堿性細胞合成和分泌的一種糖蛋白激素。主要生理作用：刺激有腔卵泡發(fā)育至成熟。進口FSHDSCN0480國產FSHDSCN0494（2）促黃體素(luteinazinghormone,LH)

是腺垂體分泌的另外一種糖蛋白激素。LH與FSH協(xié)同促進卵泡生長成熟、粒膜增生，并參與顆粒細胞合成分泌雌激素，觸發(fā)排卵和黃體形成，使粒膜細胞轉變?yōu)辄S體細胞。

LHDSCN0500LRHA3DSCN0493（3）孕馬血清促性腺激素(pregnantmareserumgonadotropin,PMSG）

是馬懷孕時子宮內膜壁產生的一種糖蛋白激素。作用類似于FSH和LH。（4）人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)

是婦女妊娠早期的絨毛膜滋養(yǎng)層合胞體細胞產生的糖蛋白激素，對母畜的生理作用與LH類似。（5）促排卵3號(luteinizinghormonereleasinghormoneA3，LRH-A3)

是人工合成的一種促性腺激素釋放激素(GnRH)的類似物，為10個氨基酸組成的肽類激素，可使血中FSH和LH水平升高，促進LH排卵峰提前，有增加排卵數(shù)和改善胚胎質量的作用。2．孕激素人工合成的孕酮(progesterone)或其類似物甲基炔諾酮（norgestrel)。

由黃體分泌抑制母畜發(fā)情抑制性中樞通過對丘腦下部或垂體前葉的負反饋作用，抑制FSH和LH的釋放；在黃體萎縮之前，卵巢中雖有卵泡生長，但孕酮存在使其不能迅速發(fā)育，從而抑制母畜發(fā)情；抑制性中樞，使母畜不表現(xiàn)發(fā)情；一旦黃體停止分泌孕酮，F(xiàn)SH就迅速釋放，從而引起卵泡發(fā)育和發(fā)情前期的到來，并隨之出現(xiàn)發(fā)情。3．前列腺素（prostaglandin，PG）為長鏈不飽和羥基脂肪酸。在胚胎移植中，與促性腺激素配合進行供體的超排處理。前列腺素的作用是參與卵巢排卵過程，腦垂體促性腺激素的作用是使卵泡成熟、分泌雌激素及前列腺素，當LH高峰出現(xiàn)時，局部會產生較多濃度前列腺素，促使卵巢間質內平滑肌纖維收縮，導致卵泡破裂，從而發(fā)生排卵。常用人工合成的PGF2α類似物：

a.15-甲基-前列腺素F2α(15-methyl-prostaglandinF2α)b.氯前列烯醇(cloprostenol,ICI-80996)，其活性相當于天然PGF2α的100～200倍。PGDSCN0485PGDSCN0486（二）超數(shù)排卵的基本原理1.維持正常排卵數(shù)的內分泌基礎--FSH和LH

卵巢中原始卵泡在胎兒時期或出生后短時間內就已形成，以后不再增加。這些原始卵泡在一生中先后不斷地開始生長，大部分（99.9%）在發(fā)育至某一階段即退化閉鎖，僅有少數(shù)（0.1%）發(fā)育至成熟卵。若外源施加性激素，能改變卵泡閉鎖現(xiàn)象。2.卵泡生長發(fā)育不同階段的內分泌基礎在卵泡開始生長到排卵的整個過程，依賴FSH、LH；FSH在卵泡腔形成中起重要作用，F(xiàn)SH含量與卵泡閉鎖率有關。3.卵母細胞成熟的內分泌基礎卵母細胞的成熟過程受FSH、LH調節(jié)，如果在卵泡閉鎖開始之前，給予大量FSH，可挽救將要退化閉鎖的卵泡。適時給予排卵激素，F(xiàn)SH可使正常發(fā)育的卵泡進一步發(fā)育并排卵，達到超數(shù)排卵的目的。（三）超排處理的一般程序

1．已知發(fā)情周期的母畜超排（1）在下一次發(fā)情開始前4～5d開始注射促性腺激素進行超排。（2）在超排程序中使用前列腺素溶解黃體而使發(fā)情時間整齊一致。2．未知發(fā)情周期的母畜超排（1）放置孕激素陰道栓處理9～15d后，開始注射促性腺激素進行超排，在孕激素撤除的同時配合使用前列腺素，孕激素撤除后即可引起發(fā)情和超數(shù)排卵。（2）注射前列腺素或其類似物后，開始注射促性腺激素進行超排。

（四）超排舉例

——小鼠的超排小鼠體成熟一般在60～90日齡。因性成熟小鼠超排的排卵數(shù)多于成年鼠，故常用4～6周齡、體重22～25g的性成熟青年鼠進行；小鼠性周期為4～5d。于實驗開始的0d下午4:00，在雌鼠腹腔注射PMSG（孕馬血清促性腺激素）5～10IU；48～50h后，腹腔注射hCG（人絨毛膜促性腺激素）5～10IU；小鼠注射hCG后10～13h排卵，于注射hCG后將雌鼠（1～2只）與雄鼠合籠過夜；超排后第3d上午7:00，觀察配種雌鼠是否有陰道栓形成，有表明配種成功。

----母牛超排用前面所述的超數(shù)排卵技術，在母牛發(fā)情期（發(fā)情期當天為零天）的第九天開始肌肉注射FSH（促卵泡激素），以遞減劑量連續(xù)注射4天，每天注射兩次（間隔12h），總劑量為300~400U；第三天的上下午，在注射FSH的同時肌肉注射氯前列烯醇（PGF2α的類似物）各兩支（0.2mg/支）。三、受體的同期發(fā)情處理同期發(fā)情，包括自然同期發(fā)情和人工同期發(fā)情。（一）同期發(fā)情處理的必要性

1.供體和受體發(fā)情時間相同或相近，移植后的胚胎才能存活；2.自然生產中很難選擇到與供體發(fā)情時間相同、且能滿足生產需要的足夠數(shù)量的自然發(fā)情的受體，需對受體進行同期發(fā)情處理。（二）實驗動物小鼠受體的同期發(fā)情用小于超排劑量的PMSG誘導發(fā)情；注射hCG；將人工超排（或自然排卵）的小鼠與結扎輸精管的公鼠交配，造成假孕。子宮移植時，一般選用假孕2.5天的母鼠。（因為小鼠雖為自發(fā)排卵動物，但如無交配刺激，排卵后形成的黃體則會發(fā)育不良，而不適于做胚胎移植受體)。受體動物假孕動物---利用人為的激素刺激使母畜產生子宮的變化以利于受精卵或囊胚的著床，這種處理得到的受體動物稱為假孕動物.綿羊供體放置孕激素陰道栓綿羊供體超排注射山羊供體超排注射四、胚胎回收

（一）胚胎回收(embryocollection)：也稱采卵，是把胚胎從供體的生殖道中沖洗出來，提供移植或其它胚胎工程研究應用。（二）胚胎操作液(沖卵液)

采用含血清2%～5%的改良杜氏磷酸鹽緩沖液(phoaphatebuffersolution,PBS)。鮮胚體外保存血清濃度：15%～20%。商品化沖卵液DSCN1454（三）胚胎回收階段配種后3～8d，胚胎發(fā)育至4～8細胞以上為宜。（四）胚胎回收的方法

手術回收：羊、豬或其它中小動物，采用手術回收法。

非手術回收：牛等大家畜，采用非手術回收法。

1．牛的胚胎回收于牛發(fā)情后6～8d進行，此時大部分胚胎處于桑椹胚和囊胚階段，并且大都在子宮角。具體操作步驟如下。（1）麻醉用2%利多卡因（5mL/頭）在薦椎和第一尾椎結合處或第一尾椎和第二尾椎結合處施行尾椎硬膜外麻醉。（2）消毒固定牛尾，清除糞便，用清水、酒精棉球沖洗消毒會陰部等，最后用生理鹽水棉球擦試干燥。（3）用沖卵管打開子宮角①用擴宮棒擴張子宮頸，插入宮頸粘液器抽出粘液；②把帶內芯的沖卵管緩慢插入子宮；③當沖卵管達到子宮角彎曲處時，拔出內芯5cm左右，再把沖卵管向子宮角前端推進；④當內芯再次到達子宮角彎曲處時，再向外拔出內芯5～10cm，直到沖卵管到達子宮角前端為止。（4）通過氣囊導管打入一定量空氣，使氣囊膨脹以固定導管在子宮角內的位置和防止沖洗液倒流。（5）抽出沖卵管內芯。（6）連接沖胚和三通導管（圖14-2）。圖14-2三通路非手術胚胎回收(引自日本畜產技術協(xié)會編，牛的受精卵移植技術，平成7年)（7）回收受精卵用50mL注射器每次吸取30～40mL沖卵液，鉗住三通導管的輸出管，將沖卵液從輸入管注入子宮角，然后鉗住輸入管，使回收液從輸出管流到集卵杯（500mL容量），反復10余次。（8）鏡檢把集卵杯內的回收液在溫室下，用集卵漏斗過濾，最后保留10mL左右液體，倒入Ф100mm培養(yǎng)皿中，進行鏡檢。（9）消炎處理兩側子宮角沖卵完成后，將氣囊空氣放出，沖卵管抽至子宮體，灌注抗生素或預防子宮炎的藥物。2．羊手術法胚胎采集（1）麻醉肌注2%的靜松靈全身麻醉，局部注射5%鹽酸普魯卡因封閉麻醉。（2）手術部位可選擇的手術部位有3處，分別為乳房前的腹中線部或左右腹下股內側與乳房之間。（3）常規(guī)消毒（4）用手術刀或手術剪切口，依次牽引出子宮角、輸卵管、卵巢。（5）沖卵

①輸卵管沖胚（回收進入子宮前的胚胎）時間：在超排羊發(fā)情后66～72h從輸卵管采集2～8細胞胚胎。方法：用6#～8#沖卵針（具乳膠管）從宮管連接部的子宮端導入到輸卵管峽部，將回收針（具乳膠管）從輸卵管喇叭口插入2cm左右，回收管遠端與Ф120mm表面皿相接，事先用10mL注射器抽取5～8mL沖卵液，與沖卵針連接，把沖卵液緩緩推入，胚胎即通過輸卵管回收到表面皿中。另一側輸卵管沖胚操作同前（圖14-3）。

圖14-3輸卵管手術回收胚胎回收針表面皿沖卵針注射器阻血鑷固定②子宮沖胚(回收進入子宮角的胚胎)時間：在超排羊發(fā)情后5.5～7.0d，從子宮采集發(fā)育到桑椹胚或囊胚階段的胚胎。方法：用8#～10#回收針在子宮角基部插入，用腸鉗固定，回收管遠端與Ф180mm表面皿相接。在宮管連接部用6#～8#沖卵針插入子宮角，用20mL注射器把沖胚液注入子宮腔，胚胎即通過子宮角回收到表面皿中。另一側子宮角沖胚方法同前（圖14-4）。(5)向子宮內注入氯霉素注射液，將子宮送回腹腔，整理傷口皮膚，縫合傷口。圖14-4子宮角手術回收胚胎回收針腸鉗注射器阻血鑷五、胚胎檢查及質量鑒定鑒定程序：從沖卵液中將胚胎撿出、清洗質量鑒定胚胎保存(一)撿胚與胚胎凈化技術1.撿胚將手術獲得的胚胎回收液收集到集卵杯中，迅速于15～80X實體顯微鏡下?lián)斐雠咛ィ迫牒信咛ヅ囵B(yǎng)液的撿卵杯中。非手術回收的沖卵液量大，在室溫下靜置后，棄去上部液體，將下部回收液放入集卵杯中撿出胚胎。2.胚胎凈化（1）必要性回收的沖胚液中含有生殖道分泌物及脫落下來的上皮細胞、污染的微生物、子宮內感染的病原等。（2）凈化處理沖洗：把撿出的胚胎移入含胚胎培養(yǎng)液的撿卵杯中沖洗2～3次；貯存：貯存在含新鮮胚胎培養(yǎng)液的撿卵杯中；保鮮：在移植前貯存時間如超過2h，應每2h更換一次新鮮培養(yǎng)液。（二）胚胎質量鑒定形態(tài)學法染色檢查體外培養(yǎng)法1．形態(tài)學鑒定

在50～160X的生物顯微鏡下觀察：①卵子是否受精：未受精卵的特點是透明帶內分布有均勻的顆粒，無卵裂球（胚細胞）；②透明帶的規(guī)則性，即形狀、厚度、有無破損等；③胚胎的色調和透明度；④卵裂球的致密程度，細胞大小是否有差異以及變性情況；⑤卵周隙是否有游離細胞或細胞碎片；⑥胚胎本身的發(fā)育階段與胚胎日齡是否一致。圖14-5不同發(fā)育階段的正常牛胚胎2．染色檢查

(1)熒光染色檢查二乙酸熒光素（3,6-Diacetyl-Fluorescin,FDA）是一種熒光原物質，游離狀態(tài)下為一種基礎熒光染料，酯化狀態(tài)下無色，酯化物在酶作用下水解后會出現(xiàn)熒光產物產生熒光。未受損害的細胞，酶活性強，細胞膜完整，進入細胞的熒光素在酶作用下，酯化物水解顯示熒光，由于細胞膜完整，熒光物質不會很快從細胞中游離出來，熒光顯微鏡下活力愈強的細胞顯示出淡綠色的熒光愈強。死亡或活力降低的細胞不發(fā)熒光或僅有微弱熒光。

染色方法:在有蓋的小撿卵杯中，加入PBS約2mL，并放入胚胎，加入1%FDA丙酮溶液1μL，在37℃下培養(yǎng)5～10min；將胚胎移入新鮮的PBS中洗滌一次。再在清潔的凹面玻璃片上滴2～3滴PBS，在熒光顯微鏡下觀察。(2)臺盼藍染色檢查

胚胎用0.5%的臺盼藍溶液染色3～5min，清潔后在顯微鏡下觀察。有活力的細胞不著色，死亡的細胞充滿著臺盼藍著色顆粒。3．體外培養(yǎng)法

方法是把被鑒定的胚胎在一定條件下進行體外培養(yǎng)，如果進一步發(fā)育，說明胚胎是活的，如果不發(fā)育則可認為培養(yǎng)前的胚胎是死的。（三）胚胎的分級

形態(tài)學分級：A級(優(yōu)秀胚)B級(良好胚)C級(一般胚)D級(不良胚)A級（可用）：形態(tài)正常，卵裂球致密、整齊、清晰，發(fā)育階段與日齡一致，無游離的細胞和液泡或很少，變性細胞比例＜10%。B級（可用）：卵裂球稍顯不勻，致密、整齊，有游離細胞和液泡，變性細胞占10%～30%。C級：卵裂球不勻稱，變形，發(fā)育較慢，游離細胞或液泡較多，變性細胞達30%～50%。D級：卵裂球多數(shù)變形、異常，發(fā)育緩慢，變性細胞占胚胎大部分，約75%。

六、胚胎移植

手術法移植非手術法移植（一）牛的胚胎移植

1．手術移植

先將受體母牛做好術前準備。在右腹部切口，找到有黃體側子宮角，再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宮角前端，注入胚胎，然后將子宮復位，縫合切口。2．非手術移植一般于在發(fā)情后第6～9d進行，過早移植會影響受胎率。工具：胚胎移植槍

0.25mL細管方法：將細管截去適量，吸入少許保存液，吸一個氣泡，然后吸入含胚胎的少許保存液，再吸入一個氣泡，最后再吸取少許保存液（培養(yǎng)液-氣泡-含胚胎培養(yǎng)液-氣泡-培養(yǎng)液）將裝有胚胎的細管裝入移植槍內，通過子宮頸插入子宮角深部，注入胚胎。圖14-6牛非手術胚胎移植裝置示意圖A.移植槍塑料外套鈍金屬頭(兩側帶孔)；B.移植槍塑料外套；C.移植槍套管；D.移植槍套芯；E.液段；F.含胚胎的液段；G.液段；H.胚胎細管；I，J.氣泡；K.胚胎細管棉塞。ABCDEFGIJHK牛胚胎移植用人工受精管，通過子宮頸進入子宮體，然后注入胚胎

第三節(jié)胚胎冷凍保存技術一、胚胎保存的含義及歷史

1.胚胎保存指將胚胎在正常發(fā)育溫度下暫時儲存于體內或體外而不使其失去活力；或者將其保存于低溫或超低溫情況下，使細胞處于新陳代謝和分裂速度減慢或停止的狀態(tài)，一旦恢復正常發(fā)育溫度時，又能繼續(xù)發(fā)育。2.胚胎冷凍保存的研究歷史始于20世紀50年代，當時Smith用甘油作防凍劑，保存兔胚胎獲得成功。1971年Whittingham用慢速冷凍法獲得小鼠胚胎成功保存。1978年Willadsen建立了快速冷凍方法。1984年Takeda等采用一步冷凍法首次冷凍小鼠胚胎獲得成功。1985年RaU和Fahy用高濃度的DMSO、乙酰胺、丙二醇和聚乙二醇分別組成玻璃化溶液，對8細胞期的小鼠胚胎進行一步冷凍試驗，獲得87.5％的凍后發(fā)育率。之后，牛、綿羊、山羊、家兔和大鼠胚胎先后應用玻璃化冷凍法獲得成功。目前胚胎冷凍技術已經廣泛應用于畜牧生產。3.胚胎冷凍技術的意義可用于建立胚胎庫、保存動物品種資源，簡化胚胎移植過程，降低引種費用并防止因引進活畜而傳播疫病。二、胚胎冷凍保存的原理

胚胎細胞內水分含量達80%以上，在冷凍過程中有90%的水分形成游離水，而游離水在低溫下易形成冰晶，破壞蛋白質硫氫鍵，發(fā)生不可逆變化，導致細胞死亡。通過凍前在稀釋液中加入一定濃度的低溫保護劑如甘油或蔗糖，改變細胞膜滲透性和溶液滲透壓，防止溶液效應和滲透壓差異，讓細胞在保護劑中平衡并適當脫水，將凍傷降到最低程度。減少降溫和復溫過程中冰晶的形成。胚胎在冷凍過程中，大約在-10℃以上時細胞內不結冰，在-10℃以下時，胞質形成冰晶。胚胎在冷凍過程和解凍過程中兩次通過易形成冰晶的危險溫區(qū)(-15～-50℃)。采取適當?shù)睦鋬龇椒ê偷蜏乇Ｗo劑(抗凍保護劑，cryoprotectiveagents），可使胚胎安全通過危險溫區(qū)。三、胚胎冷凍方法

(一)抗凍保護劑①低分子量可滲透性保護劑：如甘油、乙二醇、二甲基亞砜等；②小分子不可滲物質：如海藻糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖等；③大分子保護劑：如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylprolidone,PVP)、聚乙烯醇(polyvinylalcohol,PVA)等；④混合保護劑:如甘油、乙二醇、丙二醇和二甲基亞砜等。（二）常規(guī)冷凍解凍

——冷凍保存時緩慢降溫脫水，解凍時快速復溫到常溫

凍存：1．將胚胎依次放入含0.7mol／L甘油的PBS液和含1.4mol／L甘油的PBS液中，各平衡7～10min；2．將平衡后的胚胎裝入0.25mL細管中，細管兩端均為冷凍液，中間段為含胚胎的冷凍液，每段之間用氣泡隔開；3．將細管放入預先冷卻至-7℃的冷凍儀中，平衡10min后，用液氮中預冷過的醫(yī)用鑷子植冰；4．以0.3℃／min的速度，降溫至-35℃；將細管投入液氮。解凍：1.解凍從液氮中取出細管，在空氣中平衡10～20s，投入35℃水浴中，至冰晶融解；2．脫除冷凍保護劑從細管中推出冷凍液及胚胎，撿胚，移入含1.0mol/L蔗糖的PBS中10min，一步脫除冷凍保護劑，再用PBS洗滌胚胎2～3次，用于移植。（三）一步冷凍法利用高濃度的抗凍劑使胚胎在冷凍前脫水，從而減少冷凍過程中細胞內冰晶的形成。其特點是胚胎在室溫脫水后不需要特殊的降溫程序，能在很短的時間內完成冷凍過程，實用價值高。操作程序：1．將胚胎移入含1.4mol／L甘油的PBS中平衡20min；2．再移入含2.1mol／L甘油和0.25mol／L蔗糖的PBS中平衡7min，裝管；4．將細管在液氮罐內頸部處(溫度為-23～-25℃)預冷5min后投入液氮中保存。5．解凍時從液氮中取出細管，在空氣中平衡10s，置于37℃水浴解凍；6．脫除冷凍保護劑

操作如常規(guī)冷凍法

也可采取在裝管時，將含1.0mol／L蔗糖的PBS裝入細管兩端，這樣便可省去脫除保護劑的程序，解凍后的細管直接用于移植。（四）玻璃化法玻璃化法(vitrification)是近年來發(fā)展起來的一種新方法。玻璃化溶液的組成是25％甘油、25％1,2-丙二醇或25％乙二醇。高濃度的滲透保護劑組成的玻璃化液是一種粘稠的玻璃態(tài)物質，低溫時它不結晶就可固化。胚胎在這種溶液中脫水一定程度，可引起內源性大分子和已滲入的保護劑濃縮，從而使細胞在急劇降溫過程中得以保護。玻璃化法程序：

1．于室溫下將胚胎移入含10％甘油的PBS中平衡10min；2．將胚胎轉移到含10％甘油和20％乙二醇的PBS中；3．將胚胎移入含25％甘油和25％乙二醇的PBS中，立即裝管；4．把細管在液氮罐內頸部處預冷5min后投入液氮保存或直接投入液氮；5．解凍時從液氮中取出細管，在空氣中平衡7s，迅速投入20℃溫水中，搖動細管使其解凍均勻；6．收集胚胎，將撿出的胚胎移入含1.0mol／L蔗糖的PBS中平衡10min，一步脫除保護劑；再用PBS洗滌胚胎2～3次后用于移植。玻璃化法優(yōu)缺點：

優(yōu)點：簡單、快速，防止了冰晶對胚胎造成的損傷。缺點：由于玻璃化溶液的濃度極高且溶質存在毒性，會使胚胎的成活率降低。解決辦法：①通過兩步平衡胚胎；②縮短平衡時間；③降低平衡溫度；④使用蔗糖、海藻糖等抗毒性物質。四、冷凍效果的鑒定冷凍胚胎解凍后，要對其活力進行鑒定，才能確定是否適于移植，并對其冷凍和解凍方法做出評價。(一)形態(tài)學鑒定

胚胎解凍后在實體顯微鏡下觀察，能恢復到凍前的形態(tài)，透明度適中，胚內細胞致密，細胞間界限清晰，可認為是存活的胚胎，適于移植。如果透明帶有輕度破損，但胚胎細胞基本保持完整，或胚內大部分細胞形態(tài)正常，可觀察出細胞間的界限，僅有極少數(shù)細胞崩解成小顆粒，這類胚胎仍可移植，其中一部分仍可能發(fā)育為正常胎兒。若透明帶破裂、內細胞團松散、胚內細胞變暗或變亮呈玻璃狀，以及進入解凍液后不能擴張恢復到凍前大小或整個胚胎崩解，均是由于胚胎在冷凍或解凍過程中受到嚴重損害而失去活力。在100～200倍的相差顯微鏡進行暗視野檢查，存活的胚胎呈球形，透明度高，細胞膜光滑，胞質內有很少的反光微粒，有時可見較暗的細胞核。熒光檢查細胞均發(fā)強熒光。活力降低的胚胎，胚胎內變得渾濁，透明度降低，胞質內反光顆粒增大增多，熒光微弱。死亡的胚胎中細胞無定形，變成一堆反光性很強的大顆粒。這種顆粒可能是由于蛋白質變性凝結成不可溶的物質而形成的，因而使反光性增強而透明度變差。（二）染色檢查可采用熒光染色檢查和臺盼藍染色檢查進行解凍后胚胎的質量鑒定。（三）培養(yǎng)鑒定

1.體外培養(yǎng)冷凍胚胎解凍后，在37℃條件下培養(yǎng)6～12h，能繼續(xù)發(fā)育者為存活胚胎。2.異體培養(yǎng)將解凍后的胚胎置于結扎的兔輸卵管內，體內培養(yǎng)12～24h。再從輸卵管內沖出來，檢查發(fā)育情況，存活的胚胎能進一步發(fā)育。（四）移植檢驗

將解凍后的胚胎移植給受體動物，根據(jù)受體的妊娠率和產仔率計算胚胎的存活率是最直接可靠的檢驗方法。輕度受損的胚胎用間接檢查法檢查時，可能表現(xiàn)為存活的胚胎，但發(fā)育潛力可能已受到損害，這種胚胎移植后也可能妊娠，但當胚胎發(fā)育到某一階段時就可能死亡，造成妊娠中斷。五、存在問題

冷凍胚胎法雖然在大多數(shù)家畜已獲得成功，但目前應用較廣泛的是牛。凍胚移植的妊娠率比鮮胚低，影響因素包括冷凍保護液的種類、冷凍和解凍方法、胚胎發(fā)育階段以及操作者的技術熟練程度等。生產中主要采用形態(tài)學方法鑒定凍胚質量，對其移植后的發(fā)育能力無法判斷。冷凍解凍程序復雜，保護液和冷凍程序未規(guī)范化，使用的冷凍防護劑對胚胎尚有一定毒性。從理論上講，冷凍胚胎可長期保存，但對于保存過程中是否發(fā)生老化的問題還缺乏直接的實踐證據(jù)。期待隨著低溫生物學的發(fā)展和冷凍技術研究的深入，胚胎冷凍技術在畜牧業(yè)生產和其他生物技術研究中發(fā)揮更好的作用。

復習題1.名詞解釋：胚胎移植，超數(shù)排卵，同期發(fā)情，胚胎冷凍。2.超數(shù)排卵常用的激素有哪些？3.胚胎移植的原則是什么？4.簡述胚胎移植的方法、程序及操作過程。5.簡述胚胎的質量鑒定及分級方法。6.常用的胚胎采集方法有哪些？7.常用的胚胎冷凍方法有哪些，之間有什么區(qū)別？8.冷凍胚胎的質量如何判定？試管嬰兒制作流程

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四、體外受精

體外受精