基因組數(shù)據(jù)分析解析課件

基因組數(shù)據(jù)注釋和功能分析

基因組數(shù)據(jù)注釋和功能分析1通過(guò)序列比對(duì)工具BLAST學(xué)習(xí)，了解蛋白編碼基因的功能注釋原理介紹多序列聯(lián)配工具ClustalX分子進(jìn)化分析軟件MEGA4的基本知識(shí)，掌握系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)繪制的基本方法通過(guò)序列比對(duì)工具BLAST學(xué)習(xí)，了解蛋白編碼基因的功能注釋原2序列比對(duì)的進(jìn)化基礎(chǔ)序列比對(duì)的目的：從核酸以及氨基酸的層次去分析序列的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)，以推測(cè)他們的結(jié)構(gòu)、功能以及進(jìn)化上的聯(lián)系通過(guò)判斷兩個(gè)序列之間的相似性來(lái)判定兩者是否具有同源性相似性：直接的數(shù)量關(guān)系，如：序列之間相似部分的百分比同源性：質(zhì)的判斷，兩個(gè)基因在進(jìn)化上是否曾有共同祖先的推斷序列比對(duì)的進(jìn)化基礎(chǔ)序列比對(duì)的目的：3BLAST基本局部比對(duì)搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool)NCBI上BLAST服務(wù)的網(wǎng)址：

/blast/NCBI的BLAST程序及數(shù)據(jù)庫(kù)下載網(wǎng)址：

/blastBLAST基本局部比對(duì)搜索工具(BasicLocalA4選擇物種選擇blast程序選擇物種選擇blast程序5QuerySequenceAminoacidSequenceDNASequencetBLASTxBLASTxBLASTntBLASTnBLASTpNucleotideDatabaseProteinDatabaseNucleotideDatabaseNucleotideDatabaseProteinDatabaseTranslatedTranslatedQuerySequenceAminoacidSeque6程序名搜索序列數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容備注blastpProteinProtein比較氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)使用取代矩陣尋找較遠(yuǎn)的關(guān)系，進(jìn)行SEG過(guò)濾blastnNucleotideNucleotide比較核酸序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)尋找較高分值的匹配，對(duì)較遠(yuǎn)的關(guān)系不太適用blastxNucleotideProtein比較核酸序列理論上的六框架的所有轉(zhuǎn)換結(jié)果和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)用于新的DNA序列和ESTs的分析，可轉(zhuǎn)譯搜索序列tblastnProteinNucleotide比較蛋白質(zhì)序列和核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換為六框架結(jié)果用于尋找數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有標(biāo)注的編碼區(qū)，可轉(zhuǎn)譯數(shù)據(jù)庫(kù)序列tblastxNucleotideNucleotide比較核酸序列和核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)過(guò)兩次動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換為六框架結(jié)果轉(zhuǎn)譯搜索序列與數(shù)據(jù)庫(kù)序列程序名搜索序列數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容備注blastpProteinPro7與核酸相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)與蛋白質(zhì)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)與核酸相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)與蛋白質(zhì)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)8選擇數(shù)據(jù)庫(kù)序列或目標(biāo)序列的GI號(hào)以文件格式上傳選擇數(shù)據(jù)庫(kù)序列或目標(biāo)序列的GI號(hào)以文件格式上傳9配對(duì)與錯(cuò)配空位罰分配對(duì)與錯(cuò)配空位罰分10PSI-BLAST:位點(diǎn)特異迭代

PSI-BLAST:11打分矩陣：PAM30PAM70BLOSUM80BLOSUM62BLOSUM45打分矩陣：12選擇打分矩陣（scoringmatrix） ThePAMfamily

Basedonglobalalignments

ThePAM1isthematrixcalculatedfromcomparisonsofsequenceswithnomorethan1%divergence.OtherPAMmatricesareextrapolatedfromPAM1.

TheBLOSUMfamily

Basedonlocalalignments.BLOSUM62isamatrixcalculatedfromcomparisonsofsequenceswithnolessthan62%divergence.AllBLOSUMmatricesarebasedonobservedalignments;theyarenotextrapolatedfromcomparisonsofcloselyrelatedproteins.選擇打分矩陣（scoringmatrix） ThePAM13進(jìn)行比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)圖形化結(jié)果進(jìn)行比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)圖形化結(jié)果14TheExpectvalue(E)isaparameterthatdescribesthenumberofhitsonecan"expect"toseejustbychancewhensearchingadatabaseofaparticularsize.TheExpectvalue(E)isapara15基因組數(shù)據(jù)分析解析課件16上機(jī)實(shí)習(xí)1：網(wǎng)上運(yùn)行blastx和blastn

(NCBIblast網(wǎng)址：/BLAST/）>lesson.seq.screen.Contig34TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTGCCAGTTTTTTTTTTTATTTGTAAAGCTCTGCCATAAACTTCTAGCGTGTGCCAATGGTCACCTGCCACACTCGCACCAGGTTGTCCGTGTAGCCAGCAAACAGAGTCTGGCCATCAGCAGACCAGGCCAGGGAGGTGCACTGGGGTGGTTCTGCCTTGCTGCTGGTACTGATAACTTCTTGCTTCAGTTCATCTACAATGATCTTTCCCTCTAAATCCCAGATCTTGATGCTGGGGCCTGTGGAGCACACAGCCAGTAGCGGTTAGGGCTGAAGCACAGGGCGTTGATGATGTCCCCACCATCTAGCGTGTAAAGGTGTTTGCCTTCGTTGAGATCCCATAACATGGCCTGGCCATCCTTGCCTCCAGAAGCACAGAGGGATCCATCTGGAGAGACAGTCACCGTGTTCAGATAGCCTGTGTGGCCAATGTGGTTGGTCTTCAGCTTGCAGTTAGCCAGGTTCCATACCTTGACCAGCTTGTCCCAGCCACAGGAGACGATGATAGGGTTGCTGCTGTTGGGCGAGAAGCGGACACAAGACACCCACTCTGAGTGGCTCTCATCCTGGACAGTGTATTTGCACACACCCAGGGTATTCCATAGCTTGATGGTTTTATCTCGAGATCCAGAGACAATCTGCCGGTTGTCAGAGGAGAAGGCCACACTCAGCACATCCTTGGTATGGCCCACAAATCGCCTCGTGGTGGTGCCCGTTGTGAGATCCCAGAAGGCGCAGGGTTCCATCCCAGGAGCCTGAGAGGGCAAACTGGCCATCTGAGGAGATAACCACATCACTAACAAAGTGGGAGTGACCCCGCAGAGCACGCTGTGGAATTCCATAGTTGGTCTCATCCCTGGTCAGTTTCCACATGATGATGGTCTTATCTCGAGAGGCGGAGAGGATCATGTCCGGGAACTGCGGGGTAGTAGCGATCTGGGTTACCCAGCCGTTGTGGCCCTTGAGGGTGCCACGAAGGGTCATCTGCTCAGTCATGGCGGCGGCGAGAGCGTGTTCGCTGCAGCGACGAGGATGGCACTGGATGGCTTAGAGAAACTAGCACCACAGTCGACC對(duì)contig34進(jìn)行網(wǎng)上blastn（演示），blastx（自行操作）比對(duì)上機(jī)實(shí)習(xí)1：網(wǎng)上運(yùn)行blastx和blastn (NCBI17本地運(yùn)行BLAST下載（/blast/download.shtml

）安裝（安裝到C:\）數(shù)據(jù)庫(kù)的格式化（formatdb）程序運(yùn)行（blastall）

本地運(yùn)行BLAST下載（http://www.ncbi.n18基因組數(shù)據(jù)分析解析課件19雙擊安裝到D盤(pán)產(chǎn)生三個(gè)文件夾bindatadoc將db,in復(fù)制到Blast/bin文件夾下bin含可執(zhí)行程序(將數(shù)據(jù)庫(kù)及需要比對(duì)操作的數(shù)據(jù)放入該文件)；data文件夾含打分矩陣及演示例子的序列數(shù)據(jù)信息；doc文件夾含關(guān)于各子程序的說(shuō)明文檔。雙擊安裝到D盤(pán)將db,in復(fù)制到bin含可執(zhí)行程序(將數(shù)據(jù)20數(shù)據(jù)庫(kù)的格式化formatdb命令用于數(shù)據(jù)庫(kù)的格式化：formatdb[option1][option2][option3]…formatdb常用參數(shù)-idatabase_name需要格式化的數(shù)據(jù)庫(kù)名稱(chēng)-pT\F待格式化數(shù)據(jù)庫(kù)的序列類(lèi)型（核苷酸選F；蛋白質(zhì)選T；默認(rèn)值為T(mén))

例：formatdb-idb-pT對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)“db”進(jìn)行格式化數(shù)據(jù)庫(kù)的格式化formatdb命令用于數(shù)據(jù)庫(kù)的格式化：對(duì)蛋白21

程序運(yùn)行blastall命令用于運(yùn)行五個(gè)blast子程序:

blastall[option1][option2][option3]

blastall常用參數(shù)

四個(gè)必需參數(shù)

-pprogram_name,程序名，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)及搜索文件序列性質(zhì)進(jìn)行選擇；

-ddatabase_name,數(shù)據(jù)庫(kù)名稱(chēng),比對(duì)完成格式化的數(shù)據(jù)庫(kù)；

-iinput_file,搜索文件名稱(chēng)；

-ooutput_file,BLAST結(jié)果文件名稱(chēng)；

2個(gè)常用參數(shù)-eexpectation，期待值,默認(rèn)值為10.0，可采用科學(xué)計(jì)數(shù)法來(lái)表示，如2e-5；

-Ffilter?過(guò)濾低復(fù)雜性序列，默認(rèn)為T(mén),默認(rèn)低復(fù)雜性序列不參加比對(duì)；例：blastall-pblastx-ddb-FF-iin-oout

-e2e-5

程序運(yùn)行blastall命令用于運(yùn)行五個(gè)blast子22blast部分參數(shù):blast部分參數(shù):23上機(jī)實(shí)習(xí)2:本地運(yùn)行blastx進(jìn)入DOS命令行提示符狀態(tài)（“運(yùn)行”

cmd）進(jìn)入C盤(pán)“cd\”

進(jìn)入包含序列數(shù)據(jù)的bin目錄下“cdBlast\bin”察看目錄下內(nèi)容“dir”

格式化數(shù)據(jù)庫(kù)db“formatdb–idb–pT”運(yùn)行blastx“blastall–pblastx–iin–ddb–oout”察看結(jié)果moreout.txt輸入數(shù)據(jù)庫(kù)類(lèi)型：F/TBlast程序序列輸入數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果輸出上機(jī)實(shí)習(xí)2:本地運(yùn)行blastx進(jìn)入DOS命令行提示符狀態(tài)24基因組數(shù)據(jù)分析解析課件25輸入“cd\”-〉回車(chē)回到安裝目錄C盤(pán)輸入“cdblast\bin”-〉回車(chē)到達(dá)blast程序下bin文件夾輸入“cd\”-〉回車(chē)輸入“cdblast\bin”-〉26輸入“dir”-〉回車(chē)察看bin文件夾下內(nèi)容bin文件夾下包含以.exe為后綴的程序文件以及這次實(shí)習(xí)需要用到的數(shù)據(jù)可文件“bd”和目標(biāo)序列文件“in”輸入“dir”-〉回車(chē)bin文件夾下包含以.exe為后綴的程27輸入“moredb”-〉回車(chē)察看db文件內(nèi)容空格鍵翻頁(yè)輸入“q”跳出輸入“moredb”-〉回車(chē)察看db文件內(nèi)容空格鍵翻頁(yè)28輸入“formatdb–idb–pT”-〉回車(chē)對(duì)db數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行格式化輸入“formatdb–idb–pT”-〉回車(chē)29輸入“dir”-〉回車(chē)察看bin文件夾下內(nèi)容格式化以后產(chǎn)生的文件輸入“dir”-〉回車(chē)格式化以后產(chǎn)生的文件30輸入“blastall–pblastx–iin–ddb–oout”-〉回車(chē)運(yùn)行blastx程序輸入“blastall–pblastx–iin–d31產(chǎn)生的結(jié)果文件“out”產(chǎn)生的結(jié)果文件“out”32用”moreout”察看結(jié)果文件用”moreout”33EST數(shù)據(jù)注釋小結(jié)：一、注釋評(píng)價(jià)相同物種中有高度相似的序列其它物種有高度相似的序列其它物種有中度相似的序列其它物種相似度低的序列含有某些結(jié)構(gòu)域或者基序(motif)EST數(shù)據(jù)注釋小結(jié)：一、注釋評(píng)價(jià)34二、程序選擇序列信息BLASTFASTA(http://www.ebi.ac.uk/fasta/) 較高敏感度,但速度較慢(可通過(guò)ktup值調(diào)節(jié))BLITZ(http://www.ebi.ac.uk/searches/blitz.html)

更為靈敏,所需時(shí)間更長(zhǎng)三、低復(fù)雜度區(qū)域（LCRs）低復(fù)雜度區(qū)域過(guò)濾將該類(lèi)區(qū)域轉(zhuǎn)化為不明確字符（蛋白質(zhì)用X，核酸用N）二、程序選擇35多序列比對(duì)的目的從物種的一些分子特性出發(fā)，從而了解物種之間的生物系統(tǒng)發(fā)生的關(guān)系。通過(guò)序列同源性的比較進(jìn)而了解基因的進(jìn)化以及生物系統(tǒng)發(fā)生的內(nèi)在規(guī)律。多序列比對(duì)的目的36分子鐘不同生物系統(tǒng)的同一血紅蛋白分子的氨基酸隨著時(shí)間的推移而以幾乎一定的比例相互量換著（Zuckerkandl&Pauling,1962）蛋白質(zhì)，基因序列在單位時(shí)間以大致恒定的速度進(jìn)行置換直系同源(orthologs):同源的基因是由于共同的祖先基因進(jìn)化而產(chǎn)生的.旁系同源(paralogs):同源的基因是由于基因復(fù)制產(chǎn)生的.用于分子進(jìn)化分析中的序列必須是直系同源的，才能真實(shí)反映進(jìn)化過(guò)程。分子鐘37paralogsorthologsparalogsorthologs38多序列比對(duì)的應(yīng)用：系統(tǒng)發(fā)育分析(phylogeneticanalysis)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(structureprediction)序列基序鑒定(sequencemotifidentification)功能預(yù)測(cè)(functionprediction)ClustalW/ClustalX：一種全局的多序列比對(duì)程序，可以用來(lái)繪制親緣樹(shù)，分析進(jìn)化關(guān)系。MEGA4多序列比對(duì)的應(yīng)用：39ClustalW的運(yùn)行

本地運(yùn)行 命令行操作的ClustalX（linux) 窗口化操作的ClustalX（windows） 下載頁(yè)面： （http://www.ebi.ac.uk/clustalw)網(wǎng)上運(yùn)行（http://www.ebi.ac.uk/clustalw)

ClustalW的運(yùn)行40·目標(biāo)序列各種參數(shù)設(shè)定下載ClustalX·目標(biāo)序列各種參數(shù)設(shè)定下載ClustalX41Jalview結(jié)果下載Jalview結(jié)果下載42基因組數(shù)據(jù)分析解析課件43上機(jī)實(shí)習(xí)2：本地運(yùn)行ClastalX

17-RNASE1.fasta多序列比對(duì)（MultipleAlignment）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（BootstrapN-J）上機(jī)實(shí)習(xí)2：本地運(yùn)行ClastalX

17-RNASE1.f44在C:\zcni\shiyan1\clustalx1.83文件夾下，找到clustalx.exe雙擊打開(kāi)在45Clustalx窗口Clustalx窗口46點(diǎn)擊File下拉菜單中Loadsequences選項(xiàng)，打開(kāi)序列文件17-RNASE1.fasta.txt點(diǎn)擊File下拉菜單中47打開(kāi)后的界面打開(kāi)后的界面48可在Alignment下拉菜單中的AlignmentParameters中設(shè)定各個(gè)參數(shù)可在Alignment下拉菜單中的AlignmentPar49點(diǎn)擊Alignment下拉菜單中的DoCompleteAlignment進(jìn)行比對(duì)點(diǎn)擊Alignment下拉菜單中的DoCompleteA50比對(duì)結(jié)果‘*’‘:’和空格依次代表改為點(diǎn)的序列一致性由高到低比對(duì)結(jié)果51選擇Trees下拉菜單中的DrawN-JTree構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，并且保存選擇Trees下拉菜單中的DrawN-JTree構(gòu)建進(jìn)化52在C:\zcni\shiyan1\clustalx1.83文件夾下，找到njplotWIN95.exe雙擊打開(kāi)用于打開(kāi)進(jìn)化樹(shù)文件在53在njplotWIN95中打開(kāi)剛才構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)（文件后綴為.ph）在njplotWIN95中打開(kāi)54在ClustalX中采用Bootstrap檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)Bootstrap重復(fù)值至少為100（默認(rèn)設(shè)置為1000）在ClustalX中采用Bootstrap檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)Boot55在njplotWIN95中打開(kāi)進(jìn)化樹(shù)（文件后綴為.phb）在njplotWIN95中打開(kāi)進(jìn)化樹(shù)56點(diǎn)擊BootstrapValue前的方框在各節(jié)點(diǎn)前顯示該點(diǎn)所通過(guò)Bootstrap檢驗(yàn)的次數(shù)點(diǎn)擊57MEGA4一個(gè)關(guān)于序列分析及比較統(tǒng)計(jì)的工具包包含距離建樹(shù),MP等建

樹(shù)法自動(dòng)或手動(dòng)進(jìn)行序列比對(duì)；推斷進(jìn)化樹(shù)；估算分子進(jìn)化率，進(jìn)行進(jìn)化假設(shè)測(cè)驗(yàn)；聯(lián)機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索；…MEGA4一個(gè)關(guān)于序列分析及比較58聯(lián)機(jī)BLAST聯(lián)機(jī)BLAST59輸入序列號(hào)：NM_198232

選擇數(shù)據(jù)庫(kù)（Nucleotidecollection）輸入序列號(hào)：NM_198232選擇數(shù)據(jù)庫(kù)60基因組數(shù)據(jù)分析解析課件61選擇符合要求的序列：19386966932095761938696819386946選擇符合要求的序列：62提取所選序列提取所選序列63基因組數(shù)據(jù)分析解析課件64以genbank格式顯示以genbank格式顯示65點(diǎn)擊AddtoAlignment點(diǎn)擊AddtoAlignment66自動(dòng)跳出序列窗口自動(dòng)跳出序列窗口67進(jìn)行ClustalW比對(duì)進(jìn)行ClustalW比對(duì)68DataExportAlignmentMEGAformat命名為17RNASE.meg，保存到目錄C:\zcni\shixi1\DataExportAlignmentMEGAfor69基因組數(shù)據(jù)分析解析課件70更改參數(shù)設(shè)定為：差異位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)（p-distance）顯示兩兩序列間距離更改參數(shù)設(shè)定為：顯示兩兩序列間距離71進(jìn)行分子鐘檢驗(yàn)(MolecularClockTest)選擇外類(lèi)群（Outgroup）:H.sapiensRNASE1A和B序列M.mulattaRNASE1P.nemaeusRNASE1采用默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行分子鐘檢驗(yàn)(MolecularClockTest)72基因組數(shù)據(jù)分析解析課件73MEGA4可以識(shí)別fasta格式文件將17-RNASE1.fasta.txt重命名為17-RNASE1.fastaMEGA4可以識(shí)別fasta格式文件74編輯標(biāo)注保守區(qū)域標(biāo)注不匹配的區(qū)域選擇打開(kāi)方式為MEGA4，打開(kāi)17-RNASE1.fasta，自動(dòng)跳出序列窗口編輯標(biāo)注保守區(qū)域標(biāo)注不匹配的區(qū)域選擇打開(kāi)方75在MEGA4主窗口構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)在MEGA4主窗口構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)76選擇Bootstrap重復(fù)次數(shù)，至少為100次選擇Bootstrap重復(fù)次數(shù)，至少為100次77進(jìn)化樹(shù)的可靠性分析BootstrapMethod從排列的多序列中隨機(jī)有放回的抽取某一列，構(gòu)成相同長(zhǎng)度的新的排列序列重復(fù)上面的過(guò)程，得到多組新的序列對(duì)這些新的序列進(jìn)行建樹(shù)，再觀察這些樹(shù)與原始樹(shù)是否有差異，以此評(píng)價(jià)建樹(shù)的可靠性至少進(jìn)行100次重復(fù)取樣進(jìn)化樹(shù)的可靠性分析BootstrapMethod從排列的多78原始數(shù)據(jù)多序列比對(duì)結(jié)果對(duì)序列中每個(gè)位置重復(fù)抽樣，基于原比對(duì)結(jié)果生成多個(gè)樣本原始數(shù)據(jù)多對(duì)序列中每個(gè)79OringinaltreeBootstrapconsensustree節(jié)點(diǎn)上的值為通過(guò)Bootstrap檢驗(yàn)的次數(shù)選擇模型為P-distanceOringinaltree選擇模型為80不同樹(shù)型Tree:樹(shù)型選擇Branch:分支信息修改Label:分支名稱(chēng)修改Scale:標(biāo)尺設(shè)定Cutoff:cutoff值

不同樹(shù)型Tree:樹(shù)型選擇81軟件網(wǎng)址說(shuō)明ClustalXhttp://bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/圖形化的多序列比對(duì)工具ClustalWhttp://www.cf.ac.uk/biosi/research/biosoft/Downloads/clustalw.html命令行格式的多序列比對(duì)工具GeneDoc/biomed/genedoc/多序列比對(duì)結(jié)果的美化工具BioEdit/BioEdit/bioedit.html序列分析的綜合工具M(jìn)EGA/圖形化、集成的進(jìn)化分析工具，不包括MLPAUP/商業(yè)軟件，集成的進(jìn)化分析工具PHYLIP/phylip.html免費(fèi)的、集成的進(jìn)化分析工具PHYMLhttp://atgc.lirmm.fr/phyml/最快的ML建樹(shù)工具PAMLhttp://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.htmlML建樹(shù)工具Tree-puzzlehttp://www.tree-puzzle.de/較快的ML建樹(shù)工具M(jìn)rBayes/基于貝葉斯方法的建樹(shù)工具M(jìn)AC5/software/mac5/基于貝葉斯方法的建樹(shù)工具TreeViewhttp://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html進(jìn)化樹(shù)顯示工具軟件網(wǎng)址說(shuō)明ClustalXhttp://bips.u-st82上機(jī)練習(xí)3：MEGA4.0上機(jī)練習(xí)3：MEGA4.083謝謝！謝謝！84選擇構(gòu)樹(shù)方法最大簡(jiǎn)約法(maximumparsimony,MP) 對(duì)所有可能的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算，并計(jì)算出所需替代數(shù)最小的那個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，作為最優(yōu)樹(shù)?；诰嚯x矩陣UPGMA(UnweightedPair-GroupMethodusingAnathematicAverage) 將類(lèi)間距離定義為兩個(gè)類(lèi)成員距離的平均值，廣泛應(yīng)用于距離矩陣NJ（Neighbor-joining） 把所有n個(gè)序列兩兩比對(duì)，構(gòu)建NJ樹(shù)（起指導(dǎo)作用），每個(gè)對(duì)比后的成對(duì)序列都可以跟第三條序列或者另一個(gè)新的alignment比對(duì)，按照距離遠(yuǎn)近，用來(lái)決定下一個(gè)參與

比對(duì)的序列選擇構(gòu)樹(shù)方法最大簡(jiǎn)約法(maximumparsimony,85最大簡(jiǎn)約法（MP）不需要處理大量核苷酸或者氨基酸替代存在較多的回復(fù)突變或平行突變，而被檢驗(yàn)的序列位點(diǎn)數(shù)又比較少的時(shí)候，可能會(huì)給出一個(gè)不合理的或者錯(cuò)誤的進(jìn)化樹(shù)推導(dǎo)結(jié)果UPGMA所有分支突變率相近突變率相差較大時(shí)容易現(xiàn)已較少使用鄰接法（NJ）遠(yuǎn)源序列對(duì)相似度很低的序列，往往出現(xiàn)Long-branchattraction（LBA，長(zhǎng)枝吸引現(xiàn)象），嚴(yán)重干擾進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建最大簡(jiǎn)約法（MP）不需要處理大量核苷酸或者氨基酸替代存在較多86

基因組數(shù)據(jù)注釋和功能分析

基因組數(shù)據(jù)注釋和功能分析87通過(guò)序列比對(duì)工具BLAST學(xué)習(xí)，了解蛋白編碼基因的功能注釋原理介紹多序列聯(lián)配工具ClustalX分子進(jìn)化分析軟件MEGA4的基本知識(shí)，掌握系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)繪制的基本方法通過(guò)序列比對(duì)工具BLAST學(xué)習(xí)，了解蛋白編碼基因的功能注釋原88序列比對(duì)的進(jìn)化基礎(chǔ)序列比對(duì)的目的：從核酸以及氨基酸的層次去分析序列的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)，以推測(cè)他們的結(jié)構(gòu)、功能以及進(jìn)化上的聯(lián)系通過(guò)判斷兩個(gè)序列之間的相似性來(lái)判定兩者是否具有同源性相似性：直接的數(shù)量關(guān)系，如：序列之間相似部分的百分比同源性：質(zhì)的判斷，兩個(gè)基因在進(jìn)化上是否曾有共同祖先的推斷序列比對(duì)的進(jìn)化基礎(chǔ)序列比對(duì)的目的：89BLAST基本局部比對(duì)搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool)NCBI上BLAST服務(wù)的網(wǎng)址：

/blast/NCBI的BLAST程序及數(shù)據(jù)庫(kù)下載網(wǎng)址：

/blastBLAST基本局部比對(duì)搜索工具(BasicLocalA90選擇物種選擇blast程序選擇物種選擇blast程序91QuerySequenceAminoacidSequenceDNASequencetBLASTxBLASTxBLASTntBLASTnBLASTpNucleotideDatabaseProteinDatabaseNucleotideDatabaseNucleotideDatabaseProteinDatabaseTranslatedTranslatedQuerySequenceAminoacidSeque92程序名搜索序列數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容備注blastpProteinProtein比較氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)使用取代矩陣尋找較遠(yuǎn)的關(guān)系，進(jìn)行SEG過(guò)濾blastnNucleotideNucleotide比較核酸序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)尋找較高分值的匹配，對(duì)較遠(yuǎn)的關(guān)系不太適用blastxNucleotideProtein比較核酸序列理論上的六框架的所有轉(zhuǎn)換結(jié)果和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)用于新的DNA序列和ESTs的分析，可轉(zhuǎn)譯搜索序列tblastnProteinNucleotide比較蛋白質(zhì)序列和核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換為六框架結(jié)果用于尋找數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有標(biāo)注的編碼區(qū)，可轉(zhuǎn)譯數(shù)據(jù)庫(kù)序列tblastxNucleotideNucleotide比較核酸序列和核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)過(guò)兩次動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換為六框架結(jié)果轉(zhuǎn)譯搜索序列與數(shù)據(jù)庫(kù)序列程序名搜索序列數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容備注blastpProteinPro93與核酸相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)與蛋白質(zhì)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)與核酸相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)與蛋白質(zhì)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)94選擇數(shù)據(jù)庫(kù)序列或目標(biāo)序列的GI號(hào)以文件格式上傳選擇數(shù)據(jù)庫(kù)序列或目標(biāo)序列的GI號(hào)以文件格式上傳95配對(duì)與錯(cuò)配空位罰分配對(duì)與錯(cuò)配空位罰分96PSI-BLAST:位點(diǎn)特異迭代

PSI-BLAST:97打分矩陣：PAM30PAM70BLOSUM80BLOSUM62BLOSUM45打分矩陣：98選擇打分矩陣（scoringmatrix） ThePAMfamily

Basedonglobalalignments

ThePAM1isthematrixcalculatedfromcomparisonsofsequenceswithnomorethan1%divergence.OtherPAMmatricesareextrapolatedfromPAM1.

TheBLOSUMfamily

Basedonlocalalignments.BLOSUM62isamatrixcalculatedfromcomparisonsofsequenceswithnolessthan62%divergence.AllBLOSUMmatricesarebasedonobservedalignments;theyarenotextrapolatedfromcomparisonsofcloselyrelatedproteins.選擇打分矩陣（scoringmatrix） ThePAM99進(jìn)行比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)圖形化結(jié)果進(jìn)行比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)圖形化結(jié)果100TheExpectvalue(E)isaparameterthatdescribesthenumberofhitsonecan"expect"toseejustbychancewhensearchingadatabaseofaparticularsize.TheExpectvalue(E)isapara101基因組數(shù)據(jù)分析解析課件102上機(jī)實(shí)習(xí)1：網(wǎng)上運(yùn)行blastx和blastn

(NCBIblast網(wǎng)址：/BLAST/）>lesson.seq.screen.Contig34TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTGCCAGTTTTTTTTTTTATTTGTAAAGCTCTGCCATAAACTTCTAGCGTGTGCCAATGGTCACCTGCCACACTCGCACCAGGTTGTCCGTGTAGCCAGCAAACAGAGTCTGGCCATCAGCAGACCAGGCCAGGGAGGTGCACTGGGGTGGTTCTGCCTTGCTGCTGGTACTGATAACTTCTTGCTTCAGTTCATCTACAATGATCTTTCCCTCTAAATCCCAGATCTTGATGCTGGGGCCTGTGGAGCACACAGCCAGTAGCGGTTAGGGCTGAAGCACAGGGCGTTGATGATGTCCCCACCATCTAGCGTGTAAAGGTGTTTGCCTTCGTTGAGATCCCATAACATGGCCTGGCCATCCTTGCCTCCAGAAGCACAGAGGGATCCATCTGGAGAGACAGTCACCGTGTTCAGATAGCCTGTGTGGCCAATGTGGTTGGTCTTCAGCTTGCAGTTAGCCAGGTTCCATACCTTGACCAGCTTGTCCCAGCCACAGGAGACGATGATAGGGTTGCTGCTGTTGGGCGAGAAGCGGACACAAGACACCCACTCTGAGTGGCTCTCATCCTGGACAGTGTATTTGCACACACCCAGGGTATTCCATAGCTTGATGGTTTTATCTCGAGATCCAGAGACAATCTGCCGGTTGTCAGAGGAGAAGGCCACACTCAGCACATCCTTGGTATGGCCCACAAATCGCCTCGTGGTGGTGCCCGTTGTGAGATCCCAGAAGGCGCAGGGTTCCATCCCAGGAGCCTGAGAGGGCAAACTGGCCATCTGAGGAGATAACCACATCACTAACAAAGTGGGAGTGACCCCGCAGAGCACGCTGTGGAATTCCATAGTTGGTCTCATCCCTGGTCAGTTTCCACATGATGATGGTCTTATCTCGAGAGGCGGAGAGGATCATGTCCGGGAACTGCGGGGTAGTAGCGATCTGGGTTACCCAGCCGTTGTGGCCCTTGAGGGTGCCACGAAGGGTCATCTGCTCAGTCATGGCGGCGGCGAGAGCGTGTTCGCTGCAGCGACGAGGATGGCACTGGATGGCTTAGAGAAACTAGCACCACAGTCGACC對(duì)contig34進(jìn)行網(wǎng)上blastn（演示），blastx（自行操作）比對(duì)上機(jī)實(shí)習(xí)1：網(wǎng)上運(yùn)行blastx和blastn (NCBI103本地運(yùn)行BLAST下載（/blast/download.shtml

）安裝（安裝到C:\）數(shù)據(jù)庫(kù)的格式化（formatdb）程序運(yùn)行（blastall）

本地運(yùn)行BLAST下載（http://www.ncbi.n104基因組數(shù)據(jù)分析解析課件105雙擊安裝到D盤(pán)產(chǎn)生三個(gè)文件夾bindatadoc將db,in復(fù)制到Blast/bin文件夾下bin含可執(zhí)行程序(將數(shù)據(jù)庫(kù)及需要比對(duì)操作的數(shù)據(jù)放入該文件)；data文件夾含打分矩陣及演示例子的序列數(shù)據(jù)信息；doc文件夾含關(guān)于各子程序的說(shuō)明文檔。雙擊安裝到D盤(pán)將db,in復(fù)制到bin含可執(zhí)行程序(將數(shù)據(jù)106數(shù)據(jù)庫(kù)的格式化formatdb命令用于數(shù)據(jù)庫(kù)的格式化：formatdb[option1][option2][option3]…formatdb常用參數(shù)-idatabase_name需要格式化的數(shù)據(jù)庫(kù)名稱(chēng)-pT\F待格式化數(shù)據(jù)庫(kù)的序列類(lèi)型（核苷酸選F；蛋白質(zhì)選T；默認(rèn)值為T(mén))

例：formatdb-idb-pT對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)“db”進(jìn)行格式化數(shù)據(jù)庫(kù)的格式化formatdb命令用于數(shù)據(jù)庫(kù)的格式化：對(duì)蛋白107

程序運(yùn)行blastall命令用于運(yùn)行五個(gè)blast子程序:

blastall[option1][option2][option3]

blastall常用參數(shù)

四個(gè)必需參數(shù)

-pprogram_name,程序名，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)及搜索文件序列性質(zhì)進(jìn)行選擇；

-ddatabase_name,數(shù)據(jù)庫(kù)名稱(chēng),比對(duì)完成格式化的數(shù)據(jù)庫(kù)；

-iinput_file,搜索文件名稱(chēng)；

-ooutput_file,BLAST結(jié)果文件名稱(chēng)；

2個(gè)常用參數(shù)-eexpectation，期待值,默認(rèn)值為10.0，可采用科學(xué)計(jì)數(shù)法來(lái)表示，如2e-5；

-Ffilter?過(guò)濾低復(fù)雜性序列，默認(rèn)為T(mén),默認(rèn)低復(fù)雜性序列不參加比對(duì)；例：blastall-pblastx-ddb-FF-iin-oout

-e2e-5

程序運(yùn)行blastall命令用于運(yùn)行五個(gè)blast子108blast部分參數(shù):blast部分參數(shù):109上機(jī)實(shí)習(xí)2:本地運(yùn)行blastx進(jìn)入DOS命令行提示符狀態(tài)（“運(yùn)行”

cmd）進(jìn)入C盤(pán)“cd\”

進(jìn)入包含序列數(shù)據(jù)的bin目錄下“cdBlast\bin”察看目錄下內(nèi)容“dir”

格式化數(shù)據(jù)庫(kù)db“formatdb–idb–pT”運(yùn)行blastx“blastall–pblastx–iin–ddb–oout”察看結(jié)果moreout.txt輸入數(shù)據(jù)庫(kù)類(lèi)型：F/TBlast程序序列輸入數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果輸出上機(jī)實(shí)習(xí)2:本地運(yùn)行blastx進(jìn)入DOS命令行提示符狀態(tài)110基因組數(shù)據(jù)分析解析課件111輸入“cd\”-〉回車(chē)回到安裝目錄C盤(pán)輸入“cdblast\bin”-〉回車(chē)到達(dá)blast程序下bin文件夾輸入“cd\”-〉回車(chē)輸入“cdblast\bin”-〉112輸入“dir”-〉回車(chē)察看bin文件夾下內(nèi)容bin文件夾下包含以.exe為后綴的程序文件以及這次實(shí)習(xí)需要用到的數(shù)據(jù)可文件“bd”和目標(biāo)序列文件“in”輸入“dir”-〉回車(chē)bin文件夾下包含以.exe為后綴的程113輸入“moredb”-〉回車(chē)察看db文件內(nèi)容空格鍵翻頁(yè)輸入“q”跳出輸入“moredb”-〉回車(chē)察看db文件內(nèi)容空格鍵翻頁(yè)114輸入“formatdb–idb–pT”-〉回車(chē)對(duì)db數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行格式化輸入“formatdb–idb–pT”-〉回車(chē)115輸入“dir”-〉回車(chē)察看bin文件夾下內(nèi)容格式化以后產(chǎn)生的文件輸入“dir”-〉回車(chē)格式化以后產(chǎn)生的文件116輸入“blastall–pblastx–iin–ddb–oout”-〉回車(chē)運(yùn)行blastx程序輸入“blastall–pblastx–iin–d117產(chǎn)生的結(jié)果文件“out”產(chǎn)生的結(jié)果文件“out”118用”moreout”察看結(jié)果文件用”moreout”119EST數(shù)據(jù)注釋小結(jié)：一、注釋評(píng)價(jià)相同物種中有高度相似的序列其它物種有高度相似的序列其它物種有中度相似的序列其它物種相似度低的序列含有某些結(jié)構(gòu)域或者基序(motif)EST數(shù)據(jù)注釋小結(jié)：一、注釋評(píng)價(jià)120二、程序選擇序列信息BLASTFASTA(http://www.ebi.ac.uk/fasta/) 較高敏感度,但速度較慢(可通過(guò)ktup值調(diào)節(jié))BLITZ(http://www.ebi.ac.uk/searches/blitz.html)

更為靈敏,所需時(shí)間更長(zhǎng)三、低復(fù)雜度區(qū)域（LCRs）低復(fù)雜度區(qū)域過(guò)濾將該類(lèi)區(qū)域轉(zhuǎn)化為不明確字符（蛋白質(zhì)用X，核酸用N）二、程序選擇121多序列比對(duì)的目的從物種的一些分子特性出發(fā)，從而了解物種之間的生物系統(tǒng)發(fā)生的關(guān)系。通過(guò)序列同源性的比較進(jìn)而了解基因的進(jìn)化以及生物系統(tǒng)發(fā)生的內(nèi)在規(guī)律。多序列比對(duì)的目的122分子鐘不同生物系統(tǒng)的同一血紅蛋白分子的氨基酸隨著時(shí)間的推移而以幾乎一定的比例相互量換著（Zuckerkandl&Pauling,1962）蛋白質(zhì)，基因序列在單位時(shí)間以大致恒定的速度進(jìn)行置換直系同源(orthologs):同源的基因是由于共同的祖先基因進(jìn)化而產(chǎn)生的.旁系同源(paralogs):同源的基因是由于基因復(fù)制產(chǎn)生的.用于分子進(jìn)化分析中的序列必須是直系同源的，才能真實(shí)反映進(jìn)化過(guò)程。分子鐘123paralogsorthologsparalogsorthologs124多序列比對(duì)的應(yīng)用：系統(tǒng)發(fā)育分析(phylogeneticanalysis)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(structureprediction)序列基序鑒定(sequencemotifidentification)功能預(yù)測(cè)(functionprediction)ClustalW/ClustalX：一種全局的多序列比對(duì)程序，可以用來(lái)繪制親緣樹(shù)，分析進(jìn)化關(guān)系。MEGA4多序列比對(duì)的應(yīng)用：125ClustalW的運(yùn)行

本地運(yùn)行 命令行操作的ClustalX（linux) 窗口化操作的ClustalX（windows） 下載頁(yè)面： （http://www.ebi.ac.uk/clustalw)網(wǎng)上運(yùn)行（http://www.ebi.ac.uk/clustalw)

ClustalW的運(yùn)行126·目標(biāo)序列各種參數(shù)設(shè)定下載ClustalX·目標(biāo)序列各種參數(shù)設(shè)定下載ClustalX127Jalview結(jié)果下載Jalview結(jié)果下載128基因組數(shù)據(jù)分析解析課件129上機(jī)實(shí)習(xí)2：本地運(yùn)行ClastalX

17-RNASE1.fasta多序列比對(duì)（MultipleAlignment）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（BootstrapN-J）上機(jī)實(shí)習(xí)2：本地運(yùn)行ClastalX

17-RNASE1.f130在C:\zcni\shiyan1\clustalx1.83文件夾下，找到clustalx.exe雙擊打開(kāi)在131Clustalx窗口Clustalx窗口132點(diǎn)擊File下拉菜單中Loadsequences選項(xiàng)，打開(kāi)序列文件17-RNASE1.fasta.txt點(diǎn)擊File下拉菜單中133打開(kāi)后的界面打開(kāi)后的界面134可在Alignment下拉菜單中的AlignmentParameters中設(shè)定各個(gè)參數(shù)可在Alignment下拉菜單中的AlignmentPar135點(diǎn)擊Alignment下拉菜單中的DoCompleteAlignment進(jìn)行比對(duì)點(diǎn)擊Alignment下拉菜單中的DoCompleteA136比對(duì)結(jié)果‘*’‘:’和空格依次代表改為點(diǎn)的序列一致性由高到低比對(duì)結(jié)果137選擇Trees下拉菜單中的DrawN-JTree構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，并且保存選擇Trees下拉菜單中的DrawN-JTree構(gòu)建進(jìn)化138在C:\zcni\shiyan1\clustalx1.83文件夾下，找到njplotWIN95.exe雙擊打開(kāi)用于打開(kāi)進(jìn)化樹(shù)文件在139在njplotWIN95中打開(kāi)剛才構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)（文件后綴為.ph）在njplotWIN95中打開(kāi)140在ClustalX中采用Bootstrap檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)Bootstrap重復(fù)值至少為100（默認(rèn)設(shè)置為1000）在ClustalX中采用Bootstrap檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)Boot141在njplotWIN95中打開(kāi)進(jìn)化樹(shù)（文件后綴為.phb）在njplotWIN95中打開(kāi)進(jìn)化樹(shù)142點(diǎn)擊BootstrapValue前的方框在各節(jié)點(diǎn)前顯示該點(diǎn)所通過(guò)Bootstrap檢驗(yàn)的次數(shù)點(diǎn)擊143MEGA4一個(gè)關(guān)于序列分析及比較統(tǒng)計(jì)的工具包包含距離建樹(shù),MP等建

樹(shù)法自動(dòng)或手動(dòng)進(jìn)行序列比對(duì)；推斷進(jìn)化樹(shù)；估算分子進(jìn)化率，進(jìn)行進(jìn)化假設(shè)測(cè)驗(yàn)；聯(lián)機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索；…MEGA4一個(gè)關(guān)于序列分析及比較144聯(lián)機(jī)BLAST聯(lián)機(jī)BLAST145輸入序列號(hào)：NM_198232

選擇數(shù)據(jù)庫(kù)（Nucleotidecollection）輸入序列號(hào)：NM_198232選擇數(shù)據(jù)庫(kù)146基因組數(shù)據(jù)分析解析課件147選擇符合要求的序列：19386966932095761938696819386946選擇符合要求的序列：148提取所選序列提取所選序列149基因組數(shù)據(jù)分析解析課件150以genbank格式顯示以genbank格式顯示151點(diǎn)擊AddtoAlignment點(diǎn)擊AddtoAlignment152自動(dòng)跳出序列窗口自動(dòng)跳出序列窗口153進(jìn)行ClustalW比對(duì)進(jìn)行ClustalW比對(duì)154DataExportAlignmentMEGAformat命名為17RNASE.meg，保存到目錄C:\zcni\shixi1\DataExportAlignmentMEGAfor155基因組數(shù)據(jù)分析解析課件156更改參數(shù)設(shè)定為：差異位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)（p-distance）顯示兩兩序列間距離更改參數(shù)設(shè)定為：顯示兩兩序列間距離157進(jìn)行分子鐘檢驗(yàn)(MolecularClockTest)選擇外類(lèi)群（Outgroup）:H