核酸診斷試劑的質(zhì)控和評價課件

體外診斷試劑的臨床研究

體外診斷試劑的臨床研究1體外診斷試劑的種類化學(xué)或生化檢測試劑免疫學(xué)檢測試劑抗原檢測抗體檢測核酸檢測試劑核酸雜交技術(shù)核酸擴增技術(shù)其他試劑體外診斷試劑的種類化學(xué)或生化檢測試劑2核酸擴增技術(shù)目的片段的擴增聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的擴增技術(shù)（TAS）鏈取代的擴增技術(shù)（SDA）探針的擴增連接擴增反應(yīng)（LAR）以FEN-1DNA聚合酶為基礎(chǔ)的擴增循環(huán)探針信號擴增核酸擴增技術(shù)目的片段的擴增3免疫檢測的原理直接法間接法免疫檢測的原理直接法4免疫反應(yīng)中按標(biāo)記物分類同位素標(biāo)記的放射免疫法酶標(biāo)記的酶聯(lián)免疫法生物素標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光法熒光素標(biāo)記時間分辨法其他標(biāo)記物免疫反應(yīng)中按標(biāo)記物分類同位素標(biāo)記的放射免疫法5臨床研究的意義以及目的臨床前樣品雖有代表性，但數(shù)量畢竟有限并不能完全代表臨床情況通過臨床試驗對臨床前制定的各項指標(biāo)進行修正可以發(fā)現(xiàn)或預(yù)測在實際應(yīng)用中遇到的問題，在說明書中提醒用戶注意臨床研究的意義以及目的臨床前樣品雖有代表性，但數(shù)量畢竟有限并6臨床研究的基本要求倫理考慮一般樣品特殊樣品對研究對象保密臨床前研究結(jié)果臨床研究的基本要求倫理考慮7對臨床研究單位以及人員的要求從事相應(yīng)的工作具有相應(yīng)的技術(shù)人員有相應(yīng)的儀器設(shè)備如果試劑對儀器無特殊要求，則應(yīng)選擇不同品牌或不同型號有不同專業(yè)人員參加至少兩家省級單位對實施實驗單位的能力進行評價指綜合能力包括檢測能力、儀器設(shè)備和人員等,主要檢測盲樣，符合要求這方能參與對臨床研究單位以及人員的要求從事相應(yīng)的工作8對照方法或試劑的要求新診斷試劑疾病癥狀以及臨床診斷相關(guān)試劑研究對象的追蹤隨訪疾病的判斷標(biāo)準(zhǔn)已有同類產(chǎn)品的試劑可選擇同類試劑;若評價試劑所用的原料為基因工程產(chǎn)品，應(yīng)用非基因工程原料制備的試劑進行評價；對結(jié)果不一致樣品的處理

對照方法或試劑的要求新診斷試劑9臨床樣品的選擇人群:根據(jù)試劑的適應(yīng)癥選擇不同的人群樣品:應(yīng)為自然人群，尚未用同類試劑進行篩查過選擇不同地區(qū):代表被測物的不同流行率，代表被測物的不同基因型或血清型疾病的時期:樣品的數(shù)量:

臨床樣品的選擇人群:根據(jù)試劑的適應(yīng)癥選擇不同的人群10檢測方法盲法平行檢測結(jié)果不一致樣品的進一步分析檢測方法盲法平行檢測11診斷試劑的臨床評價指標(biāo)

靈敏度（Sensitivity）：在陽性樣品中檢出陽性樣品的百分比特異性（Specificity）：在陰性樣品中檢出陰性樣品的百分比樣品分布(eg.STDEV;)

Suitabilityofcut-off陰性預(yù)期值(NPV)：若樣品沒有反應(yīng)，則不含檢測物的可能性陽性預(yù)期值(PPV)：若樣品有反應(yīng)，則含檢測物體的可能性重復(fù)性（Reproducibility）準(zhǔn)確性（Accuracy)

精確性(Precision）診斷試劑的臨床評價指標(biāo)靈敏度（Sensitivity）：12靈敏度定義：試劑的檢測限度方法：檢測一定數(shù)量的陰性樣品，計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差均值和標(biāo)準(zhǔn)差，臨界值等于均值加上2個標(biāo)準(zhǔn)差意義：在臨界值以上的樣品有95%為真陽性

臨界值的評估：檢測一系列正常人群、非正常人群和特殊人群對臨界值進行核對表示方法：以量值表示（如ng，單位，CFU/ml，PFU/ml，拷貝數(shù)等）；以稀釋度表示靈敏度定義：試劑的檢測限度13影響靈敏度的因素特殊疾病

有一些特殊的病人，其代謝異?？赡苡绊憳?biāo)志物的檢測干擾物質(zhì)或抑制物質(zhì)可以來自與病人（藥物）；也可來自于樣品的處理過程（反復(fù)凍融，溶血等）；或樣品本身存在抑制物等樣品基因型和血清型的影響

有些被測物存在多種基因型或血清型，若原材料沒有廣譜性，則可影響靈敏度試劑的灰區(qū)：

對特殊的試劑要制定灰區(qū)，如FDA要求HCV抗體試劑臨界值以上均為灰區(qū)，對灰區(qū)樣品要加倍重試影響靈敏度的因素特殊疾病14核酸檢測抑制物的作用原理核酸擴增需要酶的參與酶發(fā)揮作用需要輔助因子以及特殊的條件輔助因子與酶的特殊部位物理結(jié)合后發(fā)生反應(yīng)任何結(jié)合輔助因子、改變環(huán)境或阻止酶與輔助因子特異結(jié)合的物質(zhì)均抑制反應(yīng)核酸檢測抑制物的作用原理核酸擴增需要酶的參與15核酸擴增常見的抑制物血紅素及其代謝物影響DNA聚合酶的反應(yīng)，不同來源的DNA聚合酶受影響程度不同痰中的酸性多聚糖或糖蛋白均影響DNA聚合酶的反應(yīng)腦脊液和尿中可能含有抑制物，但具體物質(zhì)不明確糞便中的膽汁鹽是PCR反應(yīng)的強抑制劑肝素可與DNA聚合酶結(jié)合，對不同的酶抑制程度不同核酸提取試劑中的某些物質(zhì)具有抑制作用：EDTA，SDS，鹽酸胍等核酸擴增常見的抑制物血紅素及其代謝物影響DNA聚合酶的反應(yīng)，16內(nèi)標(biāo)的種類未修飾性的內(nèi)標(biāo)異源性內(nèi)標(biāo)修飾性的內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)的種類未修飾性的內(nèi)標(biāo)17特異性定義：主要指假陽性的檢出情況評價方法：主要是通過檢測部分樣品，或特殊樣品尤其是性質(zhì)相近的標(biāo)志物（如不同基因型或血清型樣品），分析出現(xiàn)假陽性的情況；而且分析時要注意在不同量時的特異性特異性定義：主要指假陽性的檢出情況18造成非特異性的因素原料：主要純度不夠，原料本身存在非特異反應(yīng)物質(zhì)反應(yīng)模式：如孵育時間縮短非特異反應(yīng)可提高3-4倍，非常短時可高達10倍樣品中的干擾物質(zhì)：病人本身：如自身免疫性疾?。ǜ呙庖咔虻鞍籽Y等），黃疸類、溶血類和高脂類病人病人使用特殊藥物樣品處理過程：如不同抗凝劑，不同試管，某些化學(xué)或去污劑以及樣品反復(fù)凍融等因素造成非特異性的因素原料：主要純度不夠，原料本身存在非特異反應(yīng)19核酸檢測中造成非特異性的因素交叉反應(yīng)：主要是引物序列與被測物中序列存在一定程度的同源性樣品之間的污染：氣溶膠中含有目的微生物，對照的污染等擴增產(chǎn)物的污染：擴增產(chǎn)物聚集在器皿、臺面、設(shè)備以及通風(fēng)設(shè)施上等造成污染核酸檢測中造成非特異性的因素交叉反應(yīng)：主要是引物序列與被測物20污染的處理酶的滅活（UNG）主要用于滅活產(chǎn)物光化學(xué)處理用可溶性psoralen的衍生物處理，在用長紫外照射即可滅活產(chǎn)物、也可減少樣品的污染化學(xué)處理方法用于表面的處理

10%次氯酸鈉紫外照射物理的:

專用移液器、一次性試管架、紫外燈、PCR工作罩、濾芯吸嘴。污染的處理酶的滅活（UNG）主要用于滅活產(chǎn)物21樣品典型的正態(tài)分布NegativepopulationPositivepopulationFrequencyofobservations0100110Percentageofmaximumsignal(log)Cut-off樣品典型的正態(tài)分布NegativePositiveFrequ22特異性與值關(guān)系的分析企業(yè)假陽性特異性（%）值金豪萬泰GBI耀華科華麗珠華美新創(chuàng)普生綠科中山理利Murex梅里埃32510327151822114

99.7099.8099.4999.9010099.7099.8099.2998.4899.9099.1997.7798.8899.59-3.985-3.688-3.423-3.364-3.687-2.741-4.337-3.636-2.261-3.060-2.778-1.774-3.551-4.311樣品庫有985份樣品。特異性與其“δ”值相關(guān)性系數(shù)為0.691,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004）

特異性與值關(guān)系的分析企業(yè)假陽性特異性（%）值金豪399.23

d-d+

值的計算以及意義

delta=d/SDcut-offlog10[OD/CO]XX0FrequencyOD/COdatamustbetransformedtolog10valuesbeforetheanalysisd-d+值的計算以及意義24數(shù)值的計算樣品的實際狀態(tài)

+--+檢測結(jié)果

--

ABCD

A+BC+D

A+CB+D靈敏度=A/（A+C);特異性=D/（B+D）陽性預(yù)期值:1)簡單的計算方法即：PPV=A/（A+B）可以給出一個大約的數(shù)值;

2)精確的計算方法即：PPV=流行率×敏感性/｛流行率×敏感性+（1-流行率）×（1-特異性)｝陰性預(yù)期值:1)．簡單的計算方法即：NPV=D/（C+D）可以給出一個大約的數(shù)值

2)．精確的計算方法即：NPV=(1-流行率）×特異性/｛（1-流行率）×特異性+流行率×（1-敏感性)｝

數(shù)值的計算樣品的實際狀態(tài)+AB25精確性(Precision)作用：評價試劑的隨機誤差通過重復(fù)檢測某一或某些特定樣品并分析其一致性，通常以變異系數(shù)或相對標(biāo)準(zhǔn)誤來表示樣品的要求：最好應(yīng)含有高、中、低三類每一類樣品至少檢測4次，實際上檢測10次或10次以上精確性(Precision)作用：評價試劑的隨機誤差26準(zhǔn)確性（accuracy)主要評價試劑的系統(tǒng)誤差，反映樣品的檢測值和真實值的一致性表示方法：偏差（%）=（檢測值-真實值）X100/真實值評價方法：

1.在某一樣品中加上已知量的檢測物重復(fù)檢測，計算檢測值與預(yù)期值的偏差2.檢測已知量的參考品，計算檢測量與標(biāo)化量的偏差準(zhǔn)確性（accuracy)主要評價試劑的系統(tǒng)誤差，反映樣品的27定量范圍定義：能夠給出準(zhǔn)確量值的范圍建立的方法：主要對系列稀釋樣品的反復(fù)檢測制定的定量曲線：線性或非線性要求：對定量范圍的上限和下限樣品進行檢測時，其精確性仍能符合要求定量范圍定義：能夠給出準(zhǔn)確量值的范圍28重復(fù)性（Reproducibility）不同實驗次數(shù)之間（Run-run）不同實驗室之間（Site-site）不同實驗人員之間（Operator-operator）不同時間之間（Day-day）特殊情況下的重復(fù)性重復(fù)性（Reproducibility）不同實驗次數(shù)之間（R29定量試劑的特殊要求樣品所含被測物的量應(yīng)該分散應(yīng)含有在最高和最低檢測限的樣品與參比試劑的檢測結(jié)果計算相關(guān)性，而且要統(tǒng)計兩種檢測結(jié)果的量值有無統(tǒng)計學(xué)差異定量試劑的特殊要求樣品所含被測物的量應(yīng)該分散30謝謝謝謝31體外診斷試劑的臨床研究

體外診斷試劑的臨床研究32體外診斷試劑的種類化學(xué)或生化檢測試劑免疫學(xué)檢測試劑抗原檢測抗體檢測核酸檢測試劑核酸雜交技術(shù)核酸擴增技術(shù)其他試劑體外診斷試劑的種類化學(xué)或生化檢測試劑33核酸擴增技術(shù)目的片段的擴增聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的擴增技術(shù)（TAS）鏈取代的擴增技術(shù)（SDA）探針的擴增連接擴增反應(yīng)（LAR）以FEN-1DNA聚合酶為基礎(chǔ)的擴增循環(huán)探針信號擴增核酸擴增技術(shù)目的片段的擴增34免疫檢測的原理直接法間接法免疫檢測的原理直接法35免疫反應(yīng)中按標(biāo)記物分類同位素標(biāo)記的放射免疫法酶標(biāo)記的酶聯(lián)免疫法生物素標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光法熒光素標(biāo)記時間分辨法其他標(biāo)記物免疫反應(yīng)中按標(biāo)記物分類同位素標(biāo)記的放射免疫法36臨床研究的意義以及目的臨床前樣品雖有代表性，但數(shù)量畢竟有限并不能完全代表臨床情況通過臨床試驗對臨床前制定的各項指標(biāo)進行修正可以發(fā)現(xiàn)或預(yù)測在實際應(yīng)用中遇到的問題，在說明書中提醒用戶注意臨床研究的意義以及目的臨床前樣品雖有代表性，但數(shù)量畢竟有限并37臨床研究的基本要求倫理考慮一般樣品特殊樣品對研究對象保密臨床前研究結(jié)果臨床研究的基本要求倫理考慮38對臨床研究單位以及人員的要求從事相應(yīng)的工作具有相應(yīng)的技術(shù)人員有相應(yīng)的儀器設(shè)備如果試劑對儀器無特殊要求，則應(yīng)選擇不同品牌或不同型號有不同專業(yè)人員參加至少兩家省級單位對實施實驗單位的能力進行評價指綜合能力包括檢測能力、儀器設(shè)備和人員等,主要檢測盲樣，符合要求這方能參與對臨床研究單位以及人員的要求從事相應(yīng)的工作39對照方法或試劑的要求新診斷試劑疾病癥狀以及臨床診斷相關(guān)試劑研究對象的追蹤隨訪疾病的判斷標(biāo)準(zhǔn)已有同類產(chǎn)品的試劑可選擇同類試劑;若評價試劑所用的原料為基因工程產(chǎn)品，應(yīng)用非基因工程原料制備的試劑進行評價；對結(jié)果不一致樣品的處理

對照方法或試劑的要求新診斷試劑40臨床樣品的選擇人群:根據(jù)試劑的適應(yīng)癥選擇不同的人群樣品:應(yīng)為自然人群，尚未用同類試劑進行篩查過選擇不同地區(qū):代表被測物的不同流行率，代表被測物的不同基因型或血清型疾病的時期:樣品的數(shù)量:

臨床樣品的選擇人群:根據(jù)試劑的適應(yīng)癥選擇不同的人群41檢測方法盲法平行檢測結(jié)果不一致樣品的進一步分析檢測方法盲法平行檢測42診斷試劑的臨床評價指標(biāo)

靈敏度（Sensitivity）：在陽性樣品中檢出陽性樣品的百分比特異性（Specificity）：在陰性樣品中檢出陰性樣品的百分比樣品分布(eg.STDEV;)

Suitabilityofcut-off陰性預(yù)期值(NPV)：若樣品沒有反應(yīng)，則不含檢測物的可能性陽性預(yù)期值(PPV)：若樣品有反應(yīng)，則含檢測物體的可能性重復(fù)性（Reproducibility）準(zhǔn)確性（Accuracy)

精確性(Precision）診斷試劑的臨床評價指標(biāo)靈敏度（Sensitivity）：43靈敏度定義：試劑的檢測限度方法：檢測一定數(shù)量的陰性樣品，計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差均值和標(biāo)準(zhǔn)差，臨界值等于均值加上2個標(biāo)準(zhǔn)差意義：在臨界值以上的樣品有95%為真陽性

臨界值的評估：檢測一系列正常人群、非正常人群和特殊人群對臨界值進行核對表示方法：以量值表示（如ng，單位，CFU/ml，PFU/ml，拷貝數(shù)等）；以稀釋度表示靈敏度定義：試劑的檢測限度44影響靈敏度的因素特殊疾病

有一些特殊的病人，其代謝異?？赡苡绊憳?biāo)志物的檢測干擾物質(zhì)或抑制物質(zhì)可以來自與病人（藥物）；也可來自于樣品的處理過程（反復(fù)凍融，溶血等）；或樣品本身存在抑制物等樣品基因型和血清型的影響

有些被測物存在多種基因型或血清型，若原材料沒有廣譜性，則可影響靈敏度試劑的灰區(qū)：

對特殊的試劑要制定灰區(qū)，如FDA要求HCV抗體試劑臨界值以上均為灰區(qū)，對灰區(qū)樣品要加倍重試影響靈敏度的因素特殊疾病45核酸檢測抑制物的作用原理核酸擴增需要酶的參與酶發(fā)揮作用需要輔助因子以及特殊的條件輔助因子與酶的特殊部位物理結(jié)合后發(fā)生反應(yīng)任何結(jié)合輔助因子、改變環(huán)境或阻止酶與輔助因子特異結(jié)合的物質(zhì)均抑制反應(yīng)核酸檢測抑制物的作用原理核酸擴增需要酶的參與46核酸擴增常見的抑制物血紅素及其代謝物影響DNA聚合酶的反應(yīng)，不同來源的DNA聚合酶受影響程度不同痰中的酸性多聚糖或糖蛋白均影響DNA聚合酶的反應(yīng)腦脊液和尿中可能含有抑制物，但具體物質(zhì)不明確糞便中的膽汁鹽是PCR反應(yīng)的強抑制劑肝素可與DNA聚合酶結(jié)合，對不同的酶抑制程度不同核酸提取試劑中的某些物質(zhì)具有抑制作用：EDTA，SDS，鹽酸胍等核酸擴增常見的抑制物血紅素及其代謝物影響DNA聚合酶的反應(yīng)，47內(nèi)標(biāo)的種類未修飾性的內(nèi)標(biāo)異源性內(nèi)標(biāo)修飾性的內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)的種類未修飾性的內(nèi)標(biāo)48特異性定義：主要指假陽性的檢出情況評價方法：主要是通過檢測部分樣品，或特殊樣品尤其是性質(zhì)相近的標(biāo)志物（如不同基因型或血清型樣品），分析出現(xiàn)假陽性的情況；而且分析時要注意在不同量時的特異性特異性定義：主要指假陽性的檢出情況49造成非特異性的因素原料：主要純度不夠，原料本身存在非特異反應(yīng)物質(zhì)反應(yīng)模式：如孵育時間縮短非特異反應(yīng)可提高3-4倍，非常短時可高達10倍樣品中的干擾物質(zhì)：病人本身：如自身免疫性疾病（高免疫球蛋白血癥等），黃疸類、溶血類和高脂類病人病人使用特殊藥物樣品處理過程：如不同抗凝劑，不同試管，某些化學(xué)或去污劑以及樣品反復(fù)凍融等因素造成非特異性的因素原料：主要純度不夠，原料本身存在非特異反應(yīng)50核酸檢測中造成非特異性的因素交叉反應(yīng)：主要是引物序列與被測物中序列存在一定程度的同源性樣品之間的污染：氣溶膠中含有目的微生物，對照的污染等擴增產(chǎn)物的污染：擴增產(chǎn)物聚集在器皿、臺面、設(shè)備以及通風(fēng)設(shè)施上等造成污染核酸檢測中造成非特異性的因素交叉反應(yīng)：主要是引物序列與被測物51污染的處理酶的滅活（UNG）主要用于滅活產(chǎn)物光化學(xué)處理用可溶性psoralen的衍生物處理，在用長紫外照射即可滅活產(chǎn)物、也可減少樣品的污染化學(xué)處理方法用于表面的處理

10%次氯酸鈉紫外照射物理的:

專用移液器、一次性試管架、紫外燈、PCR工作罩、濾芯吸嘴。污染的處理酶的滅活（UNG）主要用于滅活產(chǎn)物52樣品典型的正態(tài)分布NegativepopulationPositivepopulationFrequencyofobservations0100110Percentageofmaximumsignal(log)Cut-off樣品典型的正態(tài)分布NegativePositiveFrequ53特異性與值關(guān)系的分析企業(yè)假陽性特異性（%）值金豪萬泰GBI耀華科華麗珠華美新創(chuàng)普生綠科中山理利Murex梅里埃32510327151822114

99.7099.8099.4999.9010099.7099.8099.2998.4899.9099.1997.7798.8899.59-3.985-3.688-3.423-3.364-3.687-2.741-4.337-3.636-2.261-3.060-2.778-1.774-3.551-4.311樣品庫有985份樣品。特異性與其“δ”值相關(guān)性系數(shù)為0.691,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004）

特異性與值關(guān)系的分析企業(yè)假陽性特異性（%）值金豪399.54

d-d+

值的計算以及意義

delta=d/SDcut-offlog10[OD/CO]XX0FrequencyOD/COdatamustbetransformedtolog10valuesbeforetheanalysisd-d+值的計算以及意義55數(shù)值的計算樣品的實際狀態(tài)

+--+檢測結(jié)果

--

ABCD

A+BC+D

A+CB+D靈敏度=A/（A+C);特異性=D/（B+D）陽性預(yù)期值:1)簡單的計算方法即：PPV=A/（A+B）可以給出一個大約的數(shù)值;

2)精確的計算方法即：PPV=流行率×敏感性/｛流行率×敏感性+（1-流行率）