白喉疫苗工藝流程菌種課件

細菌性疫苗楊麗華2011年3月細菌性疫苗楊麗華1.死疫苗2.活疫苗

3.蛋白類疫苗4.多糖類疫苗

5.多糖蛋白結合疫苗

細菌性疫苗國藥長春所1.死疫苗2.活疫苗3.蛋白類疫苗4.多糖類疫苗細菌性疫苗種類23白喉破傷風百日咳疫苗……451霍亂傷寒副傷寒百日咳疫苗……卡介苗鼠疫布氏桿菌傷寒痢疾霍亂疫苗……腦膜炎傷寒vi肺炎流感嗜血桿菌多糖疫苗……AC腦膜炎球菌多糖結合疫苗HIB……腦膜炎傷寒vi流感嗜血桿菌多糖疫苗……國藥長春所細菌性疫苗種類23白喉451霍亂卡介苗腦膜炎AC腦膜炎球菌多百日咳疫苗

傷寒疫苗結合疫苗

白喉疫苗國藥長春所百日咳疫苗傷寒疫苗結合疫苗白喉疫苗國藥長春所白喉疫苗一、白喉概述二、病原學三、白喉桿菌的致病力及毒素產生的遺傳學四、白喉毒素五、白喉類毒素六、生產工藝七、類毒素的質量檢定國藥長春所白喉疫苗一、白喉概述國藥長春所外毒素對神經系統(tǒng)損害細菌產生的外毒素對心肌損害外毒素對腎臟損害白喉曾經是對兒童威脅非常大的傳染病。它是由白喉棒狀桿菌引起的一種呼吸道傳染病主要臨床表現(xiàn)為上呼吸道發(fā)炎，常常表現(xiàn)在咽部，有時在鼻腔、喉部和氣管，白喉疫苗國藥長春所外毒素細菌產生外毒素白喉曾經是對兒童威脅非常大的傳染病。主要白喉流行特點1.傳染原：白喉桿菌是嚴格寄生于人類的細菌沒有中間宿主，病人及帶菌者是唯一的傳染原。2.傳播途徑：主要是呼吸道飛沫傳播，也可通過被污的器具和食物傳播。3.易感人群：人對白喉普遍易感，新生兒1歲時白喉易感性達高峰。國藥長春所白喉流行特點1.傳染原：白喉桿菌是嚴格寄生于人類的細菌國二、病原學1.細菌形態(tài)

白喉棒狀桿菌菌體一端或兩端膨大呈棒狀，有著色較深的異染顆粒，革蘭氏染色陽性，白喉桿菌無動力，無莢膜，不形成芽孢。國藥長春所二、病原學1.細菌形態(tài)國藥長春所白喉棒狀桿菌顯微鏡下形態(tài)國藥長春所白喉棒狀桿菌顯微鏡下形態(tài)國藥長春所國藥長春所白喉棒狀桿菌顯微鏡下形態(tài)國藥長春所白喉棒狀桿菌顯微鏡下形態(tài)2.培養(yǎng)特性白喉桿菌是需氧菌，最適溫度為34～35℃。能分解葡萄糖、麥芽糖和糊精，產酸不產氣，能還原硝酸鹽，不產生吲哚，不消化蛋白。3.抵抗力⑴.白喉桿菌對抗生素有不同程度敏感，對青霉素和紅霉素極敏感。⑵.對消毒劑抵抗力弱，3％苯酚10min可將該菌殺死⑶.不耐熱，58℃10mi或100℃1min即可被殺死。國藥長春所二、病原學2.培養(yǎng)特性國藥長春所二、病原學三、白喉桿菌的致病力及毒素產生遺傳學1.致病力自然界中動物不感染白喉，只能在敏感動物中造成人工感染。猴、馬、家兔和豚鼠對白喉敏感實驗室常用的動物是家兔、豚鼠和NIH小鼠。2.毒素產生遺傳學白喉是由白喉桿菌產生毒性很強的外毒素引起的。白喉桿菌的產毒基因是由β嗜菌體攜帶。β嗜菌體感染無毒白喉桿菌后嗜菌體DNA與細菌DNA整合，形成溶原性白喉桿菌而獲得產毒能力（PW8株目前用于白喉類毒素生產)。國藥長春所三、白喉桿菌的致病力及毒素產生遺傳學1.致病力國藥長春所四、白喉毒素1.白喉外毒素為棒狀桿菌β-噬菌體tox基因表達產物,可與細胞表面的特異性受體結合,干擾蛋白質的合成，對人和動物都引起致死性毒性，如心臟、腎上腺、肝、腎、胰及神經組織等均受到損害。2.白喉毒素是單一多肽，由560個氨基酸組成，分子量為62kDa,等電點pH4.1，在pH6時加熱55℃很快失活。3.通過物理和化學方法將其純化。國藥長春所四、白喉毒素1.白喉外毒素為棒狀桿菌β-噬菌體tox基因表達細菌毒素甲醛類毒素毒素經甲醛處理后去除毒性而保留免疫原性五、白喉類毒素國藥長春所細甲醛類毒素毒素經甲醛處理后去除毒性五、白喉類毒素國藥長春甲醛濃度溫度PH脫毒影響脫毒因素國藥長春所甲醛溫度PH脫毒影響脫毒因素國藥長春所溫度、pH和甲醛濃度等均影響脫毒效果１.溫度越高脫毒越快，超過40℃影響抗原性，一般37～38℃。２.在酸性時脫毒較慢，但游離甲醛含量高，在保存過程中由于甲醛的繼續(xù)作用，可導致脫毒過甚，并影響毒素的穩(wěn)定性；在堿性時脫毒快，但抗原性損失較大，一般采用弱堿性。３.甲醛濃度大則脫毒快，但抗原損失大。國藥長春所溫度、pH和甲醛濃度等均影響脫毒效果國藥長春所溫度升高游離甲醛的濃度低毒素純度高易發(fā)生毒性逆轉提高甲醛濃度、脫毒pH、脫毒溫度和延長脫毒時間；增加非蛋白氮含量（于精制毒素中加入賴氨酸、精氨酸等）防止或減輕毒性逆轉類毒素的毒性逆轉國藥長春所易發(fā)生毒性逆轉提高甲醛濃度、脫毒pH、防止或減輕毒性逆轉類毒六、白喉疫苗工藝流程

菌種（PW8株）

傳代擴增3～4代

發(fā)酵罐培養(yǎng)34～35℃培養(yǎng)對數(shù)生長末期收獲，甲苯殺菌。離心去菌體收集清液超濾濃縮

硫酸銨兩段鹽析除鹽除菌氨離子及無菌檢查脫毒甲醛液37℃脫毒試驗（家兔）原液檢定（濃度、純度、安全等）

Al(OH)3吸附

成品檢定（安全、效價等）國藥長春所六、白喉疫苗工藝流程七、類毒素的質量檢定1絮狀單位（Lf）

是毒素或類毒素與抗毒素的結合單位，只能代表“量”而不能完全代表活性。使用抗毒素絮狀單位標準品來測定類毒素的絮狀單位。

絮狀單位測定

毒素或類毒素與相應抗毒素在適當?shù)暮俊⒈壤?、溫度反應時間等條件下可在試管中發(fā)生抗原抗體結合，產生肉眼可見的絮狀凝集反應，根據(jù)抗毒素絮狀單位標準品可測定類毒素的絮狀單位（Lf）值。2純度：≥1500Lf/mgPN3安全性試驗（豚鼠）國藥長春所七、類毒素的質量檢定1絮狀單位（Lf）國藥長春所七、類毒素的質量檢定4效價測定

類毒素刺激機體產生特異性抗體的免疫應答和對相應抗體的特異性結合反應。⑴小鼠Vero細胞法將標準和待檢類毒素2倍稀釋3～5個稀釋度，皮下免疫NIH小鼠8只（0.5ml/只)，免疫5周采血，根據(jù)vero細胞生長情況，以標準品的效價為標準，用平行線分析法進行結果計算。⑵豚鼠毒素攻擊法皮下免疫豚鼠10只（1ml/只），免疫4周后用毒素攻擊，觀察5天根據(jù)存活率以標準品的效價為標準，用平行線分析法進行結果計算。國藥長春所七、類毒素的質量檢定4效價測定國藥長春所百日咳疫苗一、百日咳概述二、病原學三、百日咳疫苗發(fā)展簡史四、無細胞百日咳疫苗㈠、生產工藝流程㈡、質量檢定㈢、APV的效果㈣、接種不良反應國藥長春所百日咳疫苗一、百日咳概述國藥長春所急性腦炎、嘔吐、痙攣和昏迷，死亡或腦損傷并發(fā)癥肺炎形成肺氣腫肺不張，甚至死亡。營養(yǎng)缺乏癥百日咳是對兒童威脅非常大的傳染病，它是由百日咳桿菌引起的一種呼吸道傳染病。典型癥狀為突然陣發(fā)性痙咳，并帶有吸氣性尾聲或伴有嘔吐，可持續(xù)數(shù)月。百日咳概述國藥長春所急性腦炎、嘔吐、痙攣和昏迷，死亡或腦損傷并發(fā)癥肺炎營養(yǎng)缺百日百日咳流行特點1.傳染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳病人是傳染原。2.傳播途徑：主要是呼吸道飛沫傳播，也可通過被污的器具和食物傳播。3.易感人群：主要傳染對象是6歲以下兒童，1歲以內嬰幼兒發(fā)病率50%。國藥長春所百日咳流行特點1.傳染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳二、病原學㈠細菌形態(tài)百日咳菌呈革蘭氏染色陰性，短桿狀或橢圓形國藥長春所二、病原學㈠細菌形態(tài)國藥長春所㈡生長特性1.百日咳菌可分四種相變，Ⅰ相菌毒力最強有免疫原性；Ⅳ相菌毒力消失，無免疫原性；ⅡⅢ相菌介于Ⅰ

Ⅳ相之間。2.百日咳菌是需氧菌，最適溫度為35～36℃,最適pH6.8-7.0。3.不發(fā)酵任何糖類、不分解糊精，尿素鹽，不液化明膠不產生吲哚，不利用枸櫞酸鹽。國藥長春所㈡生長特性1.百日咳菌可分四種相變，Ⅰ相菌毒力最強有免國作用PTFHAAggsPRNACTCTHLT呼吸道粘附作用＋＋＋＋－＋－--細胞毒性＋＋－－＋＋＋＋＋免疫原性＋＋＋＋＋＋＋--1百日咳Ⅰ相菌有兩大類抗原菌體O抗原表面K抗原（莢膜物質）2百日咳菌可產生外毒素(PT)內毒素其他生物活性物質，據(jù)報道有25種之多。㈡、主要抗原和生物學活性作用PTFHAAggsPRNACTCTHL百日咳菌粘附在上呼吸道上皮細胞纖毛上繁殖↑↓重患

(FHAPTPRNAgg)下呼吸道上皮細胞纖毛上繁殖↓細菌不進入組織和血液循環(huán)

①干擾吞噬細胞功能AC分泌大量PT②麻痹上皮細胞功能TCT①產生血細胞增多③損傷支氣管血管周HLT細胞代謝發(fā)生變化②組織胺致敏性增強圍組織③分泌胰島素增強和血糖降低.

㈢、致病機理國藥長春所百日咳菌粘附在上呼吸道上皮細胞纖毛上繁殖㈢、致病機三、百日咳疫苗發(fā)展簡史㈠粗制百日咳滅活疫苗

第一次世界大戰(zhàn)時期，在對病原菌的生物學構造及其與致病機理間的關系缺乏認識的前提下，憑經驗制造的滅活疫苗，工藝粗造、含量不確定。㈡全菌體百日咳疫苗(WPV)

以標準化方式生產的，制造疫苗的菌株必須含有123型凝集原（Agg1、Agg2、Agg3）。經過50多年的臨床應用證明該疫苗的免疫效果是肯定的，但接種后的不良反應問題一直未解決。㈢無細胞百日咳疫苗(APV)

20世紀80年代初期，對百日咳菌的成分及其所引起生物學作用的認識，產生了APV。㈣基因工程疫苗正在研究中。國藥長春所三、百日咳疫苗發(fā)展簡史㈠粗制百日咳滅活疫苗國藥長春所四、無細胞百日咳疫苗1981年日本的佐藤教授等人在純化出PT和FHA兩種抗原的基礎上，在世界上第一次研制成功了含有兩種抗原成分的無細胞百日咳疫苗，并且與白喉和破傷風類毒素聯(lián)合制成無細胞百白破聯(lián)合疫苗。該疫苗在日本開始正式使用，目前日本已經全部取代了菌體百白破疫苗。1992年美國正式批準使用日本生產的無細胞百日咳疫苗。美國獲得生產許可證的APV還含有Agg2和PRN。目前WHO已經將其作為兒童預防免疫推薦用疫苗。我國是于80年代中期開始研制無細胞百白破聯(lián)合疫苗，90年代中期獲得正式生產文號。近期的臨床試驗證明含有5種保護性抗原（PTFHAPRNAgg2

Agg3）的APV效果最佳。國藥長春所四、無細胞百日咳疫苗1981年日本的佐藤教授等人在純化出PT

凍干百日咳菌種（Ⅰ相CS菌株）↓接種血培養(yǎng)基大管培養(yǎng)↓36℃48-72小時培養(yǎng)傳代接種發(fā)酵罐培養(yǎng)（綜合培養(yǎng)基）↓培養(yǎng)≤48小時收集培養(yǎng)物↓第一段硫酸銨鹽析及浸提↓第二段硫酸銨鹽析及浸提↓透析↓密度梯度離心↓戊二醛脫毒↓透析↓超聲↓無細胞百日咳原液㈠、生產工藝流程國藥長春所

檢測項目標準蛋白含量——抗原純度測定PT和FHA不低于總蛋白質含量的85%熱原測定符合規(guī)定毒性試驗小鼠體重減輕試驗不高于10BWDU/ml小鼠白細胞增多試驗不高于0.5PLU/ml小鼠組胺致敏試驗不高于0.8HSU/ml毒性逆轉試驗不高于0.8HSU/ml效價測定（腦腔保護力試驗）不低于4.0IU/劑量㈡、質量檢定國藥長春所檢測項目標準蛋白含量——日本和中國的APV和DTPa按以上主要檢定項目進行質量控制。美國、歐洲一些國家及WHO推薦的毒性和效價測定方法等與之不同。毒性試驗僅要求做HST，效價測定采用ELISA法檢測疫苗注射小鼠后百日咳抗體應答水平。用小鼠腦腔保護力試驗（MPT）評價疫苗效果，WPV的效價明顯高于APV，而且并非所有的APV均可通過MPT試驗。因此還沒有令人滿意的針對APV疫苗的效價試驗方法。免疫原性試驗在衡量制品的一致性方面是有用的，但與臨床保護之間還缺乏相關性。國藥長春所效價測定方法探討日本和中國的APV和DTPa按以上主要檢定項目進行質量國藥接種種類免疫人數(shù)病例數(shù)發(fā)病率（%）報道時間WPV56814.31983APV36411.3_584882.8APV30310.01988_423780.0APV2613.81988_271762.9APV6223.21990_373081.0表明APV的保護效果是肯定的，能夠達到WPA的保護水平。㈢、APV的效果國藥長春所接種種類免疫人數(shù)病例數(shù)發(fā)病率（%）報道時間WPV56814.疫苗種類發(fā)熱(%)持續(xù)性喊(%)紅暈(%)腫脹(%)疼痛(%)APV0.8-2.84.5-9.01.4-5.51.2-5.51.4-4.8WPV6.620.59.515.420.8表明APV的不良反應明顯低于WPV。㈣、接種不良反應國藥長春所疫苗種類發(fā)熱持續(xù)性喊紅暈腫脹疼痛APV0.8-2.84.5-傷寒疫苗一、概述二、病原學三、傷寒疫發(fā)展簡史四、傷寒Vi疫苗國藥長春所傷寒疫苗一、概述國藥長春所1.傷寒病是一種急性全身性感染，感染網(wǎng)狀內皮細胞系統(tǒng)，腸道淋巴組織及膽囊，病原是傷寒沙門氏菌。2.傳播途徑是食入被污染的食物或水源。3.學齡兒童發(fā)病率最高，兩歲以下兒童和35歲以上成人發(fā)病率低。一、概述國藥長春所1.傷寒病是一種急性全身性感染，感染網(wǎng)狀內皮細胞系統(tǒng)，腸道淋1潛伏期為7～21天病期為一個月，恢復緩慢。3表情遲鈍脈搏相對緩慢，肝脾腫大和白細胞減少。2長期發(fā)熱、持續(xù)高燒達10～14天、腹部不適、頭痛等。2長期發(fā)熱、持續(xù)高燒達10～14天、腹部不適、頭痛等。典型的臨床癥狀國藥長春所1潛伏期為3表情遲鈍2長期發(fā)熱、2長期發(fā)熱、典型的臨床癥狀二、病原學1.細菌形態(tài)傷寒沙門氏菌是革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，能運動。國藥長春所二、病原學1.細菌形態(tài)國藥長春所傷寒沙門氏菌革蘭染色國藥長春所傷寒沙門氏菌革蘭染色國藥長春所傷寒沙門氏菌電鏡形態(tài)國藥長春所傷寒沙門氏菌電鏡形態(tài)國藥長春所2.培養(yǎng)特性在肉湯瓊脂、馬丁瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基上以易生長，需氧，適宜溫度35-37℃，適宜的pH為7.0～7.2。發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇均產酸不產氣；不發(fā)酵乳糖、蔗糖；氧化酶試驗陰性。2.培養(yǎng)特性1.鞭毛（H）抗原：為蛋白質，煮沸破壞，不受（1％）甲醛影響。2.菌體（O）抗原：細胞壁部份，耐熱，為脂多糖（LPS）－由多糖（重復寡糖和核心寡糖）和類脂A組成。3.莢膜（Vi）抗原:即莢膜多糖（CPS）,是傷寒桿菌細胞外壁的一種莢膜抗原,Vi抗原與其致病性有關

Vi來源于毒力的縮寫?？乖Y構國藥長春所1.鞭毛（H）抗原：為蛋白質，煮沸破壞，不受抗原結構國血清學診斷

1.肥達氏試驗（widaltest）選擇抗原的方法：⑴.測定O抗體用傷寒0901株（沒有H和Vi抗原）

用加熱殺菌破壞H抗原（不耐熱）

⑵.測定H抗體用傷寒S株（沒有O菌體抗原）

用甲醛處理傷寒沙門氏菌破壞O抗原

2.酶聯(lián)免疫試驗國藥長春所血清學診斷1.肥達氏試驗（widaltest）國藥1234全菌體滅活疫苗口服Ty21a減毒活疫苗傷寒Vi多糖疫苗傷寒結合疫苗二、傷寒疫苗的發(fā)展簡史國藥長春所1234全菌口服傷寒傷寒二、傷寒疫苗的發(fā)展簡史國藥長春所1甲醛殺菌石碳酸防腐疫苗2.加熱殺菌石碳酸防腐疫苗3.丙酮殺菌疫苗㈠、全菌體滅活疫苗國藥長春所1甲醛殺菌石碳酸防腐疫苗2.加熱殺菌石碳酸防腐疫苗3.丙酮殺甲醛殺菌石碳酸防腐疫苗50年代初期學自前蘇聯(lián)，為傷寒、副傷寒甲乙三聯(lián)疫苗。用１％甲醛殺菌，0.5％石炭酸生理鹽水制成。每毫升含傷寒沙門氏菌體原為1０億-５億；副傷寒甲乙由每毫升各５億-２.5億，細菌總量原三聯(lián)疫苗為20億-10億。國藥長春所甲醛殺菌石碳酸防腐疫苗50年代初期學自前蘇聯(lián)，為傷寒、加熱殺菌石碳酸防腐疫苗此法歷史最久，1896年首創(chuàng)的傷寒疫苗即為此法制成，只用56℃水浴30ｍin殺菌加石碳酸防腐制成。美國仍用此法制作標準品。國藥長春所加熱殺菌石碳酸防腐疫苗此法歷史最久，1896年首創(chuàng)的傷丙酮殺菌疫苗1921年創(chuàng)制，認為對穩(wěn)定Vi抗原有益，系將一份菌液加三份丙酮處理，然后抽氣干燥制成。1943年首次在意大利使用，經世界衛(wèi)生組織做現(xiàn)場考核，認為效果最好。國藥長春所丙酮殺菌疫苗1921年創(chuàng)制，認為對穩(wěn)定Vi抗原有益，系觀察組觀察人數(shù)中強反應百分率(%)第一組1408856.05第二組131315111.50合計27212368.75傷寒、副傷寒甲乙三聯(lián)疫苗接種反應

實踐證明，菌體疫苗預防傷寒效果肯定的，但接種后的嚴重反應一直困擾著人們。國藥長春所觀察組觀察人數(shù)中強反應百分率(%)第一組1408856.05㈡、口服Ty21a疫苗

70年代末期研究成功的口服傷寒疫苗Ty21a活疫苗，是以Ty21傷寒毒株作為出發(fā)株，用亞硝基胍誘變所得的突變株。國藥長春所㈡、口服Ty21a疫苗70年代末期研究成功的口服傷寒疫口服Ty21a疫苗的特點1.減毒活疫苗此突變株缺少尿苷二磷酸半乳糖-4-異構酶半乳糖激酶和半乳糖1-磷酸尿苷酰轉移酶的活性降低約80％。且沒有Vi抗原。所以其毒力減低，但此突變株有完整的O抗原LPS，并具有免疫原性，能誘導較好的免疫保護性反應。2.經過多年觀察證明有效，反應也較輕。一些國家批準應用。國藥長春所口服Ty21a疫苗的特點1.減毒活疫苗國藥長春所口服Ty21a疫苗的特點3.Ty21a菌株營養(yǎng)要求苛刻，生長緩慢，產量很低，不易批量生產。4.目前無可靠的檢定指標。5.基因背景不夠清楚，因為它是用強誘變劑處理而得，作為活疫苗這是它的最大的弱點。國藥長春所口服Ty21a疫苗的特點3.Ty21a菌株營養(yǎng)要求苛刻，生長地區(qū)疫苗制劑效果效果比較埃及液體＋NaHco3

96%智利腸溶衣膠囊／明膠囊66％ECC、19％明膠ECC＞明膠智利液體／膠囊35%ECC、76%液體液體＞ECC印尼液體／膠囊42%ECC、53%液體液體＞ECC口服Ty21a減毒活疫苗的免疫效果

國藥長春所地區(qū)疫苗制劑效果效果比較埃及液體＋NaHco396%智利腸㈢、傷寒Vi多糖疫苗1.傷寒Vi多糖疫苗的概述2.傷寒Vi多糖疫苗的免疫效果3.傷寒Vi多糖疫苗不良反應觀察結果4.傷寒Vi多糖疫苗的制造工藝5.傷寒Vi多糖疫苗的特點國藥長春所㈢、傷寒Vi多糖疫苗1.傷寒Vi多糖疫苗的概述國藥長春所傷寒Vi多糖疫苗概述由于Vi抗原是一種表面抗原，是由C3位乙?；腘-乙酰-D-半乳糖醛酸（1－4）連接的同聚體。在美國NIH的Robbins等重新認識傷寒Vi抗原的免疫原性后，并受流腦多糖疫苗的啟發(fā)，用與之類似的方法提取Vi抗原，以不傷害其抗原結構，保持它的免疫原性，制備了傷寒Vi多糖疫苗。國藥長春所傷寒Vi多糖疫苗概述由于Vi抗原是一種表面抗原，是由C3位乙傷寒Vi多糖疫苗概述早期提取Vi抗原時為了降低LPS的含量，采取1mol/L乙酸100℃處理24h，使O-乙?；蚇-乙?；撀湓斐蒝i抗原結構變化，導致其免疫原性發(fā)生變化。新方法是用十六烷基三甲基溴化銨處理傷寒沙門氏菌，所得Vi抗原可以保留O-乙酰基和N-乙?；蛊洳蛔冃?。國藥長春所傷寒Vi多糖疫苗概述早期提取Vi抗原時為了降低LPS的含量觀察地區(qū)疫苗人數(shù)觀察時間（月）保護率（％）尼泊爾傷寒Vi3457（5～44歲）1772南非傷寒Vi5692（5～16歲）2164傷寒Vi多糖疫苗的免疫效果國藥長春所觀察疫苗人數(shù)觀察保護率（％）尼泊爾傷寒Vi34571772疫苗局部反應發(fā)熱率(%)疼痛紅腫硬結流腦A+C多糖（50μg/人）N=12989（69％）23（18％）21（16％）2（2％）傷寒Vi（25μg/人）N=12778（61％）10（8％）2（2％）1（1％）傷寒Vi（50μg/人）N=12686（68％）9（7％)9（7％）0傷寒Vi多糖疫苗不良反應觀察結果國藥長春所局部反應發(fā)熱率疼痛紅腫硬結流腦A+C多糖8923212

（Ty2株）

細菌培養(yǎng)生物反應液體培養(yǎng)（8～10h）對數(shù)生長期末收獲,甲醛液滅活離心去菌體，收上清液濃縮多糖上清加10%十六烷基三甲基溴化銨離心收集沉淀，加氯化鈣溶液振蕩解離除去核酸加95%乙醇至25%濃度收集上清上清中加95%乙醇至80%濃度沉淀粗制多糖，抽干除去蛋白加1：10飽和中性醋酸鈉溶液溶解多糖按1：2加冷酚提取3次，離心收集上清液并透析沉淀多糖透析液加95%乙醇至80%沉淀多糖用無水乙醇和丙酮各洗3次原液注射用水溶解多糖并除菌注射用水稀釋分裝成品傷寒Vi莢膜多糖疫苗工藝流程國藥長春所（Ty2株）傷檢定項目檢定指標固總測定％蛋白含量＜10mg/g核酸含量＜20mg/gO－乙?；俊?mmol/gKd值≤0.25Kd值＜0.25回收率＞50%熱原檢查0.025μg/kg傷寒Vi多糖疫苗檢定項目及檢定指標國藥長春所檢定項目檢定指標固總測定％蛋白含量＜10mg/g核酸含量＜2傷寒Vi多糖疫苗的特點安全有效副反應較菌體疫苗輕，但卻有其大致相同的免疫效果。穩(wěn)定性好即可以為液體制劑，也可以為凍干制品，耐熱，易于運輸與保存。使用方便注射一針，即可以有一定的保護力，易于用理化方法標準化。同其他多糖疫苗一樣對嬰幼兒免疫效果差。國藥長春所傷寒Vi多糖疫苗的特點安全有效副反應較菌體疫苗輕，但卻結合疫苗一、結合疫苗的特點二、免疫機理三、用于制備結合疫苗的多糖抗原四、用于制備結合疫苗的蛋白載體五、結合化學制備結合疫苗的主要要素六、結合疫苗應具備的兩個共同特征七、結合疫苗的使用和發(fā)展現(xiàn)狀八、結合疫苗的研究方向九、存在問題國藥長春所結合疫苗一、結合疫苗的特點國藥長春所一、結合疫苗的特點1.抗原物質（多糖和蛋白質）經化學共價結合形成了具有一定空間構象的結合物。抗原物質還包括多肽、甾族激素、脂肪胺、核苷等小分子物質。2.它能使多糖抗原的T細胞非依賴性轉化為T細胞依賴性,產生具有記憶特征的IgG抗體,提高多糖疫苗的免疫原性和免疫持久性。3.能夠在嬰兒產生免疫應答。國藥長春所一、結合疫苗的特點1.抗原物質（多糖和蛋白質）經化學共價結合二、免疫機理1.胸腺非依賴性抗原（TI-Ag）2.胸腺依賴性抗原（TD-Ag）國藥長春所二、免疫機理1.胸腺非依賴性抗原（TI-Ag）國藥長春所胸腺非依賴性抗原（TI-Ag）細菌脂多糖、莢膜多糖等。TI-Ag分子結構呈長鏈，O-乙?；⒈；⑻擒真I和磷酸脂鍵等抗原表位重復排列而成簇，對每種表位來將可視為多價的，能與B細胞表面受體結合形成“帽狀現(xiàn)象”?？蓡为氂|發(fā)B細胞產生抗體，不需T輔助性細胞輔助。與TI-Ag發(fā)生應答的是B細胞的抗原識別受體IgM（B細胞成熟的標志），產生的抗體僅為IgM,且抗體效價低、無Ig類型轉換。不誘導細胞免疫應答，也不引起免疫記，即使再次采用相同抗原刺激也不能引起初次免疫應答，更無抗體親和力成熟過程。國藥長春所胸腺非依賴性抗原（TI-Ag）細菌脂多糖、莢膜多糖等。國藥TI－AgBIgM無記憶B細胞（Bm）形成，不產生加強應答，因而免疫原性弱。B細胞對（TI-Ag）應答特點國藥長春所TI－AgBIgM無記憶B細胞（Bm）形成，不產生加強應答胸腺依賴性抗原（TD-Ag）絕大多數(shù)天然抗原（蛋白質）都是TD-Ag。TD-Ag分子量大，結構復雜，表位種類多且不均勻(就每種表位而言它是單價的)。此類抗原含有T細胞和B細胞決定簇，蛋白質通過單價表位的相互作用與B細胞表面IgM受體結合，但不誘導“帽狀現(xiàn)象”，不足以激活B細胞,但被B細胞胞飲、水解后肽表位與T細胞受體結合誘導TH細胞產生細胞因子。TD-Ag需TH細胞產生細胞因子并激活B2細胞產生抗體,漿細胞在產生抗體中發(fā)生Ig類型轉換，合成IgG和IgM類抗體。形成記憶Bm細胞，當受到相同抗原再次刺激時引起再次應答，而且抗體親和力較初次應答明顯提高。誘導體液免疫應答，同時誘導細胞免疫應答。國藥長春所胸腺依賴性抗原（TD-Ag）絕大多數(shù)天然抗原（蛋白質）都是TTD-AgIgGIgMTH細胞細胞因子B2Bm停止分化記憶B細胞（Bm）形成，產生加強應答，增強免疫原性。B細胞對（TD-Ag）應答特點國藥長春所TD-AgIgGTH細胞細胞因子B2Bm停止分化記憶B細胞（多糖—蛋白質結合物（TD-Ag）將多糖分子與蛋白質共價結合，由于蛋白質抗原激活TH細胞，能誘導TH細胞產生細胞因子（如r-IFN,IL-2、4、5）并傳遞給B2細胞，使之參與免疫應答。TD-Ag應答存在著TH-B2細胞間的協(xié)作作用國藥長春所多糖—蛋白質結合物（TD-Ag）將多糖分子與蛋白質共價結合，多糖—蛋白質結合物（TD-Ag）多糖蛋白質結合疫苗免疫優(yōu)勢:1.有TH細胞參與，刺激機體產生的抗體主要有IgG和少量IgM，能產生細胞免疫和加強免疫應答，免疫原性強。2.免疫接種范圍廣，對所有年齡組人群均能提供免疫保護。國藥長春所多糖—蛋白質結合物（TD-Ag）多糖蛋白質結合疫苗免疫優(yōu)抗體生成的輔助細胞專一地識別載體決定簇

TH細胞

B2細胞是產生抗體的效應細胞專一地識別多糖（半抗原）表面抗原識別受體為IgG和IgM產生IgG和IgM。分化增殖過程中有少量B細胞停止分化變成記憶Bm細胞出現(xiàn)加強應答免疫原性大大提高細胞因子TD-AgTD-Ag應答存在著TH-B2細胞間的協(xié)作作用國藥長春所抗體生成的輔TH細胞B2細胞是產生抗體的效應細胞細胞因子一類是細菌的莢膜多糖（CPS）A/C群腦膜炎球菌肺炎鏈球菌b型流感嗜血桿菌（Hib）和傷寒桿菌結合疫苗在動物和人體中均證實了其安全性和增強的免疫原性。三、用于制備結合疫苗的多糖抗原國藥長春所一類是細菌的莢膜A/C群腦膜炎球菌肺炎鏈球菌b型流感嗜血桿菌另一類為菌體多糖（OPS）脂多糖（LPS）中的O特異性多糖（O-PS）脂寡糖（LOS）中的寡糖（OS）結合疫苗純化的O-PS和OS沒有免疫原性，與蛋白載體制備結合疫苗后可獲得免疫原性?？筄-PS的IgG具有型特異性保護，抗OS抗體具有殺菌活性及免疫保護作用。三、用于制備結合疫苗的多糖抗原國藥長春所另一類為菌體多糖脂多糖（LPS）中脂寡糖（LOS）結合疫苗純四、用于制備結合疫苗的蛋白載體1.細菌的分泌性毒素（去除毒性）

破傷風類毒素（TT）白喉類毒素（DT）及無毒CRM197百日咳毒素（PT）及無毒CRM3201霍亂腸毒素（CT）及其B亞單（CTB）無毒的重組綠膿桿菌外毒素（rEPA）大腸桿菌熱敏感腸毒素（HLT）2.細菌菌毛

綠膿桿菌菌毛（PAP）淋球菌P-3-2菌毛國藥長春所四、用于制備結合疫苗的蛋白載體1.細菌的分泌性毒素（去除毒性四、用于制備結合疫苗的蛋白載體3.細菌外膜蛋白

B群腦膜炎球菌外膜蛋白（OMP）4.病原蛋白質如乙肝表面抗原（HｂsAg）5.B群腦膜炎球菌外膜蛋白（OMP）6.傷寒桿菌鞭毛和肺炎球菌溶血素（PLY）也是很有潛力的結合蛋白。7.人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚賴氨酸

國藥長春所四、用于制備結合疫苗的蛋白載體3.細菌外膜蛋白國藥長春所1.多糖抗原的選擇細菌的保護性抗原莢膜多糖（CPS）菌體多糖（OPS）2.多糖分子大小選擇天然多糖經降解后的寡多糖。五、結合化學制備結合疫苗的要素國藥長春所1.多糖抗原的選擇五、結合化學制備結合疫苗的要素國藥長春所3.載體蛋白的選擇破傷風類毒素（TT）白喉類毒素（DT）4.多糖和蛋白質活性功能基團天然的修飾的5.結合模式五、結合化學制備結合疫苗的要素國藥長春所3.載體蛋白的選擇破傷風類毒素（TT）五、結合化學制備結功能團蛋白質多糖一類功能團（多糖或蛋白質原有功能團）羧基、氨基、巰基和芳香基羧基、羥基、氨基醛基衍生功能團（經化學反應可引入功能團）氨基、巰基、酰肼馬來亞胺基、鹵代乙基、羧基、氨基、醛基馬來亞胺基、酰肼巰基、鹵代乙?；?.偶聯(lián)反應可利用的化學功能團國藥長春所功能團蛋白質多糖一類功能團羧基、氨基、巰基羧基、羥基、氨基醛按照結合方法可分為兩種結合模式兩種抗原的直接結合一般限于羧基和具有一級氨基醛基之間的縮合反應，其產物需要進一步還原才能穩(wěn)定。兩種抗原通過化學雙功能連接劑的結合

在多糖和載體蛋白之間使用一個連接物，不但可增加結合物的收率，而且可大大增強其免疫原性。現(xiàn)有的連接劑按其性質可分為兩種。

5.結合模式國藥長春所按照結合方法可分為兩種結合模式5.結合模式國藥長春

5.結合模式異種雙功能連接劑：SPDP（Ｎ-琥珀酰胺-3-二硫代呲啶丙酸）同種雙功能連接劑AＤH（已二酰肼）EDAC(碳二亞胺)戊二醛。

不同的連接劑所帶的活性功能團不同,因而要求抗原中相應不同的活性功能團與之反應。國藥長春所5.結合模式異種雙功能連接劑：SPDP（Ｎ-琥珀酰5.結合模式按照多糖－蛋白質偶聯(lián)物的分子構象分為兩種連接模式末端連接模式交叉連接模國藥長春所5.結合模式按照多糖－蛋白質偶聯(lián)物的分子構象國藥長春所5.結合模式

末端連接模式

一個載體蛋白上可連接一定數(shù)量的糖鏈，每一條糖鏈上只有一個末端位點與蛋白質結合，糖鏈與蛋白質載體可以直接連接，也可以通過小分子橋連接。

5.結合模式

末端連接模式5.結合模式交叉連接模該模式的每一個載體蛋白或每一個糖鏈上都可以有多個相互連接位點，結合物形成網(wǎng)狀交連體。隨著糖鏈長度的延長，連接點的增加，交連體的分子質量會相應增大，其三維空間結構更為復雜.國藥長春所5.結合模式交叉連接模國藥長春所方案多糖的活性功能基團連接劑選用實例Ⅰ-CHO–OH直接結合（氨基還原反應）付傷寒甲PS結合疫苗Ⅱ-COOHADH（酰胺化反應）疫疾CSP結合疫苗Ⅲ苯環(huán)上－OH

-OHCNBr激活ADH（酰胺化反應）Hib結合疫苗Ⅳ-COOHSPDP（二硫化物交換）傷寒Vi結合疫苗結合疫苗制備常用的四種化學結合方案國藥長春所方案多糖的活性功能基團連接劑選用實例Ⅰ-CHO–OH直接

1.氨基還原法（直接結合）糖類在水溶液中大多以環(huán)狀半縮醛形式存在，在氨基存在的情況下與之形成shiff氏堿。用還原劑將氨基還原成二級亞胺,從而形成穩(wěn)定的多糖蛋白結合物。國藥長春所1.氨基還原法（直接結合）糖類在水溶液中大多以環(huán)狀半縮3.CNBr-ADH酰胺化反應法在堿性條件下用CNBr活化多糖分子上的羥基（-OH）形成氰酸脂。然后與ADH反應將脂酰肼（AH）基團導入多糖分子形成PS-AH衍生物。最后在EDAC的介導下與蛋白載體形成穩(wěn)定的結合物。國藥長春所3.CNBr-ADH酰胺化反應法在堿性條件下用CNBr活化4.SPDP（二硫化物交換）法首先在EDAC的介導下將多糖分子中的羧基與胱氨酸上的氨基通過肽鍵結合，形成含有二硫鍵（-S-S-）的衍生物，然后用二硫基蘇糖醇將雙硫鍵還原成自由的巰基（-SH）,即多糖-SH衍生物。另將SPDP與蛋白質載體反應形成蛋白質衍生物最終兩種衍生物在水溶液中微堿條件下由于二硫基和巰基之間的交換，形成穩(wěn)定的含有二硫鍵的多糖蛋白質復合物。國藥長春所4.SPDP（二硫化物交換）法首先在EDAC的介導下將多糖分六、結合疫苗的兩個共同特征㈠結構特征1.多糖抗原與載體蛋白質之間以化學共價鍵牢固地接合。2.多糖分子大小與載體蛋白的結合比有利于刺激機體產生最強的針對多糖免疫應答。3.重復制備性及穩(wěn)定性好，有效期較長。4.作為多價或單價疫苗易于標準化。國藥長春所六、結合疫苗的兩個共同特征㈠結構特征國藥長春所六、結合疫苗的兩個共同特征㈡功能特征1.多糖蛋白質結合疫苗無毒、安全。2.注射機體后能同時誘發(fā)細胞免疫和Ｔ細胞依賴性免疫，血清中存在高滴度的殺菌抗體。3.能增強嬰幼兒對細菌多糖的免疫應答。4.對某些細菌衍生物載體蛋白不產生加強免疫反應。國藥長春所六、結合疫苗的兩個共同特征㈡功能特征國藥長春所檢定項目檢定指標已二酰肼含量16-45μg/ml氰化物殘留量≤10ng/mg多糖含量≥28μg/ml蛋白含量≥48μg/ml多糖蛋白質比值0.30-0.59高分子結合物含量80%-100%Kd值≤0.20Kd值＜0.20回收率≥

60%EDAC殘留量＜10μmol/L熱原檢查0.025μg/kg細菌內毒素≤5EU/μg結合疫苗檢定項目及指標國藥長春所檢定項目檢定指標已二酰肼含量16-45μg/ml氰化物殘留量莢膜多糖結合疫苗菌體多糖結合疫苗ｂ型流感嗜血桿菌結合疫苗綠膿桿菌OSP-TT結合疫苗肺炎球菌結合疫苗副傷寒桿菌OSP-TT結合疫苗AC群腦膜炎球菌結合疫苗大腸桿菌0157:HT結合疫苗艾希氏大腸桿菌結合疫苗大腸桿菌0111結合疫苗傷寒Vi結合疫苗痢疾結合疫苗肺炎克雷伯桿菌結合疫苗01霍亂弧菌結合疫苗甲乙型及變異鏈球菌結合疫苗O139霍亂弧菌結合疫苗新型隱球菌結合疫苗金黃色葡萄球菌結合疫苗七、結合疫苗的使用和發(fā)展現(xiàn)狀國藥長春所莢膜多糖結合疫苗菌體多糖結合疫苗ｂ型流感嗜血桿菌結合疫苗八、結合疫苗的研究方向1.已逐漸擴展到真菌、寄生蟲、人體分泌的激素更為廣泛的結合疫苗范圍。2.由于其接種效果在兒童中尤為顯著，更是兒童疫苗研制的一個熱點。3.免疫細胞被激活不僅需要有效抗原刺激，同時需要多種刺激信號，而這種信號部分來源于細胞因子，怎樣將結合疫苗與細胞因子聯(lián)合應用，以達到有效免疫的效果是今后的研究方向之一。4.發(fā)展和使用更具免疫活力的蛋白質載體將是新的焦點，在Hib結合疫苗基礎研究中，不同載體蛋白，三次免疫后血清抗體水平高于同一載體蛋白的結合疫苗（不同載體蛋白結合同一多糖時激活的TH細胞的克隆系多于單一載體蛋白）。國藥長春所八、結合疫苗的研究方向1.已逐漸擴展到真菌、寄生蟲、人體分泌九、存在問題1.作為一個單一多糖疫苗基礎上進一步化學結合的疫苗，其制造成本較高，發(fā)展受到一定限制。2.在具體化學合成中還存在許多問題，其中如多糖和載體蛋白質在結合中均存在自身交聯(lián)而變形，產生一種新抗原（副反應物）的可能，如何控制它的發(fā)生還是一個比較棘手的問題。國藥長春所九、存在問題1.作為一個單一多糖疫苗基礎上進一步化學結合國謝謝!國藥長春所謝謝!國藥長春所細菌性疫苗楊麗華2011年3月細菌性疫苗楊麗華1.死疫苗2.活疫苗

3.蛋白類疫苗4.多糖類疫苗

5.多糖蛋白結合疫苗

細菌性疫苗國藥長春所1.死疫苗2.活疫苗3.蛋白類疫苗4.多糖類疫苗細菌性疫苗種類23白喉破傷風百日咳疫苗……451霍亂傷寒副傷寒百日咳疫苗……卡介苗鼠疫布氏桿菌傷寒痢疾霍亂疫苗……腦膜炎傷寒vi肺炎流感嗜血桿菌多糖疫苗……AC腦膜炎球菌多糖結合疫苗HIB……腦膜炎傷寒vi流感嗜血桿菌多糖疫苗……國藥長春所細菌性疫苗種類23白喉451霍亂卡介苗腦膜炎AC腦膜炎球菌多百日咳疫苗

傷寒疫苗結合疫苗

白喉疫苗國藥長春所百日咳疫苗傷寒疫苗結合疫苗白喉疫苗國藥長春所白喉疫苗一、白喉概述二、病原學三、白喉桿菌的致病力及毒素產生的遺傳學四、白喉毒素五、白喉類毒素六、生產工藝七、類毒素的質量檢定國藥長春所白喉疫苗一、白喉概述國藥長春所外毒素對神經系統(tǒng)損害細菌產生的外毒素對心肌損害外毒素對腎臟損害白喉曾經是對兒童威脅非常大的傳染病。它是由白喉棒狀桿菌引起的一種呼吸道傳染病主要臨床表現(xiàn)為上呼吸道發(fā)炎，常常表現(xiàn)在咽部，有時在鼻腔、喉部和氣管，白喉疫苗國藥長春所外毒素細菌產生外毒素白喉曾經是對兒童威脅非常大的傳染病。主要白喉流行特點1.傳染原：白喉桿菌是嚴格寄生于人類的細菌沒有中間宿主，病人及帶菌者是唯一的傳染原。2.傳播途徑：主要是呼吸道飛沫傳播，也可通過被污的器具和食物傳播。3.易感人群：人對白喉普遍易感，新生兒1歲時白喉易感性達高峰。國藥長春所白喉流行特點1.傳染原：白喉桿菌是嚴格寄生于人類的細菌國二、病原學1.細菌形態(tài)

白喉棒狀桿菌菌體一端或兩端膨大呈棒狀，有著色較深的異染顆粒，革蘭氏染色陽性，白喉桿菌無動力，無莢膜，不形成芽孢。國藥長春所二、病原學1.細菌形態(tài)國藥長春所白喉棒狀桿菌顯微鏡下形態(tài)國藥長春所白喉棒狀桿菌顯微鏡下形態(tài)國藥長春所國藥長春所白喉棒狀桿菌顯微鏡下形態(tài)國藥長春所白喉棒狀桿菌顯微鏡下形態(tài)2.培養(yǎng)特性白喉桿菌是需氧菌，最適溫度為34～35℃。能分解葡萄糖、麥芽糖和糊精，產酸不產氣，能還原硝酸鹽，不產生吲哚，不消化蛋白。3.抵抗力⑴.白喉桿菌對抗生素有不同程度敏感，對青霉素和紅霉素極敏感。⑵.對消毒劑抵抗力弱，3％苯酚10min可將該菌殺死⑶.不耐熱，58℃10mi或100℃1min即可被殺死。國藥長春所二、病原學2.培養(yǎng)特性國藥長春所二、病原學三、白喉桿菌的致病力及毒素產生遺傳學1.致病力自然界中動物不感染白喉，只能在敏感動物中造成人工感染。猴、馬、家兔和豚鼠對白喉敏感實驗室常用的動物是家兔、豚鼠和NIH小鼠。2.毒素產生遺傳學白喉是由白喉桿菌產生毒性很強的外毒素引起的。白喉桿菌的產毒基因是由β嗜菌體攜帶。β嗜菌體感染無毒白喉桿菌后嗜菌體DNA與細菌DNA整合，形成溶原性白喉桿菌而獲得產毒能力（PW8株目前用于白喉類毒素生產)。國藥長春所三、白喉桿菌的致病力及毒素產生遺傳學1.致病力國藥長春所四、白喉毒素1.白喉外毒素為棒狀桿菌β-噬菌體tox基因表達產物,可與細胞表面的特異性受體結合,干擾蛋白質的合成，對人和動物都引起致死性毒性，如心臟、腎上腺、肝、腎、胰及神經組織等均受到損害。2.白喉毒素是單一多肽，由560個氨基酸組成，分子量為62kDa,等電點pH4.1，在pH6時加熱55℃很快失活。3.通過物理和化學方法將其純化。國藥長春所四、白喉毒素1.白喉外毒素為棒狀桿菌β-噬菌體tox基因表達細菌毒素甲醛類毒素毒素經甲醛處理后去除毒性而保留免疫原性五、白喉類毒素國藥長春所細甲醛類毒素毒素經甲醛處理后去除毒性五、白喉類毒素國藥長春甲醛濃度溫度PH脫毒影響脫毒因素國藥長春所甲醛溫度PH脫毒影響脫毒因素國藥長春所溫度、pH和甲醛濃度等均影響脫毒效果１.溫度越高脫毒越快，超過40℃影響抗原性，一般37～38℃。２.在酸性時脫毒較慢，但游離甲醛含量高，在保存過程中由于甲醛的繼續(xù)作用，可導致脫毒過甚，并影響毒素的穩(wěn)定性；在堿性時脫毒快，但抗原性損失較大，一般采用弱堿性。３.甲醛濃度大則脫毒快，但抗原損失大。國藥長春所溫度、pH和甲醛濃度等均影響脫毒效果國藥長春所溫度升高游離甲醛的濃度低毒素純度高易發(fā)生毒性逆轉提高甲醛濃度、脫毒pH、脫毒溫度和延長脫毒時間；增加非蛋白氮含量（于精制毒素中加入賴氨酸、精氨酸等）防止或減輕毒性逆轉類毒素的毒性逆轉國藥長春所易發(fā)生毒性逆轉提高甲醛濃度、脫毒pH、防止或減輕毒性逆轉類毒六、白喉疫苗工藝流程

菌種（PW8株）

傳代擴增3～4代

發(fā)酵罐培養(yǎng)34～35℃培養(yǎng)對數(shù)生長末期收獲，甲苯殺菌。離心去菌體收集清液超濾濃縮

硫酸銨兩段鹽析除鹽除菌氨離子及無菌檢查脫毒甲醛液37℃脫毒試驗（家兔）原液檢定（濃度、純度、安全等）

Al(OH)3吸附

成品檢定（安全、效價等）國藥長春所六、白喉疫苗工藝流程七、類毒素的質量檢定1絮狀單位（Lf）

是毒素或類毒素與抗毒素的結合單位，只能代表“量”而不能完全代表活性。使用抗毒素絮狀單位標準品來測定類毒素的絮狀單位。

絮狀單位測定

毒素或類毒素與相應抗毒素在適當?shù)暮?、比例、溫度反應時間等條件下可在試管中發(fā)生抗原抗體結合，產生肉眼可見的絮狀凝集反應，根據(jù)抗毒素絮狀單位標準品可測定類毒素的絮狀單位（Lf）值。2純度：≥1500Lf/mgPN3安全性試驗（豚鼠）國藥長春所七、類毒素的質量檢定1絮狀單位（Lf）國藥長春所七、類毒素的質量檢定4效價測定

類毒素刺激機體產生特異性抗體的免疫應答和對相應抗體的特異性結合反應。⑴小鼠Vero細胞法將標準和待檢類毒素2倍稀釋3～5個稀釋度，皮下免疫NIH小鼠8只（0.5ml/只)，免疫5周采血，根據(jù)vero細胞生長情況，以標準品的效價為標準，用平行線分析法進行結果計算。⑵豚鼠毒素攻擊法皮下免疫豚鼠10只（1ml/只），免疫4周后用毒素攻擊，觀察5天根據(jù)存活率以標準品的效價為標準，用平行線分析法進行結果計算。國藥長春所七、類毒素的質量檢定4效價測定國藥長春所百日咳疫苗一、百日咳概述二、病原學三、百日咳疫苗發(fā)展簡史四、無細胞百日咳疫苗㈠、生產工藝流程㈡、質量檢定㈢、APV的效果㈣、接種不良反應國藥長春所百日咳疫苗一、百日咳概述國藥長春所急性腦炎、嘔吐、痙攣和昏迷，死亡或腦損傷并發(fā)癥肺炎形成肺氣腫肺不張，甚至死亡。營養(yǎng)缺乏癥百日咳是對兒童威脅非常大的傳染病，它是由百日咳桿菌引起的一種呼吸道傳染病。典型癥狀為突然陣發(fā)性痙咳，并帶有吸氣性尾聲或伴有嘔吐，可持續(xù)數(shù)月。百日咳概述國藥長春所急性腦炎、嘔吐、痙攣和昏迷，死亡或腦損傷并發(fā)癥肺炎營養(yǎng)缺百日百日咳流行特點1.傳染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳病人是傳染原。2.傳播途徑：主要是呼吸道飛沫傳播，也可通過被污的器具和食物傳播。3.易感人群：主要傳染對象是6歲以下兒童，1歲以內嬰幼兒發(fā)病率50%。國藥長春所百日咳流行特點1.傳染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳二、病原學㈠細菌形態(tài)百日咳菌呈革蘭氏染色陰性，短桿狀或橢圓形國藥長春所二、病原學㈠細菌形態(tài)國藥長春所㈡生長特性1.百日咳菌可分四種相變，Ⅰ相菌毒力最強有免疫原性；Ⅳ相菌毒力消失，無免疫原性；ⅡⅢ相菌介于Ⅰ

Ⅳ相之間。2.百日咳菌是需氧菌，最適溫度為35～36℃,最適pH6.8-7.0。3.不發(fā)酵任何糖類、不分解糊精，尿素鹽，不液化明膠不產生吲哚，不利用枸櫞酸鹽。國藥長春所㈡生長特性1.百日咳菌可分四種相變，Ⅰ相菌毒力最強有免國作用PTFHAAggsPRNACTCTHLT呼吸道粘附作用＋＋＋＋－＋－--細胞毒性＋＋－－＋＋＋＋＋免疫原性＋＋＋＋＋＋＋--1百日咳Ⅰ相菌有兩大類抗原菌體O抗原表面K抗原（莢膜物質）2百日咳菌可產生外毒素(PT)內毒素其他生物活性物質，據(jù)報道有25種之多。㈡、主要抗原和生物學活性作用PTFHAAggsPRNACTCTHL百日咳菌粘附在上呼吸道上皮細胞纖毛上繁殖↑↓重患

(FHAPTPRNAgg)下呼吸道上皮細胞纖毛上繁殖↓細菌不進入組織和血液循環(huán)

①干擾吞噬細胞功能AC分泌大量PT②麻痹上皮細胞功能TCT①產生血細胞增多③損傷支氣管血管周HLT細胞代謝發(fā)生變化②組織胺致敏性增強圍組織③分泌胰島素增強和血糖降低.

㈢、致病機理國藥長春所百日咳菌粘附在上呼吸道上皮細胞纖毛上繁殖㈢、致病機三、百日咳疫苗發(fā)展簡史㈠粗制百日咳滅活疫苗

第一次世界大戰(zhàn)時期，在對病原菌的生物學構造及其與致病機理間的關系缺乏認識的前提下，憑經驗制造的滅活疫苗，工藝粗造、含量不確定。㈡全菌體百日咳疫苗(WPV)

以標準化方式生產的，制造疫苗的菌株必須含有123型凝集原（Agg1、Agg2、Agg3）。經過50多年的臨床應用證明該疫苗的免疫效果是肯定的，但接種后的不良反應問題一直未解決。㈢無細胞百日咳疫苗(APV)

20世紀80年代初期，對百日咳菌的成分及其所引起生物學作用的認識，產生了APV。㈣基因工程疫苗正在研究中。國藥長春所三、百日咳疫苗發(fā)展簡史㈠粗制百日咳滅活疫苗國藥長春所四、無細胞百日咳疫苗1981年日本的佐藤教授等人在純化出PT和FHA兩種抗原的基礎上，在世界上第一次研制成功了含有兩種抗原成分的無細胞百日咳疫苗，并且與白喉和破傷風類毒素聯(lián)合制成無細胞百白破聯(lián)合疫苗。該疫苗在日本開始正式使用，目前日本已經全部取代了菌體百白破疫苗。1992年美國正式批準使用日本生產的無細胞百日咳疫苗。美國獲得生產許可證的APV還含有Agg2和PRN。目前WHO已經將其作為兒童預防免疫推薦用疫苗。我國是于80年代中期開始研制無細胞百白破聯(lián)合疫苗，90年代中期獲得正式生產文號。近期的臨床試驗證明含有5種保護性抗原（PTFHAPRNAgg2

Agg3）的APV效果最佳。國藥長春所四、無細胞百日咳疫苗1981年日本的佐藤教授等人在純化出PT

凍干百日咳菌種（Ⅰ相CS菌株）↓接種血培養(yǎng)基大管培養(yǎng)↓36℃48-72小時培養(yǎng)傳代接種發(fā)酵罐培養(yǎng)（綜合培養(yǎng)基）↓培養(yǎng)≤48小時收集培養(yǎng)物↓第一段硫酸銨鹽析及浸提↓第二段硫酸銨鹽析及浸提↓透析↓密度梯度離心↓戊二醛脫毒↓透析