膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

膜片鉗技術(shù)講座

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室李玉榮膜片鉗技術(shù)講座哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室李玉榮

在<膜片鉗技術(shù)及應(yīng)用>一書的序言中寫道：通常，一篇非常專業(yè)的科技論文公開發(fā)表后，若被其他的論文引用數(shù)次，其作者就會(huì)感到欣慰；假如被別的作者引用十次以上，就可稱得上是一篇好論文；要是有幸被引用幾十上百次，甚至幾百次，那它無疑是一篇高質(zhì)量杰作，通常發(fā)表在權(quán)威的專業(yè)期刊或者是著名的科學(xué)雜志上，如“Nature”，“Science”，“Cell”和“Neuron”等。在<膜片鉗技術(shù)及應(yīng)用>一書的序言中寫道：

然而，你是否知道？有一篇論文，它的作者當(dāng)時(shí)還不太有名，刊登的雜志也不算頂級(jí)，可是論文發(fā)表20年來，已神話般地被世界各地的科技工作者引用了一萬二千余次，遍及生物醫(yī)學(xué)的眾多領(lǐng)域，而且近年來還在以平均每年約一千多篇的速度繼續(xù)被引用，它就是由Hamill，Marty，Neher，Sakmann和Sigworth等五人于1981年發(fā)表在《歐洲生理學(xué)雜志》（PflugersArchiv.）上的著名論文<ImprovedPath-ClampTechniguesforHigh-ResolutionCurrentRecordingfromCellsandCell-freeMembranePatches>。在此之前五年，身為德國(guó)科學(xué)家的Neher和Sakmann共同發(fā)明了膜片鉗技術(shù)（1976），并于15年后共同榮獲1991年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。膜片鉗技術(shù)的作用和影響由此可見一斑。然而，你是否知道？有一篇論文，它的作者當(dāng)時(shí)還生物電現(xiàn)象研究簡(jiǎn)史生物電現(xiàn)象研究簡(jiǎn)史18世紀(jì)末，意大利醫(yī)生和生理學(xué)家Galvani首先在生物體(蛙)發(fā)現(xiàn)了生物電現(xiàn)象。1902年，Bernstein提出了細(xì)胞生物電產(chǎn)生的膜學(xué)說。1936年，英國(guó)劍橋Young描述了頭足軟體動(dòng)物槍烏賊支配其外套膜肌的巨大軸突直徑可達(dá)1mm。18世紀(jì)末，意大利醫(yī)生和生理學(xué)家Galvani首先在生物體(1939年，Hodgkin和Huxley

把槍烏賊巨軸突用于細(xì)胞內(nèi)膜電位的記錄，首次記錄到膜兩側(cè)的靜息電位。這一工作的意義在于實(shí)驗(yàn)測(cè)定的靜息電位與根據(jù)細(xì)胞膜內(nèi)外鉀濃度經(jīng)Nernst公式計(jì)算的鉀平衡電位非常接近，從而有力地支持了Bernstein關(guān)于靜息狀態(tài)下細(xì)胞膜對(duì)鉀離子有選擇性通透的膜學(xué)說。1939年，Hodgkin和Huxley把槍烏賊巨軸突用于1955年，Hodgkin和Keens在研究神經(jīng)軸突膜對(duì)鉀離子通透性時(shí)發(fā)現(xiàn)，放射性鉀跨軸突膜的運(yùn)動(dòng)很像是通過許多狹窄孔洞的運(yùn)動(dòng)，并提出了“通道”（channel）的概念。細(xì)胞膜對(duì)離子通道的通透性（膜電導(dǎo)）的直接測(cè)定是從應(yīng)用電壓鉗（voltageclamp）技術(shù)以后開始的。1955年，Hodgkin和Keens在研究神經(jīng)軸突膜對(duì)鉀離

電壓鉗技術(shù)是1949年Cole及Marmont設(shè)計(jì)的，后經(jīng)Hodgkin、Huxley和Katz等加以改進(jìn)，并成功地應(yīng)用于槍烏賊巨軸突動(dòng)作電位期間離子電流的研究。他們直接測(cè)定了膜電流并分析了電流的離子成分，推算出動(dòng)作電位期間鈉電導(dǎo)和鉀電導(dǎo)的變化。極大的推動(dòng)離子通道的研究工作，其中的基本概念至今仍被沿用。鑒于Hodgkin、Huxley和Eccles對(duì)通道研究的突出貢獻(xiàn)，獲得1963年諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)。電壓鉗技術(shù)是1949年Cole及Marmont設(shè)計(jì)的A.L.Hodgkin1914~1998A.F.Huxley

1917~A.L.HodgkinA.F.Huxley1972年Katz通過記錄神經(jīng)肌接頭終板膜上乙酰膽堿噪聲，發(fā)現(xiàn)ACh的量子性釋放引起的終板電位及微終板電位，指出其與離子通道的電導(dǎo)、開放時(shí)間及開放頻率的對(duì)應(yīng)關(guān)系，獲1970年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1972年Katz通過記錄神經(jīng)肌接頭終板膜上乙酰膽1976年Neher和Sakmann完成電極與膜之間50MΩ的封接，首次記錄到去神經(jīng)蛙肌纖維膜上的單通道電流，為證實(shí)生物膜離子單通道是以全或無規(guī)律、隨機(jī)開放關(guān)閉的假說提供了有力依據(jù)。

1980年，Neher等利用負(fù)壓吸引實(shí)現(xiàn)了GΩ封接，背景噪聲顯著減低。

1991年膜片鉗技術(shù)的創(chuàng)始人Neher和Sakmann榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)。1976年Neher和Sakmann完成電極與膜PatchclampErwinNeherBertSakmann1944~1942~PatchclampErwinNeher一、離子通道的概念二、離子通道的分子結(jié)構(gòu)三、離子通道的分類四、離子通道的研究技術(shù)五、膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法六、與膜片鉗技術(shù)相結(jié)合的其它研究方法一、離子通道的概念一、離子通道的概念

離子通道（ionchannels）是細(xì)胞上的一種特殊整合蛋白，在脂質(zhì)雙分子層膜上構(gòu)成具有高度選擇性的親水性孔道，允許適當(dāng)大小和電荷的離子以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式通過。一、離子通道的概念離子通道（ionchan

離子通道是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，無論動(dòng)物或植物、單細(xì)胞生物或多細(xì)胞生物的細(xì)胞膜上，都有離子通道存在。離子通道的最基本功能是產(chǎn)生細(xì)胞生物電現(xiàn)象，即與細(xì)胞的興奮性直接相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，才進(jìn)一步派生出神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、腺體的分泌、肌肉的運(yùn)動(dòng)。因此，離子通道是可興奮細(xì)胞膜上的基本興奮單元，具有重要的生理功能。離子通道是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，無論動(dòng)物或植物、單細(xì)膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

離子通道具有兩大共同特征，即離子選擇性及門控特性。前者包括通道對(duì)離子大小的選擇性及電荷選擇性，在一定條件下，某一種離子只能通過與其相應(yīng)的通道跨膜擴(kuò)散，各離子通道在不同狀態(tài)下，對(duì)相應(yīng)的離子的通透性不同，如安靜時(shí)神經(jīng)細(xì)胞膜離子通道對(duì)K+的通透性比Na+大100倍，而神經(jīng)興奮時(shí)，對(duì)Na+通透性又比K+大10~20倍，表明了通道對(duì)離子的選擇性的差異。離子通道具有兩大共同特征，即離子選擇性及門控

離子通道的另一特征是離子通道的門控特性，離子通道一般都具有相應(yīng)的閘門，通道閘門的開啟和關(guān)閉過程稱為門控（gating）。正常情況下，通道大多處于關(guān)閉狀態(tài)，只有在特定的條件下，通道的閘門才能開啟，引起離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。一般認(rèn)為，不同信號(hào)控制其開放和關(guān)閉，通道可表現(xiàn)為三種狀態(tài)，正常情況下，通道處于備用狀態(tài)，在外界因素作用下，通道允許某種或某些離子順濃度差和電位差通過膜，相當(dāng)于通道開放，稱為激活（activation）。通道的失活（inactivation）是與通道關(guān)閉不完全相同的功能狀態(tài)。離子通道的另一特征是離子通道的門控特性，離子通二、離子通道的分子結(jié)構(gòu)

隨著生物物理學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，新的研究技術(shù)的應(yīng)用，特別是膜片鉗片技術(shù)與分子克隆、基因突變和異體表達(dá)等技術(shù)的結(jié)合，使徘徊多年的離子通道研究迅速進(jìn)入到分子、亞分子水平，人們已有能力從分子水平來確定通道的分子結(jié)構(gòu)和解釋離子通道的孔道特性。二、離子通道的分子結(jié)構(gòu)隨著生物物理學(xué)和分子生１．電壓門控離子通道的基本結(jié)構(gòu)

經(jīng)純化、克隆和測(cè)定表明，離子通道蛋白是由多個(gè)亞基構(gòu)成的復(fù)合體。電壓門控離子通道由α、β、γ、δ等亞基構(gòu)成，但不同的離子通道的組成略有差異，如鈉通道由α、β1和β2亞基組成，鈣通道由α1、α2、β、γ和δ亞基組成，鉀通道由α和β亞基組成等。在各亞基中，α亞基是構(gòu)成離子通道的主要功能單位，而其它亞基則只起調(diào)節(jié)作用。１．電壓門控離子通道的基本結(jié)構(gòu)經(jīng)純化、α亞基是一條跨膜多肽，由1800~2000個(gè)氨基酸組成。它包括四個(gè)跨膜功能區(qū)（Ⅰ~Ⅳ），每個(gè)功能區(qū)含有約300個(gè)氨基酸，組成的6個(gè)α螺旋區(qū)段（S1~S6）,除S4為親水性跨膜螺旋片段外，其余5個(gè)均為疏水性跨膜螺旋片段。在膜外側(cè)面有連接糖基的部位和毒素的結(jié)合位點(diǎn)；在膜內(nèi)側(cè)則有蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)。位于S5和S6間的一段氨基酸序列部分貫穿膜內(nèi)，是形成親水性孔道而使離子選擇性通過的部分稱為孔道區(qū)（poreregion）或P區(qū)，四個(gè)功能區(qū)圍繞一個(gè)中心對(duì)稱排列，P區(qū)在內(nèi)組成孔道內(nèi)壁。S4肽段含有一些帶正電荷的氨基酸殘基（如精、賴氨酸），對(duì)膜電位的變化敏感，起電壓感受器的作用。α亞基是一條跨膜多肽，由1800~2000個(gè)膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

當(dāng)膜去極化時(shí)，每一個(gè)功能區(qū)的S4肽段做螺旋運(yùn)動(dòng)而使正電荷移出產(chǎn)生微弱而短暫的門控電流，導(dǎo)致通道構(gòu)象變化。當(dāng)四個(gè)功能區(qū)S4肽段均發(fā)生這種構(gòu)象變化時(shí)，則通道便處于激活開放狀態(tài)，因此，S4肽段又稱為激活閘門（activationgate,m閘門）在通道開放后，很快Ⅲ功能區(qū)的S6與Ⅳ功能區(qū)的S1之間的肽鏈構(gòu)成失活閘門（inactivationgate,h閘門），形成一“活瓣”，將通道內(nèi)口阻塞，調(diào)控通道的失活過程。當(dāng)膜去極化時(shí)，每一個(gè)功能區(qū)的S4肽段做螺旋運(yùn)膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

鉀通道根據(jù)分子生物學(xué)分類為KV和KIR兩大類，分別對(duì)應(yīng)于功能性分類中的外向整流和內(nèi)向整流鉀通道。KV類又分為KV1、KV2、KV3和KV4四組，每組又按發(fā)現(xiàn)克隆的次序先后進(jìn)一步分類，如KV0、KV1.2、KV1.5等。除KV1.4為瞬時(shí)外向鉀通道（KA）外，其余在功能上都屬于或接近于延遲整流鉀通道。在結(jié)構(gòu)上KV類鉀通道由4個(gè)亞基構(gòu)成，每個(gè)亞基僅有一個(gè)功能區(qū)，由6個(gè)跨膜區(qū)段組成。因此，電壓門控鉀通道的一個(gè)亞基相當(dāng)于鈉通道和鈣通道的一個(gè)跨膜區(qū)。鉀通道根據(jù)分子生物學(xué)分類為KV和KIR兩大類KIR類鉀通道不同于KV類和鈉、鈣通道，其每個(gè)α亞基只有兩個(gè)跨膜肽類（M1和M2），其間由H5連接，因M1、M2和H5的序列與KV類的S5、S6相似，所以這兩類鉀通道可能具有相同的基本孔道結(jié)構(gòu)。由于沒有S4樣結(jié)構(gòu)，其電壓門控機(jī)制可能與M2上帶負(fù)電荷的氨基酸殘基有關(guān)。

KIR類鉀通道不同于KV類和鈉、鈣通道，其每２．化學(xué)門控離子通道的基本結(jié)構(gòu)

當(dāng)各種化學(xué)物質(zhì)與化學(xué)門控離子通道相應(yīng)部位結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致通道蛋白發(fā)生構(gòu)型變化，引起通道開放，產(chǎn)生離子電流。體內(nèi)這種離子通道的種類很多，主要包括各種神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道、ATP敏感鉀通道和鈣依賴性鉀通道等。神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道又稱為離子通道受體，主要有乙酰膽堿門控離子通道、GABA門控離子通道及谷氨酸門控離了通道三大類。

２．化學(xué)門控離子通道的基本結(jié)構(gòu)當(dāng)各種化學(xué)物質(zhì)乙酰膽堿門控離子通道

由α1γα2βδ五個(gè)亞基組成，呈五邊形排列。每個(gè)亞基有4個(gè)跨膜區(qū)段即M1~4。其中M2跨膜區(qū)段中除疏水性氨基酸外，還間斷出現(xiàn)少量的絲氨酸和蘇氨酸，它們排列在α螺旋的一側(cè)，由五個(gè)亞基的M2共同構(gòu)成孔道的內(nèi)壁。每個(gè)亞基的N端和C端都朝向膜外，其中α1和α2亞基N端的細(xì)胞外部分各有一個(gè)ACh結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)兩個(gè)ACh分子與α亞基結(jié)合后，便引起通道蛋白的構(gòu)象變化和通道開放，主要引起Na+內(nèi)流增多。乙酰膽堿門控離子通道由α1γα2βδ五個(gè)

近來研究表明，一些神經(jīng)遞質(zhì)也可以通過與膜受體結(jié)合后，激活細(xì)胞膜內(nèi)的G蛋白，通過G蛋白α亞基或βγ亞基直接調(diào)節(jié)離子通道的活動(dòng)。也可以通過G蛋白耦聯(lián)受體生成第二信使，進(jìn)而影響離子通道的活性。近來研究表明，一些神經(jīng)遞質(zhì)也可以通過與膜受體膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件三、離子通道的分類非門控離子通道門控離子通道電壓門控性通道化學(xué)門控性通道機(jī)械門控性通道三、離子通道的分類非門控離子通道

1、非門控性離子通道

有些離子通道始終處于開放狀態(tài)，離子可隨時(shí)進(jìn)出細(xì)胞，并不受外界信號(hào)的明顯影響，這些通道稱為非門控離子通道。如神經(jīng)和肌肉細(xì)胞在安靜狀態(tài)下靜息電位的產(chǎn)生，是由于細(xì)胞膜上的離子通道允許K+自由進(jìn)出細(xì)胞，而引起的K+電化學(xué)平衡電位，此種K+通道即屬于非門控性離子通道。1、非門控性離子通道有些離子通道始終處于

2、電壓門控離子通道

電壓門控離子通道（voltage-gatedionchannels）的開啟或關(guān)閉受膜電位的變化決定，具有電壓依賴性，同時(shí)通道往往還與電位變化的時(shí)程有關(guān)，即具有時(shí)間依賴性。這類通道在決定細(xì)胞的興奮性、不應(yīng)期和傳導(dǎo)性以及維持細(xì)胞正常體積等方面發(fā)揮重要作用。電壓門控離子通道一般以最容易通過的離子命名，如鈉離子通道、鈣離子通道及鉀離子通道等。2、電壓門控離子通道電壓門控

電壓門控鈉離子通道

鈉離子通道（sodiumchannels，簡(jiǎn)稱鈉通道），是選擇性地容許Na+跨膜通過的離子通道。根據(jù)其對(duì)鈉通道阻滯劑河豚毒素（tetrodotoxin,TTX）和μ-食魚螺毒素（μ-conotoxin,μ-CTX）的敏感性不同分為神經(jīng)類、骨骼肌類和心肌類鈉通道三類。

電壓門控鈉離子通道鈉離子通道（sod電壓門控鈣離子通道

鈣離子通道（calciumchannels，簡(jiǎn)稱鈣通道）是選擇性容許Ca2+跨膜通過的離子通道。TsienRW等根據(jù)肌細(xì)胞和神經(jīng)元電壓門控離子通道對(duì)膜電位變化的敏感性，將神經(jīng)元質(zhì)膜電壓門控鈣離子通道分為T（transient）、L（longlasting）及N（neitherT,norL）三種類型，后來應(yīng)用不同的毒素阻斷鈣電流的某種特定的成分，在神經(jīng)元又增加了P（purkinje）、Q和R型，共6型。

電壓門控鈣離子通道鈣離子通道（calciumchan電壓門控鉀離子通道

鉀離子通道（potassiumchannels，簡(jiǎn)稱鉀通道）是廣泛存在、種類最多、最為復(fù)雜的一大類離子通道，僅電壓門控鉀通道就已克隆出幾十種亞型，根據(jù)其電流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)可分為延遲外向整流鉀通道、瞬時(shí)外向鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道三類。電壓門控鉀離子通道鉀離子通道（potassiumch3、化學(xué)門控離子通道

化學(xué)門控離子通道（chemicallygatedionchannels）又稱配體門控通道（ligandgatedchannels）。這一類通道的門控行為主要受其相應(yīng)配體的控制，配體是包括神經(jīng)遞質(zhì)、激素等各種激動(dòng)劑和阻滯劑在內(nèi)的多種化學(xué)因素。當(dāng)激動(dòng)劑與化學(xué)門控離子通道結(jié)合后，會(huì)引起通道蛋白構(gòu)型變化，導(dǎo)致通道開放，產(chǎn)生離子電流。3、化學(xué)門控離子通道化學(xué)門控離子通道（chemical神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道也稱為離子通道型受體，其結(jié)構(gòu)中具有與神經(jīng)遞質(zhì)特異性結(jié)合的位點(diǎn)，當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)與其結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，將引起通道開放。神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道主要包括乙酰膽堿門控離子通道、GABA門控離子通道和谷氨酸門控離子通道三大類。

神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道也稱為離子通道型受體，其結(jié)構(gòu)中具有與4、機(jī)械門控離子通道

機(jī)械門控離子通道（mechanicallygatedionchannels）是由機(jī)械牽拉激活的離子通道，主要見于觸覺和聽覺感受器，如機(jī)械刺激作用于蝦類牽張感受引起通道開放，出現(xiàn)Na+內(nèi)流和K+外流，產(chǎn)生感受器電位；聲波傳入內(nèi)耳后，引起內(nèi)耳毛細(xì)胞頂端纖毛發(fā)生彎曲或偏斜，從而使毛細(xì)胞頂端機(jī)械門控通道開放，陽(yáng)離子內(nèi)流產(chǎn)生聽覺的感受電位。4、機(jī)械門控離子通道機(jī)械門控離子通道（mechanic

5、其它門控離子通道除上述離子通道外，尚發(fā)現(xiàn)具有其它門控特性的離子通道存在，如細(xì)胞容積敏感的鉀通道（Kvol）在細(xì)胞腫脹時(shí)通道開放；

Na+激活鉀通道（KNa）對(duì)電壓、細(xì)胞內(nèi)ATP濃度及細(xì)胞內(nèi)鈣均不敏感，只有細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高到20mmol/L以上時(shí)開放。5、其它門控離子通道除上述離子通道外，尚發(fā)現(xiàn)具有其四、離子通道的研究技術(shù)

四、離子通道的研究技術(shù)

在進(jìn)行細(xì)胞電生理研究中，最重要的物理學(xué)定律是歐姆定律（Ohm’sLaw）。當(dāng)電流（I）流經(jīng)一電阻（R）時(shí)，會(huì)在其兩端產(chǎn)生電位差（V），即V=IR。此時(shí)，電流與電壓的關(guān)系（I-V）是一條通過原點(diǎn)的直線，其斜率即為該通道的電導(dǎo)，這是適用于線性系統(tǒng)的歐姆定律，而生物系統(tǒng)并非線性系統(tǒng)，只是應(yīng)用歐姆定律進(jìn)行近似的描述。在進(jìn)行細(xì)胞電生理研究中，最重要的物理學(xué)定律是

1、電壓鉗技術(shù)的基本原理

電壓鉗技術(shù)是通過一個(gè)反饋電路使膜電位保持在指定的水平，當(dāng)離子通道開放產(chǎn)生跨膜電流，導(dǎo)致膜電位改變時(shí)，可通過反饋電路經(jīng)微電極向胞內(nèi)注入電流，補(bǔ)充的電流量正好等于跨膜流出的反向離子流，使膜通透性發(fā)生改變時(shí)膜電位保持不變，此時(shí)注入電流的變化就可反應(yīng)膜電導(dǎo)或膜電流的改變。電壓鉗技術(shù)工作原理如示意圖：1、電壓鉗技術(shù)的基本原理電壓鉗技術(shù)是通過一個(gè)反饋電膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件2、膜片鉗技術(shù)的基本原理

膜片鉗技術(shù)是在電壓鉗技術(shù)基礎(chǔ)上，以記錄通過離子通道的離子電流來研究細(xì)胞膜上單個(gè)（或多個(gè)）離子通道分子活動(dòng)的電生理技術(shù)。膜片鉗技術(shù)可用一根玻璃微電極同時(shí)完成膜片（或全細(xì)胞）電位的監(jiān)測(cè)、鉗制及通道電流的記錄。2、膜片鉗技術(shù)的基本原理膜片鉗技術(shù)是在電壓鉗技術(shù)基礎(chǔ)上，

隨著該技術(shù)的逐漸完善及應(yīng)用，目前已成為從功能角度探討各種生理、病理生理及藥物作用機(jī)制最直接、最理想的電生理學(xué)研究方法，也為多學(xué)科探討生命活動(dòng)規(guī)律、疾病與轉(zhuǎn)歸機(jī)理及藥物作用等細(xì)胞和分子水平的研究，開辟了廣泛前景。隨著該技術(shù)的逐漸完善及應(yīng)用，目前已成為從功能

膜片鉗技術(shù)是用尖端直徑1~2μm的玻璃微電極尖端與酶處理干凈的細(xì)胞膜接觸，通過20~30cmH2O的負(fù)壓吸引造成電極尖端與細(xì)胞膜形成高阻封接（10~100GΩ），使電極尖端下的小塊膜片與膜的其它部分在電學(xué)上絕緣，并在此基礎(chǔ)上固定膜片電位，監(jiān)測(cè)幾個(gè)μm2膜片上1~3個(gè)離子通道活動(dòng)的方法。膜片鉗技術(shù)具有1pA的電流分辨率,10μs

的時(shí)間分辨率和1μm2的空間分辨率，從而使其成為在活體細(xì)胞上進(jìn)行電生理學(xué)研究的重要手段。膜片鉗技術(shù)是用尖端直徑1~2μm的玻璃微電極尖端與酶處理膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

3、膜片鉗記錄的模式

根據(jù)研究需要及記錄膜片的不同，膜片鉗記錄可形成以下四種基本模式

1.細(xì)胞貼附式（cellattachedpatch）

2.內(nèi)面向外式（inside-outpatch）

3.外面向外式（outside-outpatch）

4.全細(xì)胞記錄式（wholecellrecording）

3、膜片鉗記錄的模式根據(jù)研究需要及記錄膜膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

4、膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的組建

膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)雖然可因研究目的不同而有所區(qū)別，但其基本組成是相同的，包括膜片鉗放大器和接口，顯微鏡和視頻監(jiān)視器以及防震臺(tái)和屏蔽罩等。

4、膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的組建膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)雖然膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件視頻監(jiān)視器溫度控制系統(tǒng)倒置顯微鏡探頭微操縱器模數(shù)轉(zhuǎn)換器膜片鉗放大器數(shù)據(jù)采集及分析軟件計(jì)算機(jī)視頻監(jiān)視器溫度控制系統(tǒng)倒置顯微鏡探頭微操縱器模數(shù)轉(zhuǎn)換器膜片鉗五、膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法

膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法包括：微電極的制備、細(xì)胞標(biāo)本的制備、高阻封接的形成、離子單通道電流的記錄或全細(xì)胞記錄五、膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法包括：膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

1、微電極的制備微電極是用拉制器由玻璃毛細(xì)管拉制而成。玻璃微電極的選材和拉制質(zhì)量直接影響封接電阻及記錄時(shí)的噪聲大小。

（1）選材膜片鉗實(shí)驗(yàn)用微電極可根據(jù)不同記錄模式選用不同的玻璃毛細(xì)管拉制。從玻璃毛細(xì)管材料方面,可分為軟質(zhì)玻璃和硬質(zhì)玻璃兩類。1、微電極的制備微電極是用拉制器由玻璃毛細(xì)管拉制而成（2）拉制膜片鉗實(shí)驗(yàn)用微電極與細(xì)胞外記錄和細(xì)胞內(nèi)記錄用微電極不同，其尖端較短，錐度較大，尖端直徑為1~5μm，充灌林格氏液時(shí)阻抗約1~5MΩ，因此一般采用兩步拉制法。第一步將玻璃軟化，拉出一個(gè)長(zhǎng)7~10mm、直徑200~400μm的桿，第二步再?gòu)臈U中央以較小電流拉出兩根尖端錐度較大的微電極。（2）拉制膜片鉗實(shí)驗(yàn)用微電極與細(xì)胞外記錄和細(xì)胞內(nèi)記錄用微（3）處理微電極拉制成功后，其尖端需進(jìn)一步處理。這一過程包括涂硅酮樹酯（sylgardcoating）和熱拋光（heatpolish）。前者是將硅酮樹酯涂于微電極尖端以外部分，然后加熱使其烘干固化，達(dá)到使浸入浴液中的微電極表面呈疏水性，減小電極內(nèi)部與溶液之間的電容。熱拋光是在顯微鏡下，將微電極尖端接近熱源，使電極尖端表面變得更加寬闊和光滑，同時(shí)也使粘涂到電極尖端的Sylgard被燒掉或蒸發(fā)。經(jīng)熱拋光處理的微電極可使高阻封接的成功率明顯提高。（3）處理微電極拉制成功后，其尖端需進(jìn)一步處理。這一過程（4）充灌微電極使用前要充灌電極內(nèi)液，電極內(nèi)液需經(jīng)0.2μm的濾膜或?yàn)V紙過濾。充灌時(shí)首先將電極尖端浸入電極內(nèi)液，利用虹吸作用使尖端部分充滿液體，然后再?gòu)碾姌O尾端充灌。在充灌中應(yīng)避免電極內(nèi)出現(xiàn)氣泡，如有氣泡可使電極尖端向下，輕敲管壁除去。也應(yīng)避免充灌電極內(nèi)液太多，否則影響實(shí)驗(yàn)噪聲基線。（4）充灌微電極使用前要充灌電極內(nèi)液，電極內(nèi)液需經(jīng)0.22、細(xì)胞標(biāo)本的制備除腦片膜片鉗和盲膜片鉗法之外，實(shí)驗(yàn)所需標(biāo)本均為具有生物活性的單個(gè)離體細(xì)胞，其來源包括急性分離、原代和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。從理論上來講，膜片鉗實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞標(biāo)本可來自體內(nèi)各種組織細(xì)胞，只要細(xì)胞表面光滑，能與微電極尖端形成高阻封接即可。但在標(biāo)本制備上，不同組織細(xì)胞間聯(lián)接牢固程度不同，采用的分離方法也不完全相同。大體上包括沖洗、酶解消化或機(jī)械分離及清洗等步驟。2、細(xì)胞標(biāo)本的制備除腦片膜片鉗和盲膜片鉗法之外，實(shí)驗(yàn)所需3、高阻封接的形成

高阻封接形成與否是記錄細(xì)胞離子通道電流能否成功的前提，是進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵一步。微電極尖端與細(xì)胞膜形成封接的過程，可以采用軟件或刺激器發(fā)出1mV脈沖電壓作用于微電極，造成膜兩側(cè)電位差發(fā)生變化，產(chǎn)生電極電流，再通過示波器或顯示屏，觀察電極電流幅度的變化來確定封接程度。在電極未入溶液之前，在顯示器或示波器上可見一直線。

3、高阻封接的形成膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件進(jìn)行高阻封接時(shí)，需注意的是：①在微電極未入液之前常施以正壓，使電極內(nèi)有液體從電極尖端流出，防止浴液表面灰塵或溶液中粒子附著于電極尖端，影響高阻封接。②電極尖端與細(xì)胞膜接觸，稍加負(fù)壓后電流波形變得平坦，此時(shí)，如使電極超極化，則有助于加速形成高阻封接。③電極入液后封接的成功率與入浴液后的時(shí)間呈反比，電極內(nèi)液中的肽類或蛋白質(zhì)成分也會(huì)有礙于封接形成。進(jìn)行高阻封接時(shí)，需注意的是：

4、離子通道電流的記錄4、離子通道電流的記錄

單通道記錄

離子單通道電流的記錄是膜片鉗技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)，當(dāng)尖端直徑為1μm的玻璃微電極與細(xì)胞膜形成高阻封接后，電極尖端下的一小塊膜片上，僅含有一個(gè)或幾個(gè)離子通道，根據(jù)單通道電流的特征，很容易得到對(duì)某種離子有選擇性通透的單一的離子通道電流。由于單通道電流大小僅為1pA（10-12A）左右，要記錄到這一微小電流，除盡量降低膜片鉗系統(tǒng)噪聲及電極噪聲外，良好的高阻封接是獲得低噪聲記錄的先決條件，電阻值愈大，噪聲電流愈小。單通道記錄離子單通道電流的記錄是膜片鉗技術(shù)的最大優(yōu)膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

全細(xì)胞記錄

全細(xì)胞記錄是膜片鉗四種基本模式之一。盡管它記錄的是細(xì)胞膜多個(gè)離子通道開放產(chǎn)生的宏膜電流，但由于該模式既可以對(duì)離子通道的性質(zhì)和分類進(jìn)行宏觀性質(zhì)的分析，也可以對(duì)離子通道的構(gòu)造、分布與功能進(jìn)行微觀性質(zhì)的分析。還可以通過測(cè)量膜電容對(duì)細(xì)胞分泌活動(dòng)進(jìn)行研究，從而使其成為當(dāng)前電生理研究中應(yīng)用最廣泛的一種模式。全細(xì)胞記錄

全細(xì)胞記錄是膜片鉗四種基本模式之一。盡

全細(xì)胞記錄模式可用于測(cè)定在某個(gè)時(shí)間和電壓情況下，離子通道電流的大小，觀察其電壓依賴性特征，如以膜電位為橫座標(biāo)，電流強(qiáng)度為縱座標(biāo)，則可繪制出電流-電壓關(guān)系曲線（I-V曲線）。在電流為零時(shí)的膜電位被稱為反轉(zhuǎn)電位。其大小取決于膜兩側(cè)的離子濃度及通道的離子選擇性，反映了某種通道的電壓依賴性及藥物等因素對(duì)通道電壓依賴性的影響，常作為全細(xì)胞記錄模式結(jié)果分析的指標(biāo)之一。

全細(xì)胞記錄模式可用于測(cè)定在某個(gè)時(shí)間和電壓情況下，離子通道膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件此外，由于電壓門控通道的電壓依賴性，在膜電位出現(xiàn)階梯狀改變時(shí)，可以記錄到一個(gè)過渡電流即尾電流（tailcurrent）。由于全細(xì)胞電流是通過每個(gè)離子通道電流的總和，而離子通道又隨時(shí)間的推移呈概率性關(guān)閉，因此尾電流的強(qiáng)度也隨全細(xì)胞電流強(qiáng)度的變化而按指數(shù)相關(guān)數(shù)衰減，測(cè)定尾電流強(qiáng)度的變化也可作為結(jié)果分析的指標(biāo)之一。此外，由于電壓門控通道的電壓依賴性，在膜電位出現(xiàn)階梯狀膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

鈉通道在多種細(xì)胞尤其是在神經(jīng)、肌肉等可興奮細(xì)胞中廣泛存在。鈉通道激活可導(dǎo)致Na+快速內(nèi)流、細(xì)胞去極化，產(chǎn)生動(dòng)作電位的上升支，因此，鈉通道的活性對(duì)細(xì)胞的功能有重要的影響。鈉通道的激活是電壓門控的，當(dāng)細(xì)胞膜去極化至-60mV左右時(shí)，即可引起膜上大量鈉通道激活。產(chǎn)生一迅速激活并迅速失活的內(nèi)向電流，當(dāng)去極化至-30mV左右時(shí)達(dá)到最大，反轉(zhuǎn)電位為+30mV左右。當(dāng)靜息膜電位升至-50mV左右，可使Na+通道完全失活，不能引起鈉通道開放。鈉通道電流的測(cè)定

鈉通道電流的測(cè)定在參數(shù)設(shè)計(jì)上應(yīng)使保持電位鉗制在-80mV以下，此時(shí)給予不同程度的去極化階躍電壓，則可得到鈉電流，由于鈉通道激活和失活均很快，因此刺激脈沖波寬常為20~50ms。為證實(shí)所測(cè)電流為鈉電流，常借助于工具藥，如河豚素（TTX）用于細(xì)胞外液中，可以選擇性阻斷鈉通道。由于神經(jīng)與心臟中的鈉通道亞型不同。心肌鈉通道對(duì)TTX的敏感度比神經(jīng)低數(shù)百倍。當(dāng)膜電位鉗制在-80mV，去極化中還可能引起某些鉀通道成分的激活，此時(shí)可使用鉀通道阻斷劑或?qū)㈦姌O液中KC1以CsC1取代可起到抑制鉀通道激活的作用。在參數(shù)設(shè)計(jì)上應(yīng)使保持電位鉗制在-80mV以下，此時(shí)給予不

鈣通道電流的測(cè)定

由于電壓依賴的鈣通道廣泛存在于各種組織中，是興奮時(shí)鈣內(nèi)流的主要途徑，因此研究電壓門控鈣通道的調(diào)節(jié)及藥物對(duì)其影響是非常重要的。電壓門控鈣通道又分為L(zhǎng)、N、T、P、Q及R等型，其中L型鈣通道的電導(dǎo)最大，在心腦血管疾病的治療中有重要意義，如二氫吡啶類鈣拮抗劑就選擇地作用于L型鈣通道。鈣通道電流的測(cè)定（1）L型鈣通道:①激活的膜電位較高，膜電位鉗制在-50mV以下，這樣即較大程度的激活了L型鈣通道，又有效的抑制了鈉通道的活性;②L型鈣通道的激活與失活時(shí)間較長(zhǎng)，往往需幾十甚至數(shù)百毫秒，因此去極化脈沖的保持時(shí)間在200~500ms之間;③L型鈣通道的最大電流約在0~+10mV;④反轉(zhuǎn)電位為+40~+50mV左右。

L型鈣通道除對(duì)二氫吡啶、Verapamil以及硫氮卓酮等鈣拮抗劑敏感外，對(duì)某些無機(jī)離子如Cd2+也很敏感。20μMCd2+就可使鈣通道活性抑制90%以上。因此常被用作全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)中的工具藥。（1）L型鈣通道:

值得注意的是，L型鈣通道電流測(cè)定時(shí),可隨時(shí)間產(chǎn)生衰減,即所謂Rundown現(xiàn)象。盡管許多學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，但仍不能有效地防止這一現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)在10分鐘之內(nèi)就可使鈣電流減少30~50%。如不加以矯正，則直接影響結(jié)果的可靠性，尤其是給藥前后的對(duì)比，因此在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，必須考慮到這一因素，并設(shè)立嚴(yán)格的對(duì)照組。值得注意的是，L型鈣通道電流測(cè)定時(shí),可隨時(shí)間產(chǎn)生衰減,即膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件（2）T型鈣通道:①激活所需的膜電位較低,通常為-100~-60mV。此差別常用來與L型鈣通道進(jìn)行鑒別，如將膜電位鉗制在-40mV時(shí)，去極化只能得到L型鈣電流，因T型通道已被完全抑制。②當(dāng)有鈉通道和鉀通道拮抗劑存在時(shí)，膜電位被鉗制在-100mV時(shí)，進(jìn)行不同程度的去極化，所得到的內(nèi)向電流可分為兩種成分，即低閾值（-50~-40mV）快速失活的T型鈣通道電流和高閾值（-10~0mV）緩慢失活的L型鈣通道電流。此外，T型鈣通道對(duì)雙氫吡啶類鈣拮抗劑均不敏感，Cd2+對(duì)其抑制也不明顯。（2）T型鈣通道:（3）N型鈣通道則僅存在于神經(jīng)細(xì)胞和突觸部位，這種通道激活時(shí)，所需的膜電位與T型鈣通道相似，范圍在-100~40mV。此型電流不能被二氫吡啶類鈣拮抗劑所抑制，但可被較低濃度的Cd2+所阻斷。ω-conotoxin是其具有相對(duì)特異性的拮抗劑。P型通道也僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，可被FXT（一種蜘蛛毒素）所阻斷，對(duì)其它的鈣通道阻斷劑均不敏感。（3）N型鈣通道則僅存在于神經(jīng)細(xì)胞和突觸部位，這種通道激活時(shí)

鉀通道電流的測(cè)定

鉀通道是亞型最多、分布最廣的一大類離子通道，現(xiàn)在已知并具有明確功能及動(dòng)力學(xué)特性的鉀通道就有十多種，各種鉀通道亞型的特征電流不如鈉或鈣通道電流明顯，因此在研究中要根據(jù)它們的電壓及時(shí)間依賴性，選擇恰當(dāng)?shù)拇碳げ襟E及時(shí)間，配合特定工具藥進(jìn)行區(qū)分。鉀通道電流的測(cè)定

鉀通道是亞型最多、分布最廣的一大類（1）內(nèi)向整流鉀電流（IK1），即背景鉀電流，主要參與心房肌，心室肌靜息電位的形成，并直接影響動(dòng)作電位的形態(tài)，在平臺(tái)期，通道開放很小，而在復(fù)極化時(shí)活性增加，從而產(chǎn)生動(dòng)作電位的快速終末復(fù)極化。由于這種通道亞型的內(nèi)向整流特性，當(dāng)膜電位去極化時(shí)，穩(wěn)態(tài)電流呈一定的外向電流，而當(dāng)鉗制電位負(fù)于膜電位時(shí)，則呈明顯的內(nèi)向電流，其強(qiáng)度是電壓依賴的。通常膜電位從超極化（如-120mV）至去極化（如+30mV），將各鉗制電壓末期的電流對(duì)膜電位作圖，得出電流-電壓關(guān)系曲線（I-V曲線），其形狀為“N”型，反轉(zhuǎn)電位主要受細(xì)胞外鉀的影響，即當(dāng)細(xì)胞外鉀濃度增加時(shí)，反轉(zhuǎn)電位向正的方向移動(dòng)。（1）內(nèi)向整流鉀電流（IK1），即背景鉀電流，主要參與心房肌膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件（2）延遲整流鉀通道電流（IK）是在去極化過程中被緩慢激活的一種外向電流，在短時(shí)間內(nèi)不能達(dá)到穩(wěn)態(tài)，因此測(cè)定這類鉀通道時(shí)，去極化時(shí)間應(yīng)保持足夠長(zhǎng)，有時(shí)需數(shù)秒。在某些組織如心肌全細(xì)胞記錄中，當(dāng)去極化完成，恢復(fù)至鉗制電位（-50mV以上）時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一外向尾電流，它也可代表延遲整流鉀電流?，F(xiàn)已用于延遲整流鉀通道選擇性阻斷劑的研制。已知IK含有兩個(gè)電流成分，即快速激活電流成分Ikr和慢激活成分IKS，現(xiàn)有的Ⅲ類抗心律失常藥均選擇性作用于Ikr，篩選有關(guān)抑制IK，甚至選擇性抑制IKS的Ⅲ類抗心律失常藥物具有重要的理論和實(shí)際意義。（2）延遲整流鉀通道電流（IK）是在去極化過程中被緩慢激活的膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件（3）瞬時(shí)外向鉀通道（IA或Ito）也是一電壓門控的鉀通道，它存在于多種組織中，也是人心室肌中主要的鉀通道亞型。其電流特征是在去極化早期出現(xiàn)，是激活與失活均較快的一種外向電流。由于Ito的存在，使動(dòng)作電位早期快速?gòu)?fù)極化。Ito常與Ica相互影響，因此只有在阻斷Ica時(shí)才能準(zhǔn)確測(cè)定Ito，常用CdC12或鈣拮抗劑硝苯吡啶和Verapamil等阻斷鈣通道,但近來發(fā)現(xiàn)當(dāng)硝苯吡啶劑量稍大時(shí)也有阻斷Ito作用。把鉗制電位保持在-40~-60mV逐漸去極至+60mV可見去極化程度與電流強(qiáng)弱呈正相關(guān)。鉀通道阻斷劑4-氨基吡啶（4-Ap）可以選擇性抑制這一外向電流。（3）瞬時(shí)外向鉀通道（IA或Ito）也是一電壓門控的鉀通道，膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件六、與膜片鉗技術(shù)相結(jié)合的其它研究方法隨著膜片鉗技術(shù)的廣泛應(yīng)用，相繼出現(xiàn)了一些與膜片鉗技術(shù)相結(jié)合的其它研究方法，特別是與克隆技術(shù)、激光共聚焦技術(shù)及RT-PCR等技術(shù)結(jié)合的方法，有力地推動(dòng)了離子通道的結(jié)構(gòu)與功能、細(xì)胞內(nèi)鈣來源和機(jī)制以及通道組分基因表達(dá)和功能的研究。六、與膜片鉗技術(shù)相結(jié)合的其它研究方法膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件穿孔膜片鉗記錄穿孔膜片鉗記錄膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)平臺(tái)課思考題

何謂膜片鉗技術(shù)?膜片鉗實(shí)驗(yàn)有幾種基本模式?近年該技術(shù)的應(yīng)用有何新進(jìn)展?膜片鉗技術(shù)平臺(tái)課思考題何謂膜片鉗技術(shù)?膜片鉗實(shí)謝謝！謝謝！知識(shí)回顧KnowledgeReview知識(shí)回顧KnowledgeReview膜片鉗技術(shù)講座

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室李玉榮膜片鉗技術(shù)講座哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室李玉榮

在<膜片鉗技術(shù)及應(yīng)用>一書的序言中寫道：通常，一篇非常專業(yè)的科技論文公開發(fā)表后，若被其他的論文引用數(shù)次，其作者就會(huì)感到欣慰；假如被別的作者引用十次以上，就可稱得上是一篇好論文；要是有幸被引用幾十上百次，甚至幾百次，那它無疑是一篇高質(zhì)量杰作，通常發(fā)表在權(quán)威的專業(yè)期刊或者是著名的科學(xué)雜志上，如“Nature”，“Science”，“Cell”和“Neuron”等。在<膜片鉗技術(shù)及應(yīng)用>一書的序言中寫道：

然而，你是否知道？有一篇論文，它的作者當(dāng)時(shí)還不太有名，刊登的雜志也不算頂級(jí)，可是論文發(fā)表20年來，已神話般地被世界各地的科技工作者引用了一萬二千余次，遍及生物醫(yī)學(xué)的眾多領(lǐng)域，而且近年來還在以平均每年約一千多篇的速度繼續(xù)被引用，它就是由Hamill，Marty，Neher，Sakmann和Sigworth等五人于1981年發(fā)表在《歐洲生理學(xué)雜志》（PflugersArchiv.）上的著名論文<ImprovedPath-ClampTechniguesforHigh-ResolutionCurrentRecordingfromCellsandCell-freeMembranePatches>。在此之前五年，身為德國(guó)科學(xué)家的Neher和Sakmann共同發(fā)明了膜片鉗技術(shù)（1976），并于15年后共同榮獲1991年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。膜片鉗技術(shù)的作用和影響由此可見一斑。然而，你是否知道？有一篇論文，它的作者當(dāng)時(shí)還生物電現(xiàn)象研究簡(jiǎn)史生物電現(xiàn)象研究簡(jiǎn)史18世紀(jì)末，意大利醫(yī)生和生理學(xué)家Galvani首先在生物體(蛙)發(fā)現(xiàn)了生物電現(xiàn)象。1902年，Bernstein提出了細(xì)胞生物電產(chǎn)生的膜學(xué)說。1936年，英國(guó)劍橋Young描述了頭足軟體動(dòng)物槍烏賊支配其外套膜肌的巨大軸突直徑可達(dá)1mm。18世紀(jì)末，意大利醫(yī)生和生理學(xué)家Galvani首先在生物體(1939年，Hodgkin和Huxley

把槍烏賊巨軸突用于細(xì)胞內(nèi)膜電位的記錄，首次記錄到膜兩側(cè)的靜息電位。這一工作的意義在于實(shí)驗(yàn)測(cè)定的靜息電位與根據(jù)細(xì)胞膜內(nèi)外鉀濃度經(jīng)Nernst公式計(jì)算的鉀平衡電位非常接近，從而有力地支持了Bernstein關(guān)于靜息狀態(tài)下細(xì)胞膜對(duì)鉀離子有選擇性通透的膜學(xué)說。1939年，Hodgkin和Huxley把槍烏賊巨軸突用于1955年，Hodgkin和Keens在研究神經(jīng)軸突膜對(duì)鉀離子通透性時(shí)發(fā)現(xiàn)，放射性鉀跨軸突膜的運(yùn)動(dòng)很像是通過許多狹窄孔洞的運(yùn)動(dòng)，并提出了“通道”（channel）的概念。細(xì)胞膜對(duì)離子通道的通透性（膜電導(dǎo)）的直接測(cè)定是從應(yīng)用電壓鉗（voltageclamp）技術(shù)以后開始的。1955年，Hodgkin和Keens在研究神經(jīng)軸突膜對(duì)鉀離

電壓鉗技術(shù)是1949年Cole及Marmont設(shè)計(jì)的，后經(jīng)Hodgkin、Huxley和Katz等加以改進(jìn)，并成功地應(yīng)用于槍烏賊巨軸突動(dòng)作電位期間離子電流的研究。他們直接測(cè)定了膜電流并分析了電流的離子成分，推算出動(dòng)作電位期間鈉電導(dǎo)和鉀電導(dǎo)的變化。極大的推動(dòng)離子通道的研究工作，其中的基本概念至今仍被沿用。鑒于Hodgkin、Huxley和Eccles對(duì)通道研究的突出貢獻(xiàn)，獲得1963年諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)。電壓鉗技術(shù)是1949年Cole及Marmont設(shè)計(jì)的A.L.Hodgkin1914~1998A.F.Huxley

1917~A.L.HodgkinA.F.Huxley1972年Katz通過記錄神經(jīng)肌接頭終板膜上乙酰膽堿噪聲，發(fā)現(xiàn)ACh的量子性釋放引起的終板電位及微終板電位，指出其與離子通道的電導(dǎo)、開放時(shí)間及開放頻率的對(duì)應(yīng)關(guān)系，獲1970年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1972年Katz通過記錄神經(jīng)肌接頭終板膜上乙酰膽1976年Neher和Sakmann完成電極與膜之間50MΩ的封接，首次記錄到去神經(jīng)蛙肌纖維膜上的單通道電流，為證實(shí)生物膜離子單通道是以全或無規(guī)律、隨機(jī)開放關(guān)閉的假說提供了有力依據(jù)。

1980年，Neher等利用負(fù)壓吸引實(shí)現(xiàn)了GΩ封接，背景噪聲顯著減低。

1991年膜片鉗技術(shù)的創(chuàng)始人Neher和Sakmann榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)。1976年Neher和Sakmann完成電極與膜PatchclampErwinNeherBertSakmann1944~1942~PatchclampErwinNeher一、離子通道的概念二、離子通道的分子結(jié)構(gòu)三、離子通道的分類四、離子通道的研究技術(shù)五、膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法六、與膜片鉗技術(shù)相結(jié)合的其它研究方法一、離子通道的概念一、離子通道的概念

離子通道（ionchannels）是細(xì)胞上的一種特殊整合蛋白，在脂質(zhì)雙分子層膜上構(gòu)成具有高度選擇性的親水性孔道，允許適當(dāng)大小和電荷的離子以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式通過。一、離子通道的概念離子通道（ionchan

離子通道是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，無論動(dòng)物或植物、單細(xì)胞生物或多細(xì)胞生物的細(xì)胞膜上，都有離子通道存在。離子通道的最基本功能是產(chǎn)生細(xì)胞生物電現(xiàn)象，即與細(xì)胞的興奮性直接相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，才進(jìn)一步派生出神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、腺體的分泌、肌肉的運(yùn)動(dòng)。因此，離子通道是可興奮細(xì)胞膜上的基本興奮單元，具有重要的生理功能。離子通道是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，無論動(dòng)物或植物、單細(xì)膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

離子通道具有兩大共同特征，即離子選擇性及門控特性。前者包括通道對(duì)離子大小的選擇性及電荷選擇性，在一定條件下，某一種離子只能通過與其相應(yīng)的通道跨膜擴(kuò)散，各離子通道在不同狀態(tài)下，對(duì)相應(yīng)的離子的通透性不同，如安靜時(shí)神經(jīng)細(xì)胞膜離子通道對(duì)K+的通透性比Na+大100倍，而神經(jīng)興奮時(shí)，對(duì)Na+通透性又比K+大10~20倍，表明了通道對(duì)離子的選擇性的差異。離子通道具有兩大共同特征，即離子選擇性及門控

離子通道的另一特征是離子通道的門控特性，離子通道一般都具有相應(yīng)的閘門，通道閘門的開啟和關(guān)閉過程稱為門控（gating）。正常情況下，通道大多處于關(guān)閉狀態(tài)，只有在特定的條件下，通道的閘門才能開啟，引起離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。一般認(rèn)為，不同信號(hào)控制其開放和關(guān)閉，通道可表現(xiàn)為三種狀態(tài)，正常情況下，通道處于備用狀態(tài)，在外界因素作用下，通道允許某種或某些離子順濃度差和電位差通過膜，相當(dāng)于通道開放，稱為激活（activation）。通道的失活（inactivation）是與通道關(guān)閉不完全相同的功能狀態(tài)。離子通道的另一特征是離子通道的門控特性，離子通二、離子通道的分子結(jié)構(gòu)

隨著生物物理學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，新的研究技術(shù)的應(yīng)用，特別是膜片鉗片技術(shù)與分子克隆、基因突變和異體表達(dá)等技術(shù)的結(jié)合，使徘徊多年的離子通道研究迅速進(jìn)入到分子、亞分子水平，人們已有能力從分子水平來確定通道的分子結(jié)構(gòu)和解釋離子通道的孔道特性。二、離子通道的分子結(jié)構(gòu)隨著生物物理學(xué)和分子生１．電壓門控離子通道的基本結(jié)構(gòu)

經(jīng)純化、克隆和測(cè)定表明，離子通道蛋白是由多個(gè)亞基構(gòu)成的復(fù)合體。電壓門控離子通道由α、β、γ、δ等亞基構(gòu)成，但不同的離子通道的組成略有差異，如鈉通道由α、β1和β2亞基組成，鈣通道由α1、α2、β、γ和δ亞基組成，鉀通道由α和β亞基組成等。在各亞基中，α亞基是構(gòu)成離子通道的主要功能單位，而其它亞基則只起調(diào)節(jié)作用。１．電壓門控離子通道的基本結(jié)構(gòu)經(jīng)純化、α亞基是一條跨膜多肽，由1800~2000個(gè)氨基酸組成。它包括四個(gè)跨膜功能區(qū)（Ⅰ~Ⅳ），每個(gè)功能區(qū)含有約300個(gè)氨基酸，組成的6個(gè)α螺旋區(qū)段（S1~S6）,除S4為親水性跨膜螺旋片段外，其余5個(gè)均為疏水性跨膜螺旋片段。在膜外側(cè)面有連接糖基的部位和毒素的結(jié)合位點(diǎn)；在膜內(nèi)側(cè)則有蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)。位于S5和S6間的一段氨基酸序列部分貫穿膜內(nèi)，是形成親水性孔道而使離子選擇性通過的部分稱為孔道區(qū)（poreregion）或P區(qū)，四個(gè)功能區(qū)圍繞一個(gè)中心對(duì)稱排列，P區(qū)在內(nèi)組成孔道內(nèi)壁。S4肽段含有一些帶正電荷的氨基酸殘基（如精、賴氨酸），對(duì)膜電位的變化敏感，起電壓感受器的作用。α亞基是一條跨膜多肽，由1800~2000個(gè)膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

當(dāng)膜去極化時(shí)，每一個(gè)功能區(qū)的S4肽段做螺旋運(yùn)動(dòng)而使正電荷移出產(chǎn)生微弱而短暫的門控電流，導(dǎo)致通道構(gòu)象變化。當(dāng)四個(gè)功能區(qū)S4肽段均發(fā)生這種構(gòu)象變化時(shí)，則通道便處于激活開放狀態(tài)，因此，S4肽段又稱為激活閘門（activationgate,m閘門）在通道開放后，很快Ⅲ功能區(qū)的S6與Ⅳ功能區(qū)的S1之間的肽鏈構(gòu)成失活閘門（inactivationgate,h閘門），形成一“活瓣”，將通道內(nèi)口阻塞，調(diào)控通道的失活過程。當(dāng)膜去極化時(shí)，每一個(gè)功能區(qū)的S4肽段做螺旋運(yùn)膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

鉀通道根據(jù)分子生物學(xué)分類為KV和KIR兩大類，分別對(duì)應(yīng)于功能性分類中的外向整流和內(nèi)向整流鉀通道。KV類又分為KV1、KV2、KV3和KV4四組，每組又按發(fā)現(xiàn)克隆的次序先后進(jìn)一步分類，如KV0、KV1.2、KV1.5等。除KV1.4為瞬時(shí)外向鉀通道（KA）外，其余在功能上都屬于或接近于延遲整流鉀通道。在結(jié)構(gòu)上KV類鉀通道由4個(gè)亞基構(gòu)成，每個(gè)亞基僅有一個(gè)功能區(qū)，由6個(gè)跨膜區(qū)段組成。因此，電壓門控鉀通道的一個(gè)亞基相當(dāng)于鈉通道和鈣通道的一個(gè)跨膜區(qū)。鉀通道根據(jù)分子生物學(xué)分類為KV和KIR兩大類KIR類鉀通道不同于KV類和鈉、鈣通道，其每個(gè)α亞基只有兩個(gè)跨膜肽類（M1和M2），其間由H5連接，因M1、M2和H5的序列與KV類的S5、S6相似，所以這兩類鉀通道可能具有相同的基本孔道結(jié)構(gòu)。由于沒有S4樣結(jié)構(gòu)，其電壓門控機(jī)制可能與M2上帶負(fù)電荷的氨基酸殘基有關(guān)。

KIR類鉀通道不同于KV類和鈉、鈣通道，其每２．化學(xué)門控離子通道的基本結(jié)構(gòu)

當(dāng)各種化學(xué)物質(zhì)與化學(xué)門控離子通道相應(yīng)部位結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致通道蛋白發(fā)生構(gòu)型變化，引起通道開放，產(chǎn)生離子電流。體內(nèi)這種離子通道的種類很多，主要包括各種神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道、ATP敏感鉀通道和鈣依賴性鉀通道等。神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道又稱為離子通道受體，主要有乙酰膽堿門控離子通道、GABA門控離子通道及谷氨酸門控離了通道三大類。

２．化學(xué)門控離子通道的基本結(jié)構(gòu)當(dāng)各種化學(xué)物質(zhì)乙酰膽堿門控離子通道

由α1γα2βδ五個(gè)亞基組成，呈五邊形排列。每個(gè)亞基有4個(gè)跨膜區(qū)段即M1~4。其中M2跨膜區(qū)段中除疏水性氨基酸外，還間斷出現(xiàn)少量的絲氨酸和蘇氨酸，它們排列在α螺旋的一側(cè)，由五個(gè)亞基的M2共同構(gòu)成孔道的內(nèi)壁。每個(gè)亞基的N端和C端都朝向膜外，其中α1和α2亞基N端的細(xì)胞外部分各有一個(gè)ACh結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)兩個(gè)ACh分子與α亞基結(jié)合后，便引起通道蛋白的構(gòu)象變化和通道開放，主要引起Na+內(nèi)流增多。乙酰膽堿門控離子通道由α1γα2βδ五個(gè)

近來研究表明，一些神經(jīng)遞質(zhì)也可以通過與膜受體結(jié)合后，激活細(xì)胞膜內(nèi)的G蛋白，通過G蛋白α亞基或βγ亞基直接調(diào)節(jié)離子通道的活動(dòng)。也可以通過G蛋白耦聯(lián)受體生成第二信使，進(jìn)而影響離子通道的活性。近來研究表明，一些神經(jīng)遞質(zhì)也可以通過與膜受體膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件三、離子通道的分類非門控離子通道門控離子通道電壓門控性通道化學(xué)門控性通道機(jī)械門控性通道三、離子通道的分類非門控離子通道

1、非門控性離子通道

有些離子通道始終處于開放狀態(tài)，離子可隨時(shí)進(jìn)出細(xì)胞，并不受外界信號(hào)的明顯影響，這些通道稱為非門控離子通道。如神經(jīng)和肌肉細(xì)胞在安靜狀態(tài)下靜息電位的產(chǎn)生，是由于細(xì)胞膜上的離子通道允許K+自由進(jìn)出細(xì)胞，而引起的K+電化學(xué)平衡電位，此種K+通道即屬于非門控性離子通道。1、非門控性離子通道有些離子通道始終處于

2、電壓門控離子通道

電壓門控離子通道（voltage-gatedionchannels）的開啟或關(guān)閉受膜電位的變化決定，具有電壓依賴性，同時(shí)通道往往還與電位變化的時(shí)程有關(guān)，即具有時(shí)間依賴性。這類通道在決定細(xì)胞的興奮性、不應(yīng)期和傳導(dǎo)性以及維持細(xì)胞正常體積等方面發(fā)揮重要作用。電壓門控離子通道一般以最容易通過的離子命名，如鈉離子通道、鈣離子通道及鉀離子通道等。2、電壓門控離子通道電壓門控

電壓門控鈉離子通道

鈉離子通道（sodiumchannels，簡(jiǎn)稱鈉通道），是選擇性地容許Na+跨膜通過的離子通道。根據(jù)其對(duì)鈉通道阻滯劑河豚毒素（tetrodotoxin,TTX）和μ-食魚螺毒素（μ-conotoxin,μ-CTX）的敏感性不同分為神經(jīng)類、骨骼肌類和心肌類鈉通道三類。

電壓門控鈉離子通道鈉離子通道（sod電壓門控鈣離子通道

鈣離子通道（calciumchannels，簡(jiǎn)稱鈣通道）是選擇性容許Ca2+跨膜通過的離子通道。TsienRW等根據(jù)肌細(xì)胞和神經(jīng)元電壓門控離子通道對(duì)膜電位變化的敏感性，將神經(jīng)元質(zhì)膜電壓門控鈣離子通道分為T（transient）、L（longlasting）及N（neitherT,norL）三種類型，后來應(yīng)用不同的毒素阻斷鈣電流的某種特定的成分，在神經(jīng)元又增加了P（purkinje）、Q和R型，共6型。

電壓門控鈣離子通道鈣離子通道（calciumchan電壓門控鉀離子通道

鉀離子通道（potassiumchannels，簡(jiǎn)稱鉀通道）是廣泛存在、種類最多、最為復(fù)雜的一大類離子通道，僅電壓門控鉀通道就已克隆出幾十種亞型，根據(jù)其電流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)可分為延遲外向整流鉀通道、瞬時(shí)外向鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道三類。電壓門控鉀離子通道鉀離子通道（potassiumch3、化學(xué)門控離子通道

化學(xué)門控離子通道（chemicallygatedionchannels）又稱配體門控通道（ligandgatedchannels）。這一類通道的門控行為主要受其相應(yīng)配體的控制，配體是包括神經(jīng)遞質(zhì)、激素等各種激動(dòng)劑和阻滯劑在內(nèi)的多種化學(xué)因素。當(dāng)激動(dòng)劑與化學(xué)門控離子通道結(jié)合后，會(huì)引起通道蛋白構(gòu)型變化，導(dǎo)致通道開放，產(chǎn)生離子電流。3、化學(xué)門控離子通道化學(xué)門控離子通道（chemical神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道也稱為離子通道型受體，其結(jié)構(gòu)中具有與神經(jīng)遞質(zhì)特異性結(jié)合的位點(diǎn)，當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)與其結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，將引起通道開放。神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道主要包括乙酰膽堿門控離子通道、GABA門控離子通道和谷氨酸門控離子通道三大類。

神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道也稱為離子通道型受體，其結(jié)構(gòu)中具有與4、機(jī)械門控離子通道

機(jī)械門控離子通道（mechanicallygatedionchannels）是由機(jī)械牽拉激活的離子通道，主要見于觸覺和聽覺感受器，如機(jī)械刺激作用于蝦類牽張感受引起通道開放，出現(xiàn)Na+內(nèi)流和K+外流，產(chǎn)生感受器電位；聲波傳入內(nèi)耳后，引起內(nèi)耳毛細(xì)胞頂端纖毛發(fā)生彎曲或偏斜，從而使毛細(xì)胞頂端機(jī)械門控通道開放，陽(yáng)離子內(nèi)流產(chǎn)生聽覺的感受電位。4、機(jī)械門控離子通道機(jī)械門控離子通道（mechanic

5、其它門控離子通道除上述離子通道外，尚發(fā)現(xiàn)具有其它門控特性的離子通道存在，如細(xì)胞容積敏感的鉀通道（Kvol）在細(xì)胞腫脹時(shí)通道開放；

Na+激活鉀通道（KNa）對(duì)電壓、細(xì)胞內(nèi)ATP濃度及細(xì)胞內(nèi)鈣均不敏感，只有細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高到20mmol/L以上時(shí)開放。5、其它門控離子通道除上述離子通道外，尚發(fā)現(xiàn)具有其四、離子通道的研究技術(shù)

四、離子通道的研究技術(shù)

在進(jìn)行細(xì)胞電生理研究中，最重要的物理學(xué)定律是歐姆定律（Ohm’sLaw）。當(dāng)電流（I）流經(jīng)一電阻（R）時(shí)，會(huì)在其兩端產(chǎn)生電位差（V），即V=IR。此時(shí)，電流與電壓的關(guān)系（I-V）是一條通過原點(diǎn)的直線，其斜率即為該通道的電導(dǎo)，這是適用于線性系統(tǒng)的歐姆定律，而生物系統(tǒng)并非線性系統(tǒng)，只是應(yīng)用歐姆定律進(jìn)行近似的描述。在進(jìn)行細(xì)胞電生理研究中，最重要的物理學(xué)定律是

1、電壓鉗技術(shù)的基本原理

電壓鉗技術(shù)是通過一個(gè)反饋電路使膜電位保持在指定的水平，當(dāng)離子通道開放產(chǎn)生跨膜電流，導(dǎo)致膜電位改變時(shí)，可通過反饋電路經(jīng)微電極向胞內(nèi)注入電流，補(bǔ)充的電流量正好等于跨膜流出的反向離子流，使膜通透性發(fā)生改變時(shí)膜電位保持不變，此時(shí)注入電流的變化就可反應(yīng)膜電導(dǎo)或膜電流的改變。電壓鉗技術(shù)工作原理如示意圖：1、電壓鉗技術(shù)的基本原理電壓鉗技術(shù)是通過一個(gè)反饋電膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件2、膜片鉗技術(shù)的基本原理

膜片鉗技術(shù)是在電壓鉗技術(shù)基礎(chǔ)上，以記錄通過離子通道的離子電流來研究細(xì)胞膜上單個(gè)（或多個(gè)）離子通道分子活動(dòng)的電生理技術(shù)。膜片鉗技術(shù)可用一根玻璃微電極同時(shí)完成膜片（或全細(xì)胞）電位的監(jiān)測(cè)、鉗制及通道電流的記錄。2、膜片鉗技術(shù)的基本原理膜片鉗技術(shù)是在電壓鉗技術(shù)基礎(chǔ)上，

隨著該技術(shù)的逐漸完善及應(yīng)用，目前已成為從功能角度探討各種生理、病理生理及藥物作用機(jī)制最直接、最理想的電生理學(xué)研究方法，也為多學(xué)科探討生命活動(dòng)規(guī)律、疾病與轉(zhuǎn)歸機(jī)理及藥物作用等細(xì)胞和分子水平的研究，開辟了廣泛前景。隨著該技術(shù)的逐漸完善及應(yīng)用，目前已成為從功能

膜片鉗技術(shù)是用尖端直徑1~2μm的玻璃微電極尖端與酶處理干凈的細(xì)胞膜接觸，通過20~30cmH2O的負(fù)壓吸引造成電極尖端與細(xì)胞膜形成高阻封接（10~100GΩ），使電極尖端下的小塊膜片與膜的其它部分在電學(xué)上絕緣，并在此基礎(chǔ)上固定膜片電位，監(jiān)測(cè)幾個(gè)μm2膜片上1~3個(gè)離子通道活動(dòng)的方法。膜片鉗技術(shù)具有1pA的電流分辨率,10μs

的時(shí)間分辨率和1μm2的空間分辨率，從而使其成為在活體細(xì)胞上進(jìn)行電生理學(xué)研究的重要手段。膜片鉗技術(shù)是用尖端直徑1~2μm的玻璃微電極尖端與酶處理膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

3、膜片鉗記錄的模式

根據(jù)研究需要及記錄膜片的不同，膜片鉗記錄可形成以下四種基本模式

1.細(xì)胞貼附式（cellattachedpatch）

2.內(nèi)面向外式（inside-outpatch）

3.外面向外式（outside-outpatch）

4.全細(xì)胞記錄式（wholecellrecording）

3、膜片鉗記錄的模式根據(jù)研究需要及記錄膜膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

4、膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的組建

膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)雖然可因研究目的不同而有所區(qū)別，但其基本組成是相同的，包括膜片鉗放大器和接口，顯微鏡和視頻監(jiān)視器以及防震臺(tái)和屏蔽罩等。

4、膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的組建膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)雖然膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件視頻監(jiān)視器溫度控制系統(tǒng)倒置顯微鏡探頭微操縱器模數(shù)轉(zhuǎn)換器膜片鉗放大器數(shù)據(jù)采集及分析軟件計(jì)算機(jī)視頻監(jiān)視器溫度控制系統(tǒng)倒置顯微鏡探頭微操縱器模數(shù)轉(zhuǎn)換器膜片鉗五、膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法

膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法包括：微電極的制備、細(xì)胞標(biāo)本的制備、高阻封接的形成、離子單通道電流的記錄或全細(xì)胞記錄五、膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法包括：膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

1、微電極的制備微電極是用拉制器由玻璃毛細(xì)管拉制而成。玻璃微電極的選材和拉制質(zhì)量直接影響封接電阻及記錄時(shí)的噪聲大小。

（1）選材膜片鉗實(shí)驗(yàn)用微電極可根據(jù)不同記錄模式選用不同的玻璃毛細(xì)管拉制。從玻璃毛細(xì)管材料方面,可分為軟質(zhì)玻璃和硬質(zhì)玻璃兩類。1、微電極的制備微電極是用拉制器由玻璃毛細(xì)管拉制而成（2）拉制膜片鉗實(shí)驗(yàn)用微電極與細(xì)胞外記錄和細(xì)胞內(nèi)記錄用微電極不同，其尖端較短，錐度較大，尖端直徑為1~5μm，充灌林格氏液時(shí)阻抗約1~5MΩ，因此一般采用兩步拉制法。第一步將玻璃軟化，拉出一個(gè)長(zhǎng)7~10mm、直徑200~400μm的桿，第二步再?gòu)臈U中央以較小電流拉出兩根尖端錐度較大的微電極。（2）拉制膜片鉗實(shí)驗(yàn)用微電極與細(xì)胞外記錄和細(xì)胞內(nèi)記錄用微（3）處理微電極拉制成功后，其尖端需進(jìn)一步處理。這一過程包括涂硅酮樹酯（sylgardcoating）和熱拋光（heatpolish）。前者是將硅酮樹酯涂于微電極尖端以外部分，然后加熱使其烘干固化，達(dá)到使浸入浴液中的微電極表面呈疏水性，減小電極內(nèi)部與溶液之間的電容。熱拋光是在顯微鏡下，將微電極尖端接近熱源，使電極尖端表面變得更加寬闊和光滑，同時(shí)也使粘涂到電極尖端的Sylgard被燒掉或蒸發(fā)。經(jīng)熱拋光處理的微電極可使高阻封接的成功率明顯提高。（3）處理微電極拉制成功后，其尖端需進(jìn)一步處理。這一過程（4）充灌微電極使用前要充灌電極內(nèi)液，電極內(nèi)液需經(jīng)0.2μm的濾膜或?yàn)V紙過濾。充灌時(shí)首先將電極尖端浸入電極內(nèi)液，利用虹吸作用使尖端部分充滿液體，然后再?gòu)碾姌O尾端充灌。在充灌中應(yīng)避免電極內(nèi)出現(xiàn)氣泡，如有氣泡可使電極尖端向下，輕敲管壁除去。也應(yīng)避免充灌電極內(nèi)液太多，否則影響實(shí)驗(yàn)噪聲基線。（4）充灌微電極使用前要充灌電極內(nèi)液，電極內(nèi)液需經(jīng)0.22、細(xì)胞標(biāo)本的制備除腦片膜片鉗和盲膜片鉗法之外，實(shí)驗(yàn)所需標(biāo)本均為具有生物活性的單個(gè)離體細(xì)胞，其來源包括急性分離、原代和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。從理論上來講，膜片鉗實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞標(biāo)本可來自體內(nèi)各種組織細(xì)胞，只要細(xì)胞表面光滑，能與微電極尖端形成高阻封接即可。但在標(biāo)本制備上，不同組織細(xì)胞間聯(lián)接牢固程度不同，采用的分離方法也不完全相同。大體上包括沖洗、酶解消化或機(jī)械分離及清洗等步驟。2、細(xì)胞標(biāo)本的制備除腦片膜片鉗和盲膜片鉗法之外，實(shí)驗(yàn)所需3、高阻封接的形成

高阻封接形成與否是記錄細(xì)胞離子通道電流能否成功的前提，是進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵一步。微電極尖端與細(xì)胞膜形成封接的過程，可以采用軟件或刺激器發(fā)出1mV脈沖電壓作用于微電極，造成膜兩側(cè)電位差發(fā)生變化，產(chǎn)生電極電流，再通過示波器或顯示屏，觀察電極電流幅度的變化來確定封接程度。在電極未入溶液之前，在顯示器或示波器上可見一直線。

3、高阻封接的形成膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件進(jìn)行高阻封接時(shí)，需注意的是：①在微電極未入液之前常施以正壓，使電極內(nèi)有液體從電極尖端流出，防止浴液表面灰塵或溶液中粒子附著于電極尖端，影響高阻封接。②電極尖端與細(xì)胞膜接觸，稍加負(fù)壓后電流波形變得平坦，此時(shí)，如使電極超極化，則有助于加速形成高阻封接。③電極入液后封接的成功率與入浴液后的時(shí)間呈反比，電極內(nèi)液中的肽類或蛋白質(zhì)成分也會(huì)有礙于封接形成。進(jìn)行高阻封接時(shí)，需注意的是：

4、離子通道電流的記錄4、離子通道電流的記錄

單通道記錄

離子單通道電流的記錄是膜片鉗技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)，當(dāng)尖端直徑為1μm的玻璃微電極與細(xì)胞膜形成高阻封接后，電極尖端下的一小塊膜片上，僅含有一個(gè)或幾個(gè)離子通道，根據(jù)單通道電流的特征，很容易得到對(duì)某種離子有選擇性通透的單一的離子通道電流。由于單通道電流大小僅為1pA（10-12A）左右，要記錄到這一微小電流，除盡量降低膜片鉗系統(tǒng)噪聲及電極噪聲外，良好的高阻封接是獲得低噪聲記錄的先決條件，電阻值愈大，噪聲電流愈小。單通道記錄離子單通道電流的記錄是膜片鉗技術(shù)的最大優(yōu)膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

全細(xì)胞記錄

全細(xì)胞記錄是膜片鉗四種基本模式之一。盡管它記錄的是細(xì)胞膜多個(gè)離子通道開放產(chǎn)生的宏膜電流，但由于該模式既可以對(duì)離子通道的性質(zhì)和分類進(jìn)行宏觀性質(zhì)的分析，也可以對(duì)離子通道的構(gòu)造、分布與功能進(jìn)行微觀性質(zhì)的分析。還可以通過測(cè)量膜電容對(duì)細(xì)胞分泌活動(dòng)進(jìn)行研究，從而使其成為當(dāng)前電生理研究中應(yīng)用最廣泛的一種模式。全細(xì)胞記錄

全細(xì)胞記錄是膜片鉗四種基本模式之一。盡

全細(xì)胞記錄模式可用于測(cè)定在某個(gè)時(shí)間和電壓情況下，離子通道電流的大小，觀察其電壓依賴性特征，如以膜電位為橫座標(biāo)，電流強(qiáng)度為縱座標(biāo)，則可繪制出電流-電壓關(guān)系曲線（I-V曲線）。在電流為零時(shí)的膜電位被稱為反轉(zhuǎn)電位。其大小取決于膜兩側(cè)的離子濃度及通道的離子選擇性，反映了某種通道的電壓依賴性及藥物等因素對(duì)通道電壓依賴性的影響，常作為全細(xì)胞記錄模式結(jié)果分析的指標(biāo)之一。

全細(xì)胞記錄模式可用于測(cè)定在某個(gè)時(shí)間和電壓情況下，離子通道膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件此外，由于電壓門控通道的電壓依賴性，在膜電位出現(xiàn)階梯狀改變時(shí)，可以記錄到一個(gè)過渡電流即尾電流（tailcurrent）。由于全細(xì)胞電流是通過每個(gè)離子通道電流的總和，而離子通道又隨時(shí)間的推移呈概率性關(guān)閉，因此尾電流的強(qiáng)度也隨全細(xì)胞電流強(qiáng)度的變化而按指數(shù)相關(guān)數(shù)衰減，測(cè)定尾電流強(qiáng)度的變化也可作為結(jié)果分析的指標(biāo)之一。此外，由于電壓門控通道的電壓依賴性，在膜電位出現(xiàn)階梯狀膜片鉗技術(shù)(研究生平臺(tái)課)課件

鈉通道在多種細(xì)胞尤其是在神經(jīng)、肌肉等可興奮細(xì)胞中廣泛存在。鈉通道激活可導(dǎo)致Na+快速內(nèi)流、細(xì)胞去極化，產(chǎn)生動(dòng)作電位的上升支，因此，鈉通道的活性對(duì)細(xì)胞的功能有重要的影響。鈉通道的激活是電壓門控的，當(dāng)細(xì)胞膜去極化至-60mV左右時(shí)，即可引起膜上大量鈉通道激活。產(chǎn)生一迅速激活并迅速失活的內(nèi)向電流，當(dāng)去極化至-30mV左右時(shí)達(dá)到最大，反轉(zhuǎn)電位為+30mV左右。當(dāng)靜息膜電位升至-50mV左右，可使Na+通道完全失活，不能引起鈉通道開放。鈉通道電流的測(cè)定

鈉通道電流的測(cè)定在參數(shù)設(shè)計(jì)上應(yīng)使保持電位鉗制在-80mV以下，此時(shí)給予不同程度的去極化階躍電