抗體工程蛋白質(zhì)工程培訓(xùn)課件

抗體工程蛋白質(zhì)工程抗體工程蛋白質(zhì)工程1（優(yōu)選）抗體工程蛋白質(zhì)工程（優(yōu)選）抗體工程蛋白質(zhì)工程2淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體3抗體工程蛋白質(zhì)工程培訓(xùn)課件4如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。利用腫瘤細(xì)胞無限增殖的特性。利用細(xì)胞融合的技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有B淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞。利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。5單克隆抗體的概念由單個雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖,也就是通過克隆，形成細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。單克隆抗體的概念6

單克隆抗體制備過程

注射抗原B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、篩選雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體如何獲得融和細(xì)胞？如何得到單個融和細(xì)胞？如何篩選雜交瘤細(xì)胞？鑒別是否分泌所需抗體?單克隆抗體制備過程注射抗原B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融7雜交瘤細(xì)胞的篩選(1)骨髓瘤細(xì)胞為HGPRT基因缺陷型細(xì)胞，不能合成DNA。需經(jīng)應(yīng)急途徑合成DNA。HAT培養(yǎng)基含有次黃嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶。氨基喋呤可阻斷骨髓瘤細(xì)胞的應(yīng)急DNA合成。所以骨髓瘤細(xì)胞不能在HAT培養(yǎng)基中生長存活.B淋巴細(xì)胞具有HGPRT基因但不能在體外生長。利用這兩種細(xì)胞各自的特點，篩選能在體外含HAT的培養(yǎng)基中生長的融合子。HGPRT:次黃嘌呤核糖磷酸轉(zhuǎn)移酶

HAT：次黃嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶雜交瘤細(xì)胞的篩選(1)骨髓瘤細(xì)胞為HGPRT基因缺陷型細(xì)胞，8雜交瘤細(xì)胞的篩選(2)雜交瘤細(xì)胞的篩選(2)9抗體工程蛋白質(zhì)工程培訓(xùn)課件10整個制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤細(xì)胞第二次篩選（克隆化培養(yǎng)和抗體檢測）：篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。整個制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)11思考：1、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物細(xì)胞培養(yǎng)原理2、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合？這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體思考：1、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物12鑒定后的雜交瘤細(xì)胞可大規(guī)模培養(yǎng)，收集上清提取單克隆抗體，也可免疫小鼠腹腔，抽取腹水來制備相應(yīng)的McAb，但生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)量均受限制。鑒定后的雜交瘤細(xì)胞可大規(guī)模培養(yǎng)，收集上清提取單克隆抗體，也可13單克隆抗體的優(yōu)勢1．高特異性，針對一個抗原靶點。。2．高純度，成份均一，來自一個克隆。3．高效價，抗體的滴度高。4．高效益，國際上近100億美元市場。5．易制備。6．前景好，McAb1995問世后，風(fēng)糜全球，寄予厚望。單克隆抗體的優(yōu)勢1．高特異性，針對一個抗原靶點。。14單克隆抗體應(yīng)用領(lǐng)域1．McAb作為診斷試劑應(yīng)用這是目前應(yīng)用最廣的領(lǐng)域，目前已有許多成套的診斷試劑盒在診斷傳染病，代謝病和免疫性疾病中應(yīng)用，取得良好經(jīng)濟和社會效益，全世界有上百億市場。舉例早孕試紙，乙肝診斷試劑盒單克隆抗體應(yīng)用領(lǐng)域1．McAb作為診斷試劑應(yīng)用15（α-FcγRI-RicinA）從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體。鑒定后的雜交瘤細(xì)胞可大規(guī)模培養(yǎng)，收集上清提取單克隆抗體，也可免疫小鼠腹腔，抽取腹水來制備相應(yīng)的McAb，但生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)量均受限制。直接法：直接測定多肽鏈的氨基酸順序。選擇目的抗體把含有抗體的噬菌體培養(yǎng)上清加到抗原固相柱上，使表面呈現(xiàn)特異性抗體的噬菌體與抗原特異性結(jié)合，洗去未結(jié)合的噬菌體。即可獲得含量豐富、種類眾多的單一抗體技術(shù)。2．噬菌體表達(dá)載體的構(gòu)建蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程。化學(xué)交聯(lián)法基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL為了模擬此選擇作用，在體外用固化抗原柱篩選噬菌表面抗體，再利用噬菌體能感染大腸桿菌特性，確重新感染細(xì)菌進(jìn)行擴增。將編碼一種蛋白質(zhì)的部分基因移植到另一種蛋白質(zhì)基因上，或?qū)⒉煌鞍踪|(zhì)基因的片段組合在一起，經(jīng)基因克隆和表達(dá)，產(chǎn)生出新的融合蛋白質(zhì)。將抗體VH和VL（重鏈和輕鏈可變區(qū)）通過一個連接肽連接而成的小分子抗體，以體外人結(jié)腸腺癌細(xì)胞和多形膠質(zhì)瘤細(xì)胞為模型，采用3H－胸腺嘧啶核苷摻入法證明該融合蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性顯著高于單純的IFN，通過競爭阻斷實驗證明，抑制活性的增高確由Enk導(dǎo)向區(qū)介導(dǎo)。核磁共振(NMR)光譜——研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。嵌合抗體由于這兩部分在空間結(jié)構(gòu)上相對獨立，其獨特的抗體親和力保持得很好。腫瘤的影像分布用于腫瘤的導(dǎo)向治療化學(xué)合成EnkN端5肽編碼區(qū)，通過連接5肽編碼區(qū)與人α1型IFN基因連接，在大腸桿菌中表達(dá)了這一融合蛋白。2．抗體導(dǎo)向治療

用特異性單抗為載體，將抗瘤藥物、放射性核素以及毒素等毒性物質(zhì)導(dǎo)向性攜帶至腫瘤灶局部，可特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞損傷較輕。將毒素與單抗連接常稱為免疫毒素。常用的毒素包括植物毒素（如蓖麻毒素、苦瓜毒素等）和細(xì)菌毒素（如白喉外毒素、綠膿桿菌外毒素等）。（α-FcγRI-RicinA）2．抗體導(dǎo)向治療16抗體工程蛋白質(zhì)工程培訓(xùn)課件173．McAb作免疫抑制劑應(yīng)用，應(yīng)用于器官移植。當(dāng)前McAb最具代表的是抗TNF單抗治療類風(fēng)濕和回腸炎有效，有20億美元市場。其他在抗腫瘤，抗排異及抗血栓方面也很看好。3．McAb作免疫抑制劑應(yīng)用，應(yīng)用于器官移植。181980年后，其開發(fā)走向下坡路，臨床實驗失敗，股票狂跌，損失以百萬美元計。原因病人過敏及免疫性疾病加重病人病情，體內(nèi)很快排異及對腎臟毒性。但到2000年又有回頭，2001年被認(rèn)為在免疫學(xué)上是“單克隆抗體年”，抗體研究將迅速發(fā)展，現(xiàn)單在治療方面就有10種單抗進(jìn)入市場，3種待批上市，近100種在進(jìn)行臨床試驗階段。當(dāng)然，與McAb技術(shù)改進(jìn)關(guān)系極大。1980年后，其開發(fā)走向下坡路，臨床實驗失敗，股票狂跌，損失19資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺20

問題異源蛋白導(dǎo)致產(chǎn)生抗抗體，影響靶向性和效果在體內(nèi)被清除速度快靶部位攝取的量太低效應(yīng)功能弱產(chǎn)業(yè)化

對策抗體人源化抗體人源化改變抗體分子大小連接毒素、放射性同位素、藥物體外表達(dá)抗體抗體治療存在的問題及對策問題對21基因工程抗體通過基因重組改良抗體性能通過噬菌體抗體庫技術(shù)研制新的抗體基因工程抗體通過基因重組改良抗體性能22免疫球蛋白分子的基本結(jié)構(gòu)免疫球蛋白分子的基本結(jié)構(gòu)23第二節(jié)

鼠單抗人源化第二節(jié)

鼠單抗人源化24●恒定區(qū)人源化——人-鼠嵌合抗體●可變區(qū)人源化——人改型抗體●用抗體庫技術(shù)進(jìn)行人源化●恒定區(qū)人源化——人-鼠嵌合抗體25第一代的抗體人源化—嵌合抗體從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體。嵌合抗體由于這兩部分在空間結(jié)構(gòu)上相對獨立，其獨特的抗體親和力保持得很好。特點減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。缺點因鼠單抗可變區(qū)的存在，應(yīng)用時仍有較強的免疫排斥反應(yīng)第一代的抗體人源化—嵌合抗體26Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞啟動子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略Pr鼠VH人CH27鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細(xì)胞人-鼠嵌合基因工程抗體鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細(xì)胞人-鼠嵌合基因工程抗體28①定點突變注意盡量保護(hù)保守的殘基，特別在高特異性、高活性蛋白操作時更應(yīng)注意。②3ˊ端引物常選J區(qū)保守序列。從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體。建立肽庫（peptidelibrary）。2．噬菌體表達(dá)載體的構(gòu)建4．高效益，國際上近100億美元市場。利用B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。連接細(xì)胞毒性藥物（C1027、柔紅霉素）對天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，你認(rèn)為應(yīng)該直接對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行操作，還是通過對基因的操作來實現(xiàn)？基因定點誘變技術(shù)的常用方法是PCR法?；蚬こ淘谠瓌t上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。中改是對蛋白質(zhì)分子中某些結(jié)構(gòu)單元或肽段進(jìn)行分子裁剪，通過基因操作，在不同的蛋白質(zhì)分子之間替換結(jié)構(gòu)單元，以期得到新的功能組合。比如TNFa抗體與TNFRFc●可變區(qū)人源化——人改型抗體將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。（優(yōu)選）抗體工程蛋白質(zhì)工程玉米中賴氨酸含量可提高數(shù)倍Met/Ala(222),成功地制備出具有耐堿、耐熱以及抗氧化的各種新特性的蛋白酶。從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體。3．抗腫瘤腫瘤和其他疾病的導(dǎo)向治療和資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。第二代的抗體人源化——改型抗體在嵌合抗體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將鼠MAb可變區(qū)中相對保守的FR(frameworkregion)替換成人的FR，保留與抗原結(jié)合部位決定簇互補區(qū)（complementdeterminantregion)部位(即CDR移植)早期的改型抗體簡單的CDR移植，通過點突變進(jìn)行微調(diào)即更換某個位點上的氨基酸。①定點突變注意盡量保護(hù)保守的殘基，特別在高特異性、高活性蛋29CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體鼠單克30第二代改型抗體：①應(yīng)用了人抗體基因庫；②引進(jìn)計算機技術(shù)模擬抗體分子的立體結(jié)構(gòu)(分子模擬法)；③使用了鼠人嵌合FR。其目的是獲得具有高親和力的治療性抗體

第二代改型抗體：3132已批準(zhǔn)上市的單抗適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移植排斥大腸癌冠心病淋巴瘤移植排斥炎癥性腸病、類風(fēng)濕CD317-1A血小板受體ⅡbⅢaCD20CD25TNF-аOKT3PanorexReoProRituxanSimulectRemicade鼠單抗鼠單抗人－鼠嵌合抗體人－鼠嵌合抗體人－鼠嵌合抗體人－鼠嵌合抗體19861995(德國)1994199719981998、199932已批準(zhǔn)上市的單抗適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移3233適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移植排斥乳腺癌RVS感染AMLCLLCD25HER-2RSVF蛋白CD33CD52ZanapaxHerceptinSynagisMylotargCAMPATH人源化抗體人源化抗體人源化抗體人源化抗體－化療藥物交聯(lián)物人源化抗體1997199819982000200133適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移植排斥CD25Z33第三節(jié)

小分子抗體第三節(jié)

小分子抗體34

小分子抗體通過基因重組技術(shù)，可以在保持原有抗原結(jié)合活性的基礎(chǔ)上，把完整的抗體分子改造成較小的分子，稱為小分子抗體。根據(jù)其價數(shù)的不同可分為單價小分子抗體及多價小分子抗體兩種。小分子抗體35單價小分子抗體一、Fab抗體

Fab段由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能。Fab抗體只有完整IgG的1/3。單價小分子抗體36二、單鏈抗體(ScFv)

定義：用基因工程方法，將抗體VH和VL（重鏈和輕鏈可變區(qū)）通過一個連接肽連接而成的小分子抗體，功能：具有較好的抗原結(jié)合能力，且分子量小、穿透力強、免疫原性低等特性?？膳c其他效應(yīng)分子構(gòu)建成多種具有新功能的抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體等的理想而基本的元件。Ag二、單鏈抗體(ScFv)Ag37三、單域抗體

抗體與抗原的結(jié)合主要由Ig的V區(qū)決定，因此只含V區(qū)基因片段的小分子抗體，即只有VH或VL一個功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原單克隆抗體的特異性。這種小分子的抗體片段就稱為單域或單區(qū)抗體，其分子量僅為整個Ig分子的1／12，故也稱之為小抗體。三、單域抗體38四.超變區(qū)多肽

抗體抗原結(jié)合是經(jīng)過補體決定區(qū)（CDR）來實現(xiàn)。因此，CDR是構(gòu)成抗原抗體結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)單位。根據(jù)這一特點，可以設(shè)計出那些在抗原識別及親和力方面有重要意義的CDR多肽，直接用于診斷或治療，可望獲得理想的結(jié)果。這種只含有一個CDR多肽的抗體，稱為超變區(qū)多肽，亦稱為最小識別單位(minimalrecognitionunit,MRU)。四.超變區(qū)多肽39從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體。從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體。蛋白質(zhì)工程(proteinengineering）另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。①5ˊ端引物選Ig前導(dǎo)肽保守序列，5ˊ端引物也可選Ig分子骨架區(qū)1(FR1)的保守序列。直接法：直接測定多肽鏈的氨基酸順序?？膳c其他效應(yīng)分子構(gòu)建成多種具有新功能的抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體等的理想而基本的元件。這種小分子的抗體片段就稱為單域或單區(qū)抗體，其分子量僅為整個Ig分子的1／12，故也稱之為小抗體。核磁共振(NMR)光譜——研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。將抗體VH和VL（重鏈和輕鏈可變區(qū)）通過一個連接肽連接而成的小分子抗體，（2）測定其氨基酸序列；將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。蛋白質(zhì)工程(proteinengineering）連接植物或細(xì)菌毒素（ricin、PE40）基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。④α螺旋，β折疊區(qū)一般不會存在酶的活性中心及底物的結(jié)合中心，只是結(jié)構(gòu)支架?！窨勺儏^(qū)人源化——人改型抗體如CD4免疫粘附素，就是由抗體的Fc段與2個CD4分子的Ig同源區(qū)重組而成

多價小分子抗體在ScFv的基礎(chǔ)上，可以把兩個或兩個以上的ScFv重組在一起，由此可制備成多價小分子抗體即微型抗體（簡稱多價微抗）。其中包括雙鏈抗體(diabody)，微型抗體（minibody），三鏈抗體(triabody)及四鏈抗體(tetrabody)等。

從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（40AgAg雙鏈抗體(diabody)

制備方法化學(xué)交聯(lián)法粘性蛋白結(jié)構(gòu)域融合法接頭長度控制法。AgAg雙鏈抗體(diabody)41微型抗體(minibody)

通過基因工程手段采用不同的接頭把單鏈抗體(VL-VH)的VH結(jié)構(gòu)域與IgG的CH3結(jié)構(gòu)域融合，形成VL-VH-CH3的結(jié)構(gòu)，稱之為微型抗體（minibody）。此種抗體合成后通過CH3結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定二聚體式，發(fā)揮其雙價微抗作用。微型抗體通過基因工程手段采用不同的接頭把單鏈抗42

小分子抗體的應(yīng)用：用于腫瘤的導(dǎo)向治療腫瘤的影像分布基因治療研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系小分子抗體的應(yīng)用：43第四節(jié)

抗體融合蛋白第四節(jié)

抗體融合蛋白44抗體融合蛋白將抗體分子片段與其他蛋白融合，所形成的具有新的特性融合蛋白。根據(jù)構(gòu)建方式的不同，主要分為兩種形式Fc融合蛋白（Fcfusionprotein,FcFP）由抗體的Fc段與某些具有特定功能的蛋白結(jié)構(gòu)域融合而成。如CD4免疫粘附素，就是由抗體的Fc段與2個CD4分子的Ig同源區(qū)重組而成抗原結(jié)合融合蛋白（antigenBindingfusionprotein,ABFP）由具有抗原結(jié)合功能的抗體結(jié)構(gòu)與其他功能性蛋白融合構(gòu)成。如免疫毒素，抗體部分主要包括嵌合抗體、單鏈抗體形式。抗體融合蛋白將抗體分子片段與其他蛋白融合，所形成的具有新的特45免疫毒素又稱生物導(dǎo)彈，是由導(dǎo)向性的載體分子（抗體部分）與具有毒性的彈頭蛋白交聯(lián)而制成，屬于導(dǎo)向藥物的一種。免疫毒素又稱生物導(dǎo)彈，是由導(dǎo)向性的載體分子（抗體部分）與具有46免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARicinA（α-FcγRI-RicinA）RicinA:蓖麻毒素A,對腫瘤細(xì)胞具有毒性作用免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARic47CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2

免疫細(xì)胞因子(Immunocytokine)CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2免疫細(xì)胞48偶連細(xì)胞毒物質(zhì)連接放射性同位素(131I、99mTc）連接植物或細(xì)菌毒素（ricin、PE40）連接細(xì)胞毒性藥物（C1027、柔紅霉素）偶連細(xì)胞毒物質(zhì)連接放射性同位素(131I、99mTc）49免疫粘附素(immunoadhension)將人抗體恒定區(qū)(主要是Fc段)N端連接于人細(xì)胞表面的受體分子或細(xì)胞粘附分子上，在真核細(xì)胞中表達(dá)出正確折疊的融合抗體蛋白分子。Fc段發(fā)揮的作用（1）增加融合蛋白在血液中的穩(wěn)定性。（2)Fc的生物學(xué)效應(yīng)引導(dǎo)向特定細(xì)胞。比如TNFa抗體與TNFRFc

免疫粘附素(immunoadhension)50第五節(jié)

噬菌體抗體庫技術(shù)(phageantibodylibrary)第五節(jié)

噬菌體抗體庫技術(shù)(phageantibodyl51一、噬菌體展示系統(tǒng)將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。一、噬菌體展示系統(tǒng)將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)52Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。SmithGP.Science1985;228:1315-7噬菌體展示技術(shù)Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲53抗體工程蛋白質(zhì)工程培訓(xùn)課件541Panlibrarywithimmobilizedtargets2Washoffunboundphage3Eluteboundphage4Amplifyovernight5Panelutedphage6Isolateindividualcolony3-4?2004MontaropYamabhai1234563-4?2004MontaropYama55二、噬菌體抗體庫運用DNA重組技術(shù)把人抗體基因與噬菌體載體DNA相連，在噬菌體表面呈現(xiàn)并制備人類全套抗體的技術(shù)。

phageantibodylibraryphageantibodybank

二、噬菌體抗體庫56

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達(dá)106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面57

因此,噬菌體抗體庫技術(shù)不經(jīng)免疫不經(jīng)細(xì)胞融合技術(shù)即可獲得含量豐富、種類眾多的單一抗體技術(shù)。因此,噬菌體抗體庫技術(shù)58外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導(dǎo)系列的緊靠下游

隨機克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴增抗體全套基因片段（一）噬菌體抗體庫技術(shù)基本方法外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文59用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的質(zhì)周腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡60

1．抗體基因的擴增:

利用PCR技術(shù)，從外周B淋巴細(xì)胞DNA中分別擴增出輕鏈、重鏈可變區(qū)的基因。也可從B細(xì)胞mRNA中，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再擴增。除B細(xì)胞外，外周淋巴細(xì)胞、脾、淋巴結(jié)和骨髓細(xì)胞也可選用。顯而易見，此法除了引物設(shè)計十分重要外，還要考慮機體免疫狀態(tài)、細(xì)胞種類和數(shù)量、mRNA豐度等影響。1．抗體基因的擴增:61引物設(shè)計，一般可選①5ˊ端引物選Ig前導(dǎo)肽保守序列，5ˊ端引物也可選Ig分子骨架區(qū)1(FR1)的保守序列。②3ˊ端引物常選J區(qū)保守序列。構(gòu)建Fab基因庫，則在重鏈絞鏈區(qū)和輕鏈恒定區(qū)設(shè)計引物。③依據(jù)抗體基因家族保守序列設(shè)計引物。④設(shè)計多套引物分別擴增。為保證引物與模板最大的匹配，擴增出所有基因，有時尚須采用兼并引物。引物設(shè)計，一般可選62選用絲狀噬菌體(M13、fd)，其DNA呈單鏈。一般在其外殼蛋白基因信號肽序列與編碼成熟的蛋白序列之間插入外源基因人Ig基因片段。用特定的限制性內(nèi)切酶酶解擴增出來的cDNA，克隆進(jìn)入絲狀噬菌體載體中，即與外殼蛋白pⅢ或pⅧ的基因連接形成融合基因。2．噬菌體表達(dá)載體的構(gòu)建選用絲狀噬菌體(M13、fd)，其DNA呈單鏈。一般在其外63

一般插入后不影響表達(dá)系統(tǒng)功能，在此融合基因中，人Ig基因片段多位于噬菌體基因的上游5ˊ端，在細(xì)菌中可以表達(dá)。一般作用的載體都是經(jīng)過改建的，即含有LacZ啟動子、核糖體結(jié)合位點(SD序列)、前導(dǎo)肽序列(保證分泌)和多克隆位點等，其后為M13外殼蛋白(pⅢ或pⅧ)。一般插入后不影響表達(dá)系統(tǒng)功能，在此融合基因中，人I64噬菌體抗體圖示噬菌體抗體圖示653．重組噬菌體DNA導(dǎo)入細(xì)菌進(jìn)行人Ig片段表達(dá)

表達(dá)出的人Ig片段位于噬菌體外殼蛋白N端，但此融合蛋白不形成包涵體，在細(xì)菌信號肽引導(dǎo)下到達(dá)質(zhì)周腔，Ig片段在此能自發(fā)折疊成天然狀態(tài)，恢復(fù)生物活性。同時，外殼蛋白構(gòu)成噬菌體外殼后，抗體分子蛋白處于其N端，分布在噬菌體表面。3．重組噬菌體DNA導(dǎo)入細(xì)菌進(jìn)行人Ig片段表達(dá)66抗體庫的構(gòu)建抗體庫的構(gòu)建674單鏈?zhǔn)删w有效篩選

抗體庫建立后,用可溶性抗原去篩選表達(dá)的抗體，在篩選流感病毒血凝素抗體、破傷風(fēng)類毒素抗體時證明，篩選率很低。需要改進(jìn)和提高產(chǎn)率。4單鏈?zhǔn)删w有效篩選68

制備固相化抗原柱

人體內(nèi)是通過抗原的提呈作用，選擇表面呈現(xiàn)特異抗體的B細(xì)胞和增殖分泌抗體的漿細(xì)胞。并在抗原選擇壓力下發(fā)生改變，產(chǎn)生出具有不同親和力抗體。為了模擬此選擇作用，在體外用固化抗原柱篩選噬菌表面抗體，再利用噬菌體能感染大腸桿菌特性，確重新感染細(xì)菌進(jìn)行擴增。固相多用層析柱，也有用顆粒物質(zhì)和酶聯(lián)孔的。制備固相化抗原柱69

抗體庫噬菌體過柱

選擇目的抗體把含有抗體的噬菌體培養(yǎng)上清加到抗原固相柱上，使表面呈現(xiàn)特異性抗體的噬菌體與抗原特異性結(jié)合，洗去未結(jié)合的噬菌體。此時，抗原柱吸附的帶抗體的噬菌體是具有感染性,表面所帶抗體是所需的特異抗體片段。顯然，只要制備不同抗原柱，就可篩選到針對不同抗原的不同抗體。抗體庫噬菌體過柱70

6．洗脫結(jié)合的噬菌體

選擇合適洗脫條件，把結(jié)合的、也是所需的噬菌體洗下來，收集噬菌體，再去感染細(xì)菌進(jìn)行擴增。經(jīng)過這樣一來一輪淘篩方式，就能把抗體庫中與抗原特異性結(jié)合抗體選出來，且能夠做到富集。6．洗脫結(jié)合的噬菌體71抗體庫的富集篩選抗體庫的富集篩選727．重復(fù)“吸附—洗脫—擴增”過程

由于每徑過一輪淘篩，可富集20～1000倍，幾輪后很容易擴增到108個噬菌體體庫。7．重復(fù)“吸附—洗73（二）應(yīng)用1．應(yīng)用“萬能庫”,制備人源抗體、多功能抗體不經(jīng)免疫已獲得許多人的抗半抗原、蛋白質(zhì)、多糖及病毒等抗體。2．抗感染傳染病診斷、治療和預(yù)防(當(dāng)前重點、熱點)。3．抗腫瘤腫瘤和其他疾病的導(dǎo)向治療和基因治療。（二）應(yīng)用744．利用抗體信息設(shè)計藥物。5．噬菌體表位文庫，可用此表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)特異多肽后，建立肽庫（peptidelibrary）。4．利用抗體信息設(shè)計藥物。75蛋白質(zhì)工程(proteinengineering）蛋白質(zhì)工程(76蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其多樣性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其多樣性77①氨基酸種類不同，肽鏈結(jié)構(gòu)不同

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◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎蛋白質(zhì)多樣性原因②氨基酸數(shù)目成百上千，肽鏈結(jié)構(gòu)不同③氨基酸排列順序千變?nèi)f化，肽鏈結(jié)構(gòu)不同☆-☆-○-◎-

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-★-◆●-■-◎-○-☆-○-☆-□-◎-▲-★-◆-

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-④肽鏈空間結(jié)構(gòu)千差萬別，蛋白質(zhì)種類不同①氨基酸種類不同，肽鏈結(jié)構(gòu)不同

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78天然蛋白質(zhì)是生物在長期進(jìn)化過程中形成的，它們的結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種生存的需要，卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。天然蛋白質(zhì)是生物在長期進(jìn)化過程中形成的，它們的結(jié)構(gòu)和功能符合79基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程就是為了生產(chǎn)出符合人類生產(chǎn)和生活需要的蛋白質(zhì)，甚至是自然界不存在的蛋白質(zhì)。基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程就是80滿足人類生產(chǎn)和生活的需要改造干擾素（半胱氨酸）體外很難保存干擾素（絲氨酸）體外可以保存半年玉米中賴氨酸含量比較低天冬氨酸激酶（352位的蘇氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）改造改造天冬氨酸激酶（異亮氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（異亮氨酸）玉米中賴氨酸含量可提高數(shù)倍改造滿足人類生產(chǎn)和生活的需要改造干擾素（半胱氨酸）體外很難保存干81例如．胰島素改造天然胰島素制劑在儲存中易形成二聚體和六聚體，延緩胰島素從注射部位進(jìn)入血液，從而延緩了其降血糖作用，也增加了抗原性，這是胰島素B23-B28氨基酸殘基結(jié)構(gòu)所致。利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改變這些殘基，則可降低其聚合作用，使胰島素快速起作用。該速效胰島素已通過臨床實驗。

例如．胰島素改造82二、蛋白質(zhì)工程的基本原理

根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子設(shè)計。

對天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，你認(rèn)為應(yīng)該直接對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行操作，還是通過對基因的操作來實現(xiàn)？二、蛋白質(zhì)工程的基本原理根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求83

蛋白質(zhì)的功能是DNA決定的，那么要制造出新的蛋白質(zhì)，就要改造DNA，所以蛋白質(zhì)工程的原理應(yīng)該是中心法則的逆推。

蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程。蛋白質(zhì)的功能是DNA決定的，那么要制蛋白質(zhì)84

蛋白質(zhì)工程的基本原理基因DNA氨基酸序列多肽鏈蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)

預(yù)期功能

生物功能mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯折疊DNA合成分子設(shè)計蛋白質(zhì)工程的基本原理基因氨基酸序列蛋白質(zhì)預(yù)期功能85蛋白質(zhì)工程的主要步驟通常包括：（1）從生物體中分離純化目的蛋白；（2）測定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了解蛋白質(zhì)的二維重組和三維晶體結(jié)構(gòu);（4）設(shè)計各種處理條件，了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響；（5）設(shè)計編碼該蛋白的基因改造方案，如點突變；（6）分離、純化新蛋白，功能檢測后投入實際使用。蛋白質(zhì)工程的主要步驟通常包括：（4）設(shè)計各種處理條件，了解蛋86蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定一級結(jié)構(gòu)測定：直接法：直接測定多肽鏈的氨基酸順序。間接法：從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序。三級結(jié)構(gòu)測定：X-射線晶體衍射——研究處在晶體狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)核磁共振(NMR)光譜——研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定87

蛋白質(zhì)工程的主要手段以重組DNA技術(shù)為核心的基因工程技術(shù)改造蛋白質(zhì)。位點特異性突變——結(jié)構(gòu)生物學(xué)、信息生物學(xué)基因突變隨機突變——基于高通量篩選法基因內(nèi)部的剪接基因剪接

5‘或3’端的剪接蛋白質(zhì)工程的主要手段88小改是對天然蛋白質(zhì)的一個或幾個氨基酸殘基進(jìn)行修改。它往往利用點突變的技術(shù)，在維持蛋白質(zhì)原有功能的基礎(chǔ)上，改進(jìn)某一些性質(zhì)特點。小改是對天然蛋白質(zhì)的一個或幾個氨基酸殘基進(jìn)行修改。它往往利用89基因定點誘變技術(shù)的常用方法是PCR法。突變點：人工合成的引物上手段：PCR技術(shù)目的：獲得定點突變的基因位點特異性突變：通過特異地改變編碼核苷酸從而替代蛋白質(zhì)中的某個氨基酸?？筛咝?、準(zhǔn)確地得到蛋白質(zhì)突變體。但這種方法得到的突變體數(shù)量有限，因此在ＤＮＡ操作技術(shù)的帶動下，發(fā)現(xiàn)了隨機突變法?；蚨c誘變技術(shù)的常用方法是PCR法。突變點：人工合成的引物90

設(shè)計速效胰島素原則就是避免胰島素形成聚合體。類胰島素生長因子－I(IGF－I)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與胰島素具有高度的同源性和三維結(jié)構(gòu)的相似性，但I(xiàn)GF－I不形成二聚體。IGF－I的B結(jié)構(gòu)域（與胰島素B鏈相對應(yīng)）中B28－B29氨基酸序列與胰島素B鏈的B28－B29相比，發(fā)生顛倒。因此，將胰島素B鏈改為B28Lys－B29Pro，獲得單體速效胰島素。該速效胰島素已通過臨床實驗。設(shè)計速效胰島素原則就是避免胰島素形成聚合體。類胰島素生長因91枯草桿菌堿性蛋白酶(重要工業(yè)用酶)對堿、熱、氧化作用抗力差，易失活。Met/Ala(222),成功地制備出具有耐堿、耐熱以及抗氧化的各種新特性的蛋白酶。胰蛋白酶（LysArg）易自溶失活對自溶片段分析，對Arg117進(jìn)行設(shè)計，引入缺失突變。穩(wěn)定性大大提高。表面電荷正改負(fù)，在較高pH條件下提高了其專一性（LysArg）。枯草桿菌堿性蛋白酶(重要工業(yè)用酶)92葡萄糖異構(gòu)酶（GI）在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，為提高其熱穩(wěn)定性，確定第138位甘氨酸(Gly138)為目標(biāo)氨基酸后，用雙引物法對GI基因進(jìn)行體外定點誘變，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突變體的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)果突變型GI比野生型的熱半衰期長一倍；最適反應(yīng)溫度提高10～12℃；酶比活相同

葡萄糖異構(gòu)酶（GI）在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，為提高其熱穩(wěn)定性，確定93

中改是對蛋白質(zhì)分子中某些結(jié)構(gòu)單元或肽段進(jìn)行分子裁剪，通過基因操作，在不同的蛋白質(zhì)分子之間替換結(jié)構(gòu)單元，以期得到新的功能組合。中改是對蛋白質(zhì)分子中某些結(jié)構(gòu)單元或肽段進(jìn)行分子裁剪，通94基因剪接：在酶分子的編碼基因上剪去或接上一段核苷酸。融合蛋白質(zhì)將編碼一種蛋白質(zhì)的部分基因移植到另一種蛋白質(zhì)基因上，或?qū)⒉煌鞍踪|(zhì)基因的片段組合在一起，經(jīng)基因克隆和表達(dá)，產(chǎn)生出新的融合蛋白質(zhì)。（結(jié)構(gòu)域的拼接）這種方法可以將不同蛋白質(zhì)的特性集中在一種蛋白質(zhì)上，顯著地改變蛋白質(zhì)的特性基因剪接：在酶分子的編碼基因上剪去或接上一段核苷酸。95

腦啡肽(Enk)N端5肽線形結(jié)構(gòu)是與δ型受體結(jié)合的基本功能區(qū)域，干擾素（IFN）是一種廣譜抗病毒抗腫瘤的細(xì)胞因子?；瘜W(xué)合成EnkN端5肽編碼區(qū)，通過連接5肽編碼區(qū)與人α1型IFN基因連接，在大腸桿菌中表達(dá)了這一融合蛋白。以體外人結(jié)腸腺癌細(xì)胞和多形膠質(zhì)瘤細(xì)胞為模型，采用3H－胸腺嘧啶核苷摻入法證明該融合蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性顯著高于單純的IFN，通過競爭阻斷實驗證明，抑制活性的增高確由Enk導(dǎo)向區(qū)介導(dǎo)。腦啡肽(Enk)N端5肽線形結(jié)構(gòu)是與δ型受體結(jié)合的基本功能96大改是重新設(shè)計與合成自然界本不存在的蛋白質(zhì)分子。即從蛋白質(zhì)的氨基酸組成和順序出發(fā)，設(shè)計并制造出一個全新的蛋白質(zhì)，并使之具有特定的空間結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的功能。大改97

①定點突變注意盡量保護(hù)保守的殘基，特別在高特異性、高活性蛋白操作時更應(yīng)注意。②對糖蛋白的N糖基化位點（AsnXSer/TheXPro）應(yīng)予注意。分泌蛋白、穿膜蛋白的這些位點若改變，將影響其糖基化，則可能對生物活性有影響。故注意對天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸加以保護(hù)。應(yīng)注意①定點突變注意盡量保護(hù)保守的殘基，特別98③疏水氨基酸常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)活性中心區(qū)，故應(yīng)保留脯氨酸（可終止α螺旋區(qū)），半胱氨酸（形成二硫鍵，這是分泌蛋白標(biāo)志之一）。④α螺旋，β折疊區(qū)一般不會存在酶的活性中心及底物的結(jié)合中心，只是結(jié)構(gòu)支架。而環(huán)區(qū)，轉(zhuǎn)角區(qū)和帶電荷區(qū)多位蛋白質(zhì)表面，可能是底物結(jié)合區(qū)和配基結(jié)合部位，應(yīng)予注意。③疏水氨基酸常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)活性中心區(qū)，故應(yīng)保留99⑤對于有內(nèi)含子的基因序列，可以試著去刪除某一外顯子，觀察對功能影響。由于單個外顯子一般編碼獨立折疊結(jié)構(gòu)刪去后不會影響其余部分的折疊。⑥構(gòu)建嵌合蛋白時，若是同源蛋白嵌合體（30%同源），結(jié)合部應(yīng)是相同或相近功能氨基酸；若是非同源原蛋白質(zhì)，接合部應(yīng)在預(yù)測結(jié)構(gòu)的邊緣。⑤對于有內(nèi)含子的基因序列，可以試著去刪除某一外顯子，觀察對100抗體工程蛋白質(zhì)工程抗體工程蛋白質(zhì)工程101（優(yōu)選）抗體工程蛋白質(zhì)工程（優(yōu)選）抗體工程蛋白質(zhì)工程102淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體103抗體工程蛋白質(zhì)工程培訓(xùn)課件104如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。利用腫瘤細(xì)胞無限增殖的特性。利用細(xì)胞融合的技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有B淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞。利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。105單克隆抗體的概念由單個雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖,也就是通過克隆，形成細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。單克隆抗體的概念106

單克隆抗體制備過程

注射抗原B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、篩選雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體如何獲得融和細(xì)胞？如何得到單個融和細(xì)胞？如何篩選雜交瘤細(xì)胞？鑒別是否分泌所需抗體?單克隆抗體制備過程注射抗原B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融107雜交瘤細(xì)胞的篩選(1)骨髓瘤細(xì)胞為HGPRT基因缺陷型細(xì)胞，不能合成DNA。需經(jīng)應(yīng)急途徑合成DNA。HAT培養(yǎng)基含有次黃嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶。氨基喋呤可阻斷骨髓瘤細(xì)胞的應(yīng)急DNA合成。所以骨髓瘤細(xì)胞不能在HAT培養(yǎng)基中生長存活.B淋巴細(xì)胞具有HGPRT基因但不能在體外生長。利用這兩種細(xì)胞各自的特點，篩選能在體外含HAT的培養(yǎng)基中生長的融合子。HGPRT:次黃嘌呤核糖磷酸轉(zhuǎn)移酶

HAT：次黃嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶雜交瘤細(xì)胞的篩選(1)骨髓瘤細(xì)胞為HGPRT基因缺陷型細(xì)胞，108雜交瘤細(xì)胞的篩選(2)雜交瘤細(xì)胞的篩選(2)109抗體工程蛋白質(zhì)工程培訓(xùn)課件110整個制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤細(xì)胞第二次篩選（克隆化培養(yǎng)和抗體檢測）：篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。整個制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)111思考：1、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物細(xì)胞培養(yǎng)原理2、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合？這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體思考：1、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物112鑒定后的雜交瘤細(xì)胞可大規(guī)模培養(yǎng)，收集上清提取單克隆抗體，也可免疫小鼠腹腔，抽取腹水來制備相應(yīng)的McAb，但生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)量均受限制。鑒定后的雜交瘤細(xì)胞可大規(guī)模培養(yǎng)，收集上清提取單克隆抗體，也可113單克隆抗體的優(yōu)勢1．高特異性，針對一個抗原靶點。。2．高純度，成份均一，來自一個克隆。3．高效價，抗體的滴度高。4．高效益，國際上近100億美元市場。5．易制備。6．前景好，McAb1995問世后，風(fēng)糜全球，寄予厚望。單克隆抗體的優(yōu)勢1．高特異性，針對一個抗原靶點。。114單克隆抗體應(yīng)用領(lǐng)域1．McAb作為診斷試劑應(yīng)用這是目前應(yīng)用最廣的領(lǐng)域，目前已有許多成套的診斷試劑盒在診斷傳染病，代謝病和免疫性疾病中應(yīng)用，取得良好經(jīng)濟和社會效益，全世界有上百億市場。舉例早孕試紙，乙肝診斷試劑盒單克隆抗體應(yīng)用領(lǐng)域1．McAb作為診斷試劑應(yīng)用115（α-FcγRI-RicinA）從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體。鑒定后的雜交瘤細(xì)胞可大規(guī)模培養(yǎng)，收集上清提取單克隆抗體，也可免疫小鼠腹腔，抽取腹水來制備相應(yīng)的McAb，但生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)量均受限制。直接法：直接測定多肽鏈的氨基酸順序。選擇目的抗體把含有抗體的噬菌體培養(yǎng)上清加到抗原固相柱上，使表面呈現(xiàn)特異性抗體的噬菌體與抗原特異性結(jié)合，洗去未結(jié)合的噬菌體。即可獲得含量豐富、種類眾多的單一抗體技術(shù)。2．噬菌體表達(dá)載體的構(gòu)建蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程?；瘜W(xué)交聯(lián)法基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL為了模擬此選擇作用，在體外用固化抗原柱篩選噬菌表面抗體，再利用噬菌體能感染大腸桿菌特性，確重新感染細(xì)菌進(jìn)行擴增。將編碼一種蛋白質(zhì)的部分基因移植到另一種蛋白質(zhì)基因上，或?qū)⒉煌鞍踪|(zhì)基因的片段組合在一起，經(jīng)基因克隆和表達(dá)，產(chǎn)生出新的融合蛋白質(zhì)。將抗體VH和VL（重鏈和輕鏈可變區(qū)）通過一個連接肽連接而成的小分子抗體，以體外人結(jié)腸腺癌細(xì)胞和多形膠質(zhì)瘤細(xì)胞為模型，采用3H－胸腺嘧啶核苷摻入法證明該融合蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性顯著高于單純的IFN，通過競爭阻斷實驗證明，抑制活性的增高確由Enk導(dǎo)向區(qū)介導(dǎo)。核磁共振(NMR)光譜——研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。嵌合抗體由于這兩部分在空間結(jié)構(gòu)上相對獨立，其獨特的抗體親和力保持得很好。腫瘤的影像分布用于腫瘤的導(dǎo)向治療化學(xué)合成EnkN端5肽編碼區(qū)，通過連接5肽編碼區(qū)與人α1型IFN基因連接，在大腸桿菌中表達(dá)了這一融合蛋白。2．抗體導(dǎo)向治療

用特異性單抗為載體，將抗瘤藥物、放射性核素以及毒素等毒性物質(zhì)導(dǎo)向性攜帶至腫瘤灶局部，可特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞損傷較輕。將毒素與單抗連接常稱為免疫毒素。常用的毒素包括植物毒素（如蓖麻毒素、苦瓜毒素等）和細(xì)菌毒素（如白喉外毒素、綠膿桿菌外毒素等）。（α-FcγRI-RicinA）2．抗體導(dǎo)向治療116抗體工程蛋白質(zhì)工程培訓(xùn)課件1173．McAb作免疫抑制劑應(yīng)用，應(yīng)用于器官移植。當(dāng)前McAb最具代表的是抗TNF單抗治療類風(fēng)濕和回腸炎有效，有20億美元市場。其他在抗腫瘤，抗排異及抗血栓方面也很看好。3．McAb作免疫抑制劑應(yīng)用，應(yīng)用于器官移植。1181980年后，其開發(fā)走向下坡路，臨床實驗失敗，股票狂跌，損失以百萬美元計。原因病人過敏及免疫性疾病加重病人病情，體內(nèi)很快排異及對腎臟毒性。但到2000年又有回頭，2001年被認(rèn)為在免疫學(xué)上是“單克隆抗體年”，抗體研究將迅速發(fā)展，現(xiàn)單在治療方面就有10種單抗進(jìn)入市場，3種待批上市，近100種在進(jìn)行臨床試驗階段。當(dāng)然，與McAb技術(shù)改進(jìn)關(guān)系極大。1980年后，其開發(fā)走向下坡路，臨床實驗失敗，股票狂跌，損失119資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺120

問題異源蛋白導(dǎo)致產(chǎn)生抗抗體，影響靶向性和效果在體內(nèi)被清除速度快靶部位攝取的量太低效應(yīng)功能弱產(chǎn)業(yè)化

對策抗體人源化抗體人源化改變抗體分子大小連接毒素、放射性同位素、藥物體外表達(dá)抗體抗體治療存在的問題及對策問題對121基因工程抗體通過基因重組改良抗體性能通過噬菌體抗體庫技術(shù)研制新的抗體基因工程抗體通過基因重組改良抗體性能122免疫球蛋白分子的基本結(jié)構(gòu)免疫球蛋白分子的基本結(jié)構(gòu)123第二節(jié)

鼠單抗人源化第二節(jié)

鼠單抗人源化124●恒定區(qū)人源化——人-鼠嵌合抗體●可變區(qū)人源化——人改型抗體●用抗體庫技術(shù)進(jìn)行人源化●恒定區(qū)人源化——人-鼠嵌合抗體125第一代的抗體人源化—嵌合抗體從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體。嵌合抗體由于這兩部分在空間結(jié)構(gòu)上相對獨立，其獨特的抗體親和力保持得很好。特點減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。缺點因鼠單抗可變區(qū)的存在，應(yīng)用時仍有較強的免疫排斥反應(yīng)第一代的抗體人源化—嵌合抗體126Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞啟動子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略Pr鼠VH人CH127鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細(xì)胞人-鼠嵌合基因工程抗體鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細(xì)胞人-鼠嵌合基因工程抗體128①定點突變注意盡量保護(hù)保守的殘基，特別在高特異性、高活性蛋白操作時更應(yīng)注意。②3ˊ端引物常選J區(qū)保守序列。從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體。建立肽庫（peptidelibrary）。2．噬菌體表達(dá)載體的構(gòu)建4．高效益，國際上近100億美元市場。利用B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。連接細(xì)胞毒性藥物（C1027、柔紅霉素）對天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，你認(rèn)為應(yīng)該直接對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行操作，還是通過對基因的操作來實現(xiàn)？基因定點誘變技術(shù)的常用方法是PCR法。基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。中改是對蛋白質(zhì)分子中某些結(jié)構(gòu)單元或肽段進(jìn)行分子裁剪，通過基因操作，在不同的蛋白質(zhì)分子之間替換結(jié)構(gòu)單元，以期得到新的功能組合。比如TNFa抗體與TNFRFc●可變區(qū)人源化——人改型抗體將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。（優(yōu)選）抗體工程蛋白質(zhì)工程玉米中賴氨酸含量可提高數(shù)倍Met/Ala(222),成功地制備出具有耐堿、耐熱以及抗氧化的各種新特性的蛋白酶。從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體。3．抗腫瘤腫瘤和其他疾病的導(dǎo)向治療和資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。第二代的抗體人源化——改型抗體在嵌合抗體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將鼠MAb可變區(qū)中相對保守的FR(frameworkregion)替換成人的FR，保留與抗原結(jié)合部位決定簇互補區(qū)（complementdeterminantregion)部位(即CDR移植)早期的改型抗體簡單的CDR移植，通過點突變進(jìn)行微調(diào)即更換某個位點上的氨基酸。①定點突變注意盡量保護(hù)保守的殘基，特別在高特異性、高活性蛋129CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體鼠單克130第二代改型抗體：①應(yīng)用了人抗體基因庫；②引進(jìn)計算機技術(shù)模擬抗體分子的立體結(jié)構(gòu)(分子模擬法)；③使用了鼠人嵌合FR。其目的是獲得具有高親和力的治療性抗體

第二代改型抗體：131132已批準(zhǔn)上市的單抗適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移植排斥大腸癌冠心病淋巴瘤移植排斥炎癥性腸病、類風(fēng)濕CD317-1A血小板受體ⅡbⅢaCD20CD25TNF-аOKT3PanorexReoProRituxanSimulectRemicade鼠單抗鼠單抗人－鼠嵌合抗體人－鼠嵌合抗體人－鼠嵌合抗體人－鼠嵌合抗體19861995(德國)1994199719981998、199932已批準(zhǔn)上市的單抗適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移132133適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移植排斥乳腺癌RVS感染AMLCLLCD25HER-2RSVF蛋白CD33CD52ZanapaxHerceptinSynagisMylotargCAMPATH人源化抗體人源化抗體人源化抗體人源化抗體－化療藥物交聯(lián)物人源化抗體1997199819982000200133適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移植排斥CD25Z133第三節(jié)

小分子抗體第三節(jié)

小分子抗體134

小分子抗體通過基因重組技術(shù)，可以在保持原有抗原結(jié)合活性的基礎(chǔ)上，把完整的抗體分子改造成較小的分子，稱為小分子抗體。根據(jù)其價數(shù)的不同可分為單價小分子抗體及多價小分子抗體兩種。小分子抗體135單價小分子抗體一、Fab抗體

Fab段由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能。Fab抗體只有完整IgG的1/3。單價小分子抗體136二、單鏈抗體(ScFv)

定義：用基因工程方法，將抗體VH和VL（重鏈和輕鏈可變區(qū)）通過一個連接肽連接而成的小分子抗體，功能：具有較好的抗原結(jié)合能力，且分子量小、穿透力強、免疫原性低等特性?？膳c其他效應(yīng)分子構(gòu)建成多種具有新功能的抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體等的理想而基本的元件。Ag二、單鏈抗體(ScFv)Ag137三、單域抗體

抗體與抗原的結(jié)合主要由Ig的V區(qū)決定，因此只含V區(qū)基因片段的小分子抗體，即只有VH或VL一個功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原單克隆抗體的特異性。這種小分子的抗體片段就稱為單域或單區(qū)抗體，其分子量僅為整個Ig分子的1／12，故也稱之為小抗體。三、單域抗體138四.超變區(qū)多肽

抗體抗原結(jié)合是經(jīng)過補體決定區(qū)（CDR）來實現(xiàn)。因此，CDR是構(gòu)成抗原抗體結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)單位。根據(jù)這一特點，可以設(shè)計出那些在抗原識別及親和力方面有重要意義的CDR多肽，直接用于診斷或治療，可望獲得理想的結(jié)果。這種只含有一個CDR多肽的抗體，稱為超變區(qū)多肽，亦稱為最小識別單位(minimalrecognitionunit,MRU)。四.超變區(qū)多肽139從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體。從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體。蛋白質(zhì)工程(proteinengineering）另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。①5ˊ端引物選Ig前導(dǎo)肽保守序列，5ˊ端引物也可選Ig分子骨架區(qū)1(FR1)的保守序列。直接法：直接測定多肽鏈的氨基酸順序?？膳c其他效應(yīng)分子構(gòu)建成多種具有新功能的抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體等的理想而基本的元件。這種小分子的抗體片段就稱為單域或單區(qū)抗體，其分子量僅為整個Ig分子的1／12，故也稱之為小抗體。核磁共振(NMR)光譜——研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。將抗體VH和VL（重鏈和輕鏈可變區(qū)）通過一個連接肽連接而成的小分子抗體，（2）測定其氨基酸序列；將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。蛋白質(zhì)工程(proteinengineering）連接植物或細(xì)菌毒素（ricin、PE40）基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。④α螺旋，β折疊區(qū)一般不會存在酶的活性中心及底物的結(jié)合中心，只是結(jié)構(gòu)支架?！窨勺儏^(qū)人源化——人改型抗體如CD4免疫粘附素，就是由抗體的Fc段與2個CD4分子的Ig同源區(qū)重組而成

多價小分子抗體在ScFv的基礎(chǔ)上，可以把兩個或兩個以上的ScFv重組在一起，由此可制備成多價小分子抗體即微型抗體（簡稱多價微抗）。其中包括雙鏈抗體(diabody)，微型抗體（minibody），三鏈抗體(triabody)及四鏈抗體(tetrabody)等。

從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（140AgAg雙鏈抗體(diabody)

制備方法化學(xué)交聯(lián)法粘性蛋白結(jié)構(gòu)域融合法接頭長度控制法。AgAg雙鏈抗體(diabody)141微型抗體(minibody)

通過基因工程手段采用不同的接頭把單鏈抗體(VL-VH)的VH結(jié)構(gòu)域與IgG的CH3結(jié)構(gòu)域融合，形成VL-VH-CH3的結(jié)構(gòu)，稱之為微型抗體（minibody）。此種抗體合成后通過CH3結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定二聚體式，發(fā)揮其雙價微抗作用。微型抗體通過基因工程手段采用不同的接頭把單鏈抗142

小分子抗體的應(yīng)用：用于腫瘤的導(dǎo)向治療腫瘤的影像分布基因治療研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系小分子抗體的應(yīng)用：143第四節(jié)

抗體融合蛋白第四節(jié)

抗體融合蛋白144抗體融合蛋白將抗體分子片段與其他蛋白融合，所形成的具有新的特性融合蛋白。根據(jù)構(gòu)建方式的不同，主要分為兩種形式Fc融合蛋白（Fcfusionprotein,FcFP）由抗體的Fc段與某些具有特定功能的蛋白結(jié)構(gòu)域融合而成。如CD4免疫粘附素，就是由抗體的Fc段與2個CD4分子的Ig同源區(qū)重組而成抗原結(jié)合融合蛋白（antigenBindingfusionprotein,ABFP）由具有抗原結(jié)合功能的抗體結(jié)構(gòu)與其他功能性蛋白融合構(gòu)成。如免疫毒素，抗體部分主要包括嵌合抗體、單鏈抗體形式。抗體融合蛋白將抗體分子片段與其他蛋白融合，所形成的具有新的特145免疫毒素又稱生物導(dǎo)彈，是由導(dǎo)向性的載體分子（抗體部分）與具有毒性的彈頭蛋白交聯(lián)而制成，屬于導(dǎo)向藥物的一種。免疫毒素又稱生物導(dǎo)彈，是由導(dǎo)向性的載體分子（抗體部分）與具有146免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARicinA（α-FcγRI-RicinA）RicinA:蓖麻毒素A,對腫瘤細(xì)胞具有毒性作用免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARic147CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2

免疫細(xì)胞因子(Immunocytokine)CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2免疫細(xì)胞148偶連細(xì)胞毒物質(zhì)連接放射性同位素(131I、99mTc）連接植物或細(xì)菌毒素（ricin、PE40）連接細(xì)胞毒性藥物（C1027、柔紅霉素）偶連細(xì)胞毒物質(zhì)連接放射性同位素(131I、99mTc）149免疫粘附素(immunoadhension)將人抗體恒定區(qū)(主要是Fc段)N端連接于人細(xì)胞表面的受體分子或細(xì)胞粘附分子上，在真核細(xì)胞中表達(dá)出正確折疊的融合抗體蛋白分子。Fc段發(fā)揮的作用（1）增加融合蛋白在血液中的穩(wěn)定性。（2)Fc的生物學(xué)效應(yīng)引導(dǎo)向特定細(xì)胞。比如TNFa抗體與TNFRFc

免疫粘附素(immunoadhension)150第五節(jié)

噬菌體抗體庫技術(shù)(phageantibodylibrary)第五節(jié)

噬菌體抗體庫技術(shù)(phageantibodyl151一、噬菌體展示系統(tǒng)將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。一、噬菌體展示系統(tǒng)將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)152Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。SmithGP.Science1985;228:1315-7噬菌體展示技術(shù)Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲153抗體工程蛋白質(zhì)工程培訓(xùn)課件1541Panlibrarywithimmobilizedtargets2Washoffunboundphage3Eluteboundphage4Amplifyovernight5Panelutedphage6Isolateindividualcolony3-4?2004MontaropYamabhai1234563-4?2004MontaropYama155二、噬菌體抗體庫運用DNA重組技術(shù)把人抗體基因與噬菌體載體DNA相連，在噬菌體表面呈現(xiàn)并制備人類全套抗體的技術(shù)。

phageantibodylibraryphageantibodybank

二、噬菌體抗體庫156

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達(dá)106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面157

因此,噬菌體抗體庫技術(shù)不經(jīng)免疫不經(jīng)細(xì)胞融合技術(shù)即可獲得含量豐富、種類眾多的單一抗體技術(shù)。因此,噬菌體抗體庫技術(shù)158外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導(dǎo)系列的緊靠下游

隨機克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴增抗體全套基因片段（一）噬菌體抗體庫技術(shù)基本方法外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文159用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的質(zhì)周腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡160

1．抗體基因的擴增:

利用PCR技術(shù)，從外周B淋巴細(xì)胞DNA中分別擴增出輕鏈、重鏈可變區(qū)的基因。也可從B細(xì)胞mRNA中，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再擴增。除B細(xì)胞外，外周淋巴細(xì)胞、脾、淋巴結(jié)和骨髓細(xì)胞也可選用。顯而易見，此法除了引物設(shè)計十分重要外，還要考慮機體免疫狀態(tài)、細(xì)胞種類和數(shù)量、mRNA豐度等影響。1．抗體基因的擴增:161引物設(shè)計，一般可選①5ˊ端引物選Ig前導(dǎo)肽保守序列，5ˊ端引物也可選Ig分子骨架區(qū)1(FR1)的保守序列。②3ˊ端引物常選J區(qū)保守序列。構(gòu)建Fab基因庫，則在重鏈絞鏈區(qū)和輕鏈恒定區(qū)設(shè)計引物。③依據(jù)抗體基因家族保守序列設(shè)計引物。④設(shè)計多套引物分別擴增。為保證引物與模板最大的匹配，擴增出所有基因，有時尚須采用兼并引物。引物設(shè)計，一般可選162選用絲狀噬菌體(M13、fd)，其DNA呈單鏈。一般在其外殼蛋白基因信號肽序列與編碼成熟的蛋白序列之間插入外源基因人Ig基因片段。用特定的限制性內(nèi)切酶酶解擴增出來的cDNA，克隆進(jìn)入絲狀噬菌體載體中，即與外殼蛋白pⅢ或pⅧ的基因連接形成融合基因。2．噬菌體表達(dá)載體的構(gòu)建選用絲狀噬菌體(M13、fd)，其DNA呈單鏈。一般在其外163

一般插入后不影響表達(dá)系統(tǒng)功能，在此融合基因中，人Ig基因片段多位于噬菌體基因的上游5ˊ端，在細(xì)菌中可以表達(dá)。一般作用的載體都是經(jīng)過改建的，即含有LacZ啟動子、核糖體結(jié)合位點(SD序列)、前導(dǎo)肽序列(保證分泌)和多克隆位點等，其后為M13外殼蛋白(pⅢ或pⅧ)。一般插入后不影響表達(dá)系統(tǒng)功能，在此融合基因中，人I164噬菌體抗體圖示噬菌體抗體圖示1653．重組噬菌體DNA導(dǎo)入細(xì)菌進(jìn)行人Ig片段表達(dá)

表達(dá)出的人Ig片段位于噬菌體外殼蛋白N端，但此融合蛋白不形成包涵體，在細(xì)菌信號肽引導(dǎo)下到達(dá)質(zhì)周腔，Ig片段在此能自發(fā)折疊成天然狀態(tài)，恢復(fù)生物活性。同時，外殼蛋白構(gòu)成噬菌體外殼后，抗體分子蛋白處于其N端，分布在噬菌體表面。3．重組噬菌體DNA導(dǎo)入細(xì)菌進(jìn)行人Ig片段表達(dá)166抗體庫的構(gòu)建抗體庫的構(gòu)建1674單鏈?zhǔn)删w有效篩選

抗體庫建立后,用可溶性抗原去篩選表達(dá)的抗體，在篩選流感病毒血凝素抗體、破傷風(fēng)類毒素抗體時證明，篩選率很低。需要改進(jìn)和提高產(chǎn)率。4單鏈?zhǔn)删w有效篩選168

制備固相化抗原柱

人體內(nèi)是通過抗原的提呈作用，選擇表面呈現(xiàn)特異抗體的B細(xì)胞和增殖分泌抗體的漿細(xì)胞。并在抗原選擇壓力下發(fā)生改變，產(chǎn)生出具有不同親和力抗體。為了模擬此選擇作用，在體外用固化抗原柱篩選噬菌表面抗體，再利用噬菌體能感染大腸桿菌特性，確重新感染細(xì)菌進(jìn)行擴增。固相多用層析柱，也有用顆粒物質(zhì)和酶聯(lián)孔的。制備固相化抗原柱169

抗體庫噬菌體過柱

選擇目的抗體把含有抗體的噬菌體培養(yǎng)上清加到抗原固相柱上，使表面呈現(xiàn)特異性抗體的噬菌體與抗原特異性結(jié)合，洗去未結(jié)合的噬菌體。此時，抗原柱吸附的帶抗體的噬菌體是具有感染性,表面所帶抗體是所需的特異抗體片段。顯然，只要制備不同抗原柱，就可篩選到針對不同抗原的不同抗體?？贵w庫噬菌體過柱170

6．洗脫結(jié)