頭孢氨芐血藥濃度測(cè)定方法研究課件

頭孢氨芐血藥濃度測(cè)定方法研究

STUDYONTHEPLASMALEVELDETERMINATIONOFCEFALEXIN

學(xué)生：徐勇軍導(dǎo)師：杜智敏教授專業(yè)：臨床藥學(xué)

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥物研究所2005年6月

頭孢氨芐血藥濃度測(cè)定方法研究

STUDYONTHE1

前言

頭孢氨芐（Cefalexin）屬半合成第一代口服頭孢菌素，口服吸收迅速完全、毒性低、抗菌譜廣，臨床上主要用于尿道感染、呼吸道感染及皮膚軟組織感染，為目前我國(guó)常用抗生素類藥物。為確保用藥的安全性和有效性，常需要測(cè)定體液中藥物的濃度，以考察藥物在體內(nèi)的吸收程度。由于生物樣品取樣量少、藥物濃度低且存在內(nèi)源性物質(zhì)的干擾及個(gè)體差異等多種因素影響，所以，一種靈敏、快速、簡(jiǎn)便的體內(nèi)藥物分析方法的建立顯得尤為重要。前言頭孢2

實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕⒎聪喔咝б合嗌V測(cè)定人血漿中頭

孢氨芐濃度的方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)研究

儀器

Waters高效液相色譜系統(tǒng)（510泵，717自動(dòng)進(jìn)樣器，996二極管陣列檢測(cè)器，2010色譜管理系統(tǒng)）XW-80型漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）高速臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)ABBOTT公司）KQ-2300E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）

實(shí)驗(yàn)研究?jī)x器Waters高效液4實(shí)驗(yàn)研究藥品供試藥品：頭孢氨芐片

（A制劑，廣州白云山制藥總廠提供，規(guī)格0.25g/片，批號(hào)0471201）參比制劑：頭孢氨芐片（B制劑，哈藥集團(tuán)制藥總廠提供，規(guī)格0.25g/片，批號(hào)A04110678）標(biāo)準(zhǔn)品：頭孢氨芐（含量94.2%，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）內(nèi)標(biāo)物：頭孢哌酮（含量94.4%，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）

實(shí)驗(yàn)研究藥品供試藥品：頭孢氨芐片5實(shí)驗(yàn)研究試劑

甲醇（Merck公司）——色譜純冰醋酸（沈陽(yáng)環(huán)化特種試劑有限公司）——分析純醋酸銨（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）——分析純?nèi)纫宜幔ū本┦信d津化工廠）——分析純水——Millipore濾過(guò)后的超純水實(shí)驗(yàn)研究試劑甲醇（Merck公6實(shí)驗(yàn)研究測(cè)定條件

色譜柱：YWGC18柱（250mm×4.6mm,10μm），

EasyguardC18保護(hù)預(yù)柱流動(dòng)相:水-甲醇-2.5mol?L-1醋酸銨-冰醋酸

（90：30：0.45：0.016v/v）流速：1.0mL?min-1柱溫：室溫25℃檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm進(jìn)樣量：50μl實(shí)驗(yàn)研究測(cè)定條件色譜柱：YWGC18柱（7實(shí)驗(yàn)研究溶液配制

儲(chǔ)備液

內(nèi)標(biāo)液沉淀劑三氯乙酸10.0%（w/v）三氯乙酸沉淀劑經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)置50ml容量瓶中去離子水溶解并定容混勻5.0g精密稱取100μg?mL-1頭孢哌酮內(nèi)標(biāo)液置50ml容量瓶中流動(dòng)相溶解并定容混勻5.0mg精密稱取頭孢哌酮置25ml容量瓶中流動(dòng)相溶解并定容混勻500μg?mL-1頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液12.5mg精密稱取頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)研究溶液配制儲(chǔ)備液三氯乙酸10.0%8實(shí)驗(yàn)研究溶液配制血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液100μg?mL-150μg?mL-125μg?mL-110μg?mL-10.5μg?mL-1精密量取0.2ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容1μg?mL-15μg?mL-1精密量取0.2ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容精密量取1ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容

500μg?mL-1

頭孢氨芐儲(chǔ)備液精密量取2ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容精密量取1ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容精密量取0.5ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容精密量取0.2ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容實(shí)驗(yàn)研究溶液配制血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液100μg?m9實(shí)驗(yàn)研究樣品處理

全血樣品肝素抗凝離心（25℃，4000r?min-1，5min）分離出血漿于-20℃低溫冷藏血漿樣品準(zhǔn)確加入500μL具塞塑料離心管中準(zhǔn)確加入100μL內(nèi)標(biāo)液（100μg?mL-1頭孢哌酮）混勻準(zhǔn)確加入200μL沉淀劑（10.0%w/v三氯乙酸）旋渦震蕩混勻離心（25℃，10000r?min-1，5min）上清液進(jìn)樣實(shí)驗(yàn)研究樣品處理全血樣品離心分離出血漿血10實(shí)驗(yàn)研究

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將上述配制的100、50、25、10、5、1、0.5μg?mL-1系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作進(jìn)樣，記錄峰面積值，以頭孢氨芐峰面積與內(nèi)標(biāo)頭孢哌酮峰面積的比值（Y）對(duì)濃度（C）作加權(quán)線形回歸，繪制血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)研究標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將上述配制的100、50、211實(shí)驗(yàn)研究方法精密度試驗(yàn)

按“血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”項(xiàng)下操作，精密配制高、中、低（100、25、1μg?mL-1）三種濃度含藥血漿（n=5），按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作進(jìn)樣，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出各血樣的藥物濃度，每種濃度1d內(nèi)平行測(cè)定5次和連續(xù)3d每天各濃度平行測(cè)定5次，分別測(cè)定日內(nèi)變異和日間變異，考察方法精密度。實(shí)驗(yàn)研究方法精密度試驗(yàn)按“血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”項(xiàng)下12實(shí)驗(yàn)研究方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)按“血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”項(xiàng)下操作，精密配制高、中、低（100、25、1μg?mL-1）三種濃度的含藥血漿（n=5），按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作進(jìn)樣，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出各血樣的藥物濃度，將求得的濃度與已知的參考濃度相比，計(jì)算血樣中頭孢氨芐的相對(duì)回收率，考察方法準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)研究方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)按“血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”項(xiàng)下13實(shí)驗(yàn)研究提取回收率試驗(yàn)

按“血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”項(xiàng)下操作，精密配制高、中、低（100、25、1μg?mL-1）三種濃度的含藥血漿（n=5），按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作進(jìn)樣，測(cè)得藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積，求其比值R1=A藥/A內(nèi)。另取同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣所測(cè)峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積，求其比值R2=A′藥/A′內(nèi)。每種濃度平行測(cè)定5次，兩比值之比（R1/R2）即血樣中頭孢氨芐的絕對(duì)回收率。實(shí)驗(yàn)研究提取回收率試驗(yàn)按“血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”14實(shí)驗(yàn)研究樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密配制高、中、低（100、25、1μg?mL-1）三種濃度的血漿樣品（n=5），分別在不同條件下處理：置-20℃及室溫反復(fù)凍融3次；置-20℃低溫放置7、14d后測(cè)定；血漿提取液室溫放置12h等進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，以確定血漿樣品的保存及樣本的室溫放置時(shí)間。實(shí)驗(yàn)研究樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)精密配制高、中、低（1015實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果空白血漿標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)物專屬性考察（1）實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果空白血漿16實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)物受試者服藥4h后血漿專屬性考察（2）實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)17實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果

頭孢氨芐峰的保留時(shí)間為8.482min，內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間為10.365min，藥物與內(nèi)標(biāo)吸收峰分離良好。血漿中的內(nèi)源性組分不影響頭孢氨芐的分離測(cè)定。專屬性考察（3）實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果18實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果

血漿中頭孢氨芐在0.5~100μg?mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。血漿中頭孢氨芐最低檢測(cè)濃度為0.5μg?mL-1（S/N>3）Y=0.1215C+0.0321(n=7)γ=0.9995

頭孢氨芐血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線Weight=1線性關(guān)系與靈敏度實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果Y=19實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果

表1頭孢氨芐血漿日內(nèi)變異測(cè)定數(shù)據(jù)及結(jié)果（n=5）

日內(nèi)變異（RSD＜15%）方法精密度（1）實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果20實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果方法精密度（2）表2頭孢氨芐血漿日間變異測(cè)定數(shù)據(jù)及結(jié)果（n=5）

日間變異（RSD＜15%）實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果方法精密度（2）表221實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果表3頭孢氨芐血漿相對(duì)回收率測(cè)定數(shù)據(jù)及結(jié)果（n=5）血漿中頭孢氨芐的相對(duì)回收率為85.5%~114.1%（RSD＜15%）

方法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表3頭孢氨芐血漿相對(duì)回收22實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果表4頭孢氨芐血漿絕對(duì)回收率測(cè)定數(shù)據(jù)及結(jié)果（n=5）血漿中頭孢氨芐的絕對(duì)回收率為51.1%~84.4%（RSD＜15%）

提取回收率實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表4頭孢氨芐血漿絕對(duì)回23實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果

精密配制高、中、低（100、25、1μg?mL-1）三種濃度的血漿樣品（n=5）：①置-20℃及室溫反復(fù)凍融3次

②冰凍放置7、14d

③血漿樣品提取后室溫放置12h等對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行考察（與日內(nèi)、日間變異同時(shí)進(jìn)行測(cè)定）。測(cè)得頭孢氨芐的血漿含量無(wú)明顯變化（RSD＜15%），頭孢氨芐穩(wěn)定性較好。樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果精密配24

討論對(duì)體內(nèi)藥物濃度測(cè)定而言，反相HPLC優(yōu)點(diǎn)明顯：可供選擇的鍵合相范圍增大，具有高效率和高選擇性；反相柱的性能不會(huì)因痕量的水分而發(fā)生改變，組分的保留時(shí)間比較恒定。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了反相高效液相色譜法進(jìn)行頭孢氨芐血漿含量的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)表明本法簡(jiǎn)便，快速，分離度好，適合對(duì)頭孢氨芐進(jìn)行血藥濃度測(cè)定。測(cè)定方法的選擇討論對(duì)25討論文獻(xiàn)報(bào)道，頭孢氨芐的最大吸收波長(zhǎng)為262nm。而以本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相為本底，所掃描到的λmax為254nm。為了增加檢出靈敏度，本方法選擇在254nm處進(jìn)行測(cè)定，色譜圖顯示基線平穩(wěn)，其他雜質(zhì)干擾較少，此波長(zhǎng)適合對(duì)頭孢氨芐血漿含量進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇討論文獻(xiàn)報(bào)道，頭孢氨芐的26討論

本實(shí)驗(yàn)曾對(duì)水-甲醇（90：30）、水-甲醇-4%醋酸-3.86%醋酸鈉（145：50：0.6：3）、水-甲醇-2.5mol·l-1醋酸銨-冰醋酸（90：30：0.45：0.016）等進(jìn)行選擇，發(fā)現(xiàn)有些作為流動(dòng)相根本無(wú)法分離樣品或分離度不好。

經(jīng)反復(fù)試驗(yàn),選擇了水-甲醇-2.5mol·l-1醋酸銨-冰醋酸（90：30：0.45：0.016）作為流動(dòng)相，分離度較好，而且組分保留時(shí)間適當(dāng)，不受干擾，能使樣品中各組分較好地分離。討論本實(shí)驗(yàn)曾對(duì)水-甲醇（27

討論

以內(nèi)標(biāo)法定量可提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。參考有關(guān)文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)曾對(duì)頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢拉定，頭孢哌酮等進(jìn)行試驗(yàn)選擇。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有些作為內(nèi)標(biāo)時(shí)分離度不好，或?qū)悠贩蛛x有干擾。

經(jīng)反復(fù)摸索最后確定了頭孢哌酮作為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間為10.365min，藥物峰的保留時(shí)間為8.482min，分離度好，且不產(chǎn)生干擾。內(nèi)標(biāo)物的選擇討論以內(nèi)標(biāo)法定量28討論在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,色譜柱性能的穩(wěn)定是十分重要的。由于本實(shí)驗(yàn)所用流動(dòng)相為水-甲醇-2.5mol·l-1醋酸銨-冰醋酸（90：30：0.45：0.016），屬水溶性流動(dòng)相，易引起微生物生長(zhǎng)而造成柱阻塞。故色譜柱應(yīng)存放在純有機(jī)溶劑或加了50%有機(jī)溶劑的水中。每次工作結(jié)束，應(yīng)用強(qiáng)溶劑如甲醇或乙腈沖洗反相柱，沖去留在柱上的強(qiáng)吸附組分。用甲醇/水為流動(dòng)相時(shí)也應(yīng)沖洗。色譜柱的保護(hù)

討論在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,色譜29

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種測(cè)定人血漿中頭孢氨芐濃度的反相高效液相色譜方法。本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、精密度高、重現(xiàn)性好，色譜行為專屬性高，頭孢氨芐與內(nèi)標(biāo)頭孢哌酮峰形良好，分離完全且無(wú)干擾。血漿中頭孢氨芐在0.5～100μg·ml-1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。本方法能滿足頭孢氨芐臨床藥代動(dòng)力學(xué)及人體生物等效性研究。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)建立了一種測(cè)定人血漿中頭30

致謝

首先我要表達(dá)深深謝意的是導(dǎo)師杜智敏教授，感謝導(dǎo)師在我的學(xué)習(xí)、課題實(shí)驗(yàn)等各方面給予的指導(dǎo)和無(wú)私幫助。衷心感謝金銳、王珍老師在課題設(shè)計(jì)及研究過(guò)程中的悉心指導(dǎo)。我還要向臨床藥物研究所的吳琳華、曲福軍、張一飛、劉艷等老師一并表示感謝，感謝他們?cè)谖业恼n題研究過(guò)程中提供的真誠(chéng)幫助和提出的有益建議。

致謝首31謝謝謝謝32頭孢氨芐血藥濃度測(cè)定方法研究

STUDYONTHEPLASMALEVELDETERMINATIONOFCEFALEXIN

學(xué)生：徐勇軍導(dǎo)師：杜智敏教授專業(yè)：臨床藥學(xué)

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥物研究所2005年6月

頭孢氨芐血藥濃度測(cè)定方法研究

STUDYONTHE33

前言

頭孢氨芐（Cefalexin）屬半合成第一代口服頭孢菌素，口服吸收迅速完全、毒性低、抗菌譜廣，臨床上主要用于尿道感染、呼吸道感染及皮膚軟組織感染，為目前我國(guó)常用抗生素類藥物。為確保用藥的安全性和有效性，常需要測(cè)定體液中藥物的濃度，以考察藥物在體內(nèi)的吸收程度。由于生物樣品取樣量少、藥物濃度低且存在內(nèi)源性物質(zhì)的干擾及個(gè)體差異等多種因素影響，所以，一種靈敏、快速、簡(jiǎn)便的體內(nèi)藥物分析方法的建立顯得尤為重要。前言頭孢34

實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕⒎聪喔咝б合嗌V測(cè)定人血漿中頭

孢氨芐濃度的方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康?5實(shí)驗(yàn)研究

儀器

Waters高效液相色譜系統(tǒng)（510泵，717自動(dòng)進(jìn)樣器，996二極管陣列檢測(cè)器，2010色譜管理系統(tǒng)）XW-80型漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）高速臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)ABBOTT公司）KQ-2300E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）

實(shí)驗(yàn)研究?jī)x器Waters高效液36實(shí)驗(yàn)研究藥品供試藥品：頭孢氨芐片

（A制劑，廣州白云山制藥總廠提供，規(guī)格0.25g/片，批號(hào)0471201）參比制劑：頭孢氨芐片（B制劑，哈藥集團(tuán)制藥總廠提供，規(guī)格0.25g/片，批號(hào)A04110678）標(biāo)準(zhǔn)品：頭孢氨芐（含量94.2%，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）內(nèi)標(biāo)物：頭孢哌酮（含量94.4%，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）

實(shí)驗(yàn)研究藥品供試藥品：頭孢氨芐片37實(shí)驗(yàn)研究試劑

甲醇（Merck公司）——色譜純冰醋酸（沈陽(yáng)環(huán)化特種試劑有限公司）——分析純醋酸銨（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）——分析純?nèi)纫宜幔ū本┦信d津化工廠）——分析純水——Millipore濾過(guò)后的超純水實(shí)驗(yàn)研究試劑甲醇（Merck公38實(shí)驗(yàn)研究測(cè)定條件

色譜柱：YWGC18柱（250mm×4.6mm,10μm），

EasyguardC18保護(hù)預(yù)柱流動(dòng)相:水-甲醇-2.5mol?L-1醋酸銨-冰醋酸

（90：30：0.45：0.016v/v）流速：1.0mL?min-1柱溫：室溫25℃檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm進(jìn)樣量：50μl實(shí)驗(yàn)研究測(cè)定條件色譜柱：YWGC18柱（39實(shí)驗(yàn)研究溶液配制

儲(chǔ)備液

內(nèi)標(biāo)液沉淀劑三氯乙酸10.0%（w/v）三氯乙酸沉淀劑經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)置50ml容量瓶中去離子水溶解并定容混勻5.0g精密稱取100μg?mL-1頭孢哌酮內(nèi)標(biāo)液置50ml容量瓶中流動(dòng)相溶解并定容混勻5.0mg精密稱取頭孢哌酮置25ml容量瓶中流動(dòng)相溶解并定容混勻500μg?mL-1頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液12.5mg精密稱取頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)研究溶液配制儲(chǔ)備液三氯乙酸10.0%40實(shí)驗(yàn)研究溶液配制血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液100μg?mL-150μg?mL-125μg?mL-110μg?mL-10.5μg?mL-1精密量取0.2ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容1μg?mL-15μg?mL-1精密量取0.2ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容精密量取1ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容

500μg?mL-1

頭孢氨芐儲(chǔ)備液精密量取2ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容精密量取1ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容精密量取0.5ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容精密量取0.2ml置于10ml容量瓶中用空白血漿定容實(shí)驗(yàn)研究溶液配制血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液100μg?m41實(shí)驗(yàn)研究樣品處理

全血樣品肝素抗凝離心（25℃，4000r?min-1，5min）分離出血漿于-20℃低溫冷藏血漿樣品準(zhǔn)確加入500μL具塞塑料離心管中準(zhǔn)確加入100μL內(nèi)標(biāo)液（100μg?mL-1頭孢哌酮）混勻準(zhǔn)確加入200μL沉淀劑（10.0%w/v三氯乙酸）旋渦震蕩混勻離心（25℃，10000r?min-1，5min）上清液進(jìn)樣實(shí)驗(yàn)研究樣品處理全血樣品離心分離出血漿血42實(shí)驗(yàn)研究

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將上述配制的100、50、25、10、5、1、0.5μg?mL-1系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作進(jìn)樣，記錄峰面積值，以頭孢氨芐峰面積與內(nèi)標(biāo)頭孢哌酮峰面積的比值（Y）對(duì)濃度（C）作加權(quán)線形回歸，繪制血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)研究標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將上述配制的100、50、243實(shí)驗(yàn)研究方法精密度試驗(yàn)

按“血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”項(xiàng)下操作，精密配制高、中、低（100、25、1μg?mL-1）三種濃度含藥血漿（n=5），按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作進(jìn)樣，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出各血樣的藥物濃度，每種濃度1d內(nèi)平行測(cè)定5次和連續(xù)3d每天各濃度平行測(cè)定5次，分別測(cè)定日內(nèi)變異和日間變異，考察方法精密度。實(shí)驗(yàn)研究方法精密度試驗(yàn)按“血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”項(xiàng)下44實(shí)驗(yàn)研究方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)按“血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”項(xiàng)下操作，精密配制高、中、低（100、25、1μg?mL-1）三種濃度的含藥血漿（n=5），按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作進(jìn)樣，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出各血樣的藥物濃度，將求得的濃度與已知的參考濃度相比，計(jì)算血樣中頭孢氨芐的相對(duì)回收率，考察方法準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)研究方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)按“血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”項(xiàng)下45實(shí)驗(yàn)研究提取回收率試驗(yàn)

按“血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”項(xiàng)下操作，精密配制高、中、低（100、25、1μg?mL-1）三種濃度的含藥血漿（n=5），按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作進(jìn)樣，測(cè)得藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積，求其比值R1=A藥/A內(nèi)。另取同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣所測(cè)峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積，求其比值R2=A′藥/A′內(nèi)。每種濃度平行測(cè)定5次，兩比值之比（R1/R2）即血樣中頭孢氨芐的絕對(duì)回收率。實(shí)驗(yàn)研究提取回收率試驗(yàn)按“血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”46實(shí)驗(yàn)研究樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密配制高、中、低（100、25、1μg?mL-1）三種濃度的血漿樣品（n=5），分別在不同條件下處理：置-20℃及室溫反復(fù)凍融3次；置-20℃低溫放置7、14d后測(cè)定；血漿提取液室溫放置12h等進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，以確定血漿樣品的保存及樣本的室溫放置時(shí)間。實(shí)驗(yàn)研究樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)精密配制高、中、低（1047實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果空白血漿標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)物專屬性考察（1）實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果空白血漿48實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)物受試者服藥4h后血漿專屬性考察（2）實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)49實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果

頭孢氨芐峰的保留時(shí)間為8.482min，內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間為10.365min，藥物與內(nèi)標(biāo)吸收峰分離良好。血漿中的內(nèi)源性組分不影響頭孢氨芐的分離測(cè)定。專屬性考察（3）實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果50實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果

血漿中頭孢氨芐在0.5~100μg?mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。血漿中頭孢氨芐最低檢測(cè)濃度為0.5μg?mL-1（S/N>3）Y=0.1215C+0.0321(n=7)γ=0.9995

頭孢氨芐血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線Weight=1線性關(guān)系與靈敏度實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果Y=51實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果

表1頭孢氨芐血漿日內(nèi)變異測(cè)定數(shù)據(jù)及結(jié)果（n=5）

日內(nèi)變異（RSD＜15%）方法精密度（1）實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果52實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果方法精密度（2）表2頭孢氨芐血漿日間變異測(cè)定數(shù)據(jù)及結(jié)果（n=5）

日間變異（RSD＜15%）實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果方法精密度（2）表253實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果表3頭孢氨芐血漿相對(duì)回收率測(cè)定數(shù)據(jù)及結(jié)果（n=5）血漿中頭孢氨芐的相對(duì)回收率為85.5%~114.1%（RSD＜15%）

方法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表3頭孢氨芐血漿相對(duì)回收54實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果表4頭孢氨芐血漿絕對(duì)回收率測(cè)定數(shù)據(jù)及結(jié)果（n=5）血漿中頭孢氨芐的絕對(duì)回收率為51.1%~84.4%（RSD＜15%）

提取回收率實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表4頭孢氨芐血漿絕對(duì)回55實(shí)驗(yàn)研究

結(jié)果

精密配制高、中、低（100、25、1μg?mL-1）三種濃度的血漿樣品（n=5）：①置-20℃及室溫反復(fù)凍融3次

②冰凍放置7、14d

③血漿樣品提取后室溫放置12h等對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行考察（與日內(nèi)、日間變異同時(shí)進(jìn)行測(cè)定）。測(cè)得頭孢氨芐的血漿含量無(wú)明顯變化（RSD＜15%），頭孢氨芐穩(wěn)定性較好。樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果精密配56

討論對(duì)體內(nèi)藥物濃度測(cè)定而言，反相HPLC優(yōu)點(diǎn)明顯：可供選擇的鍵合相范圍增大，具有高效率和高選擇性；反相柱的性能不會(huì)因痕量的水分而發(fā)生改變，組分的保留時(shí)間比較恒定。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了反相高效液相色譜法進(jìn)行頭孢氨芐血漿含量的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)表明本法簡(jiǎn)便，快速，分離度好，適合對(duì)頭孢氨芐進(jìn)行血藥濃度測(cè)定。測(cè)定方法的選擇討論對(duì)57討論文獻(xiàn)報(bào)道，頭孢氨芐的最大吸收波長(zhǎng)為262nm。而以本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相為本底，所掃描到的λmax為254nm。為了增加檢出靈敏度，本方法選擇在254nm處進(jìn)行測(cè)定，色譜圖顯示基線平穩(wěn)，其他雜質(zhì)干擾較少，此波長(zhǎng)