基因工程的主要技術(shù)原理課件

GeneticEngineering第二章基因工程的主要技術(shù)原理GeneticEngineering第二章基因工程的第二章

基因工程的主要技術(shù)原理第二章基因工程的主要技術(shù)原理由于提取DNA的目的、種類(lèi)、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法。第一節(jié)

DNA的提取與純化由于提取DNA的目的、種類(lèi)、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等基因工程的主要技術(shù)原理課件大腸桿菌基因組DNA大腸桿菌基因組DNA一、質(zhì)粒DNA的提取一、質(zhì)粒DNA的提取plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.

GenomicDNAplasmidDNAThegenomicDNAof閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（1）原理1.堿抽提法提取質(zhì)粒DNADNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強(qiáng)堿中性閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（1）原理1.堿抽提法提取質(zhì)粒DNADNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強(qiáng)堿中性閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（1）原理1染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。變性染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)（2）

所用的試劑作用①

溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。②

葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。（2）

所用的試劑作用①

溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。②

葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。（2）所用的試劑作用①溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成③EDTAMg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：強(qiáng)堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。SDS:

溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白—SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。③EDTAMg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8。用來(lái)中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥

乙醇DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。⑤NaAc-HAc緩沖液冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8。高濃度的NaAc有利于⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE緩沖液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。

Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖業(yè)），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。⑦RNaseA降解RNA渣滓。⑧TE緩沖液DNA保存蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。⑨

酚-氯仿選用以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。（3）堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟

SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA（3）堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟SolutionI的溶液II

破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至4.8）溶液II破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。第二步：破膜，蛋白上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇。第五步：純化DNA上清液過(guò)柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積最重要的是：2.影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素菌株的遺傳背景，質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。一般要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。（1）受體菌株endA基因編碼核酸內(nèi)切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可將雙鏈DNA消化成7bp的寡核苷酸片斷。最重要的是：2.影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素菌株的遺傳背景，這是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。（3）質(zhì)粒大小分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。（2）質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定。這是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。（3）質(zhì)粒大小分子量大若干常用質(zhì)粒的理論產(chǎn)量質(zhì)粒名分子大小bp拷貝數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)量g/ml

pGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.12若干常用質(zhì)粒的理論產(chǎn)量質(zhì)粒名分子大小bp拷貝數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)量g/ml

pGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.12若干常用質(zhì)粒的理論產(chǎn)量質(zhì)粒名分子大小bp拷貝數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)量g/二、基因組或其他DNA的提取

一般過(guò)程及原理：

1.細(xì)菌基因組DNA的制備（1）細(xì)胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37oC溫育。不用NaOH!二、基因組或其他DNA的提取一般過(guò)程及原理：1.細(xì)（3）沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇。（2）DNA純化CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)除去多糖，酚-氯仿-異戊醇除去蛋白。（3）沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇。（2）DNA純化CTA

一般過(guò)程及原理：動(dòng)物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末。

組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）組織粉碎2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的抽提一般過(guò)程及原理：動(dòng)物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC溫育。（2）細(xì)胞裂解（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。SDS是離子型去垢劑（detergent），可以使細(xì)胞膜崩解。（5）除去RNA污染用RNase。用2倍體積的無(wú)水乙醇。（4）沉淀DNA（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC溫育。（

一般過(guò)程及原理：

（1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。3.從植物組織中制備

DNA（2）細(xì)胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）。或1%SDS和蛋白酶K。

65oC溫育。一般過(guò)程及原理：（1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨用0.6倍體積的異丙醇（-20oC）。（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）。用0.6倍體積的異丙醇（-20oC）。（3）純化DNA用苯三、DNA的定量和純度測(cè)定1.紫外光譜法DNA（或

RNA）在260nm波長(zhǎng)處有特異的紫外吸收峰。用微量比色杯（10l）在紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定。原理：蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰三、DNA的定量和純度測(cè)定1.紫外光譜法DNA（或RNA2222溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā)

紅色熒光。2.瓊脂糖凝膠電泳估計(jì)原理：與已知濃度的DNA電泳帶熒光強(qiáng)度對(duì)比，就可以估計(jì)出DNA含量。溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā)紅色熒一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)混合液對(duì)比得知。DNA分子量Marker有許多公司的商品，使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。四、DNA分子量的估計(jì)MarkerMarker一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)混合液對(duì)比得DNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarkerDNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarkerDNAladder28kb2500bp2300bp130C

TranscriptlevelsofriceKNOXgenesOSH1andOSH3revealedbyRT-PCRinleavesfromwild-type(WT),phenotypicYAB3RNAi(Y1andY2),andWOX3overexpressionplants(W1andW2).ShootapexmRNAwasusedasapositivecontrol(S).CTranscriptlevelsofric1.帶電荷的分子在電場(chǎng)中會(huì)以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動(dòng)，速度稱(chēng)為電泳遷移率。2.電泳遷移率同電場(chǎng)的強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。3.電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。

一、電泳的基本原理第二節(jié)

DNA的凝膠電泳1.帶電荷的分子在電場(chǎng)中會(huì)以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的4.如果電場(chǎng)強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）：分子在電場(chǎng)中遷移的速度主要取決于分子本身的大小和形狀。形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān):分子量越大，移動(dòng)越慢。摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度有關(guān)。5.4.如果電場(chǎng)強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳Relaxed

supercoiled

Increasingdegreeofsupercoiling

相同分子量的DNA:閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快，線性分子次之，伸展開(kāi)環(huán)狀最慢。RelaxedsupercoiledIncreasing基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件Agarosegelelectrophoresis

Gelelectrophoresisisnotonlyusedasananalyticalmethod,itisroutinelyusedpreparativelyforthepurificationofspecificDNAfragments.Thegeliscomposedof:

Agarose:forDNAfragmentsranginginsizefromafewhundredbasepairstoabout20kb(Fig.2.1).

Polyacrylamide:forsmallerDNAfragments.Agarosegelelectrophoresis

Fig.2.1ElectrophoresisofDNAinagarosegels.DNAbandshavebeenvisualizedbysoakingthegelinasolutionofethidiumbromide(seeFig.2.2),whichcomplexeswithDNAbyintercalatingbetweenstackedbase-pairs,andphotographingtheorangefluorescence.Fig.2.1ElectrophoresisofDNFig.2.2Ethidiumbromide.

Fig.2.2Ethidiumbromide.Agarosegelisacomplexnetworkofpolymericmoleculeswhoseaverageporesizedependsonthebuffercompositionandthetypeandconcentrationofagaroseused.AgarosegelisacomplexnetwoInanyevent,gelelectrophoresisisfrequently

performedwithmarkerDNAfragmentsofknown

size,whichallowaccuratesizedeterminationofan

unknownDNAmoleculebyinterpolation(插入).

InadditiontoresolvingDNAfragmentsofdifferentlengths,gelelectrophoresiscanbeusedtoseparatedifferentmolecularconfigurationsofaDNAmolecule.Inanyevent,gelelectrophoGelelectrophoresiscanalsobeusedforinvestigatingprotein–nucleicacidinteractions,basedontheobservationthatbindingofaproteintoDNAfragmentsusuallyleadstoamobilityreduction.Gelelectrophoresiscanalso二

、瓊脂糖凝膠電泳1.瓊脂糖2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。

濃度高空隙小二、瓊脂糖凝膠電泳1.瓊脂糖2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里瓊脂糖的濃度（%）分離DNA的片斷大?。╞p）0.30.71.450000—100020000—10006000—300空隙小，分辨率高：小分子較易通過(guò)，而大分子難通過(guò)；空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過(guò)。3.瓊脂糖凝膠的分辨力空隙大小決定其分辨分子大小的能力。瓊脂糖的濃度（%）分離DNA的片斷大小（bp）0.3500

1、概述：聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Acr）單體和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Bis）通過(guò)化學(xué)催化劑（過(guò)硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加速劑或光催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。適用于不同相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的分離，且分離效果好。三

、聚丙烯酰胺凝膠電泳1、概述：聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Acr）單體優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離DNA片斷大?。╞p）4.010.020.01000—100500—2550—1三

、聚丙烯酰胺凝膠電泳其優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離DNA片斷大?。╞p）4.010.020.01000—100500—2550—1瓊脂糖凝膠電泳：1000——50000bp聚丙烯酰胺凝膠電泳：1——1000bp優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分2、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）原理與裝置（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在電場(chǎng)的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動(dòng)，移動(dòng)的速率主要取決于其分子量大小（鏈的長(zhǎng)短），從而把不同分子量的肽鏈分開(kāi)。電泳buffer電泳buffer2、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）原理與裝置（Polyacr電泳方向電泳方向基因工程的主要技術(shù)原理課件已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測(cè)樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計(jì)。商品化供應(yīng)Da道爾頓(質(zhì)量單位,等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。一克約為6×1023道爾頓3、蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測(cè)樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提DaltonSDSPAGEDaltonSDSPAGE4、凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍(lán)：靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。

硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。1）直接染色4、凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍(lán)：硝酸銀：2）轉(zhuǎn)到膜上直接染色電泳結(jié)果直接染色電泳結(jié)果四、凝膠染色1.染料溴化乙錠。Ethidiumbromide（EB）四、凝膠染色1.染料溴化乙錠。EthidiumbromiEB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。EB在300nm紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。熒光強(qiáng)度與DNA含量及大小成正比。2.原理EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。2

基因工程的主要技術(shù)原理課件UVP全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)UVP全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)OMEGA8-LOGO全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)OMEGA8-LOGO全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)

核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測(cè)特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開(kāi)，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形成雙邊結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行，因此又稱(chēng)為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測(cè)樣品的不同又被分為DNA印跡交（Southernblothybridization）和RNA印跡雜交（Northernblothybridization）。第三節(jié)

核酸的分子雜交

核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測(cè)特定大小的核酸DNA-DNA或DNA-RNA鏈雜交。用放射性同位素（32P或125I）標(biāo)記的DNA或RNA探針。DNA-DNA或DNA-RNA鏈雜交。用放射性同位素（32P

Southern雜交的基本原理是將待檢測(cè)的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。

一、SouthernblotSouthern雜交的基本原理是將待檢測(cè)的DNSouthernblot用DNA（或RNA）探針檢測(cè)DNA樣品。Southernblot用DNA（或RNA）探針檢測(cè)DNA基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件Southernblot篩選結(jié)果Southernblot篩選結(jié)果二、Northernblot用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。

在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同SouthernBlot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。其用途是檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。二、Northernblot用DNA（或RNA）探針檢測(cè)R

蛋白質(zhì)印跡(westernblot)，又稱(chēng)免疫印跡(immunoblotting)是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。

WesternBlot基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況。WesternBlot采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。三、WesternBlot＃蛋白質(zhì)印跡(wWesternblotting電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）。①Western（轉(zhuǎn)膜）膠里的蛋白質(zhì)帶在電場(chǎng)的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。膜膠蛋白Westernblotting電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)②Blotting原理與ELISA相同。待測(cè)蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗辣根過(guò)氧化物酶底物產(chǎn)物，并發(fā)出光PAGE膠待測(cè)蛋白底片曝光辣根過(guò)氧化物酶：HRPO②Blotting原理與ELISA相同。待測(cè)蛋白硝酸纖一基因工程的主要技術(shù)原理課件1）先用一抗（待測(cè)蛋白的單克隆抗體）與

膜上的蛋白結(jié)合。2）洗去未結(jié)合的一抗。3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRPO）。4）清洗掉未結(jié)合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，沖洗膠片。③Blotting過(guò)程ImmunoBlotting1）先用一抗（待測(cè)蛋白的單克隆抗體）與2）洗去未結(jié)合的一抗④結(jié)果多克隆抗體Blotting的結(jié)果單抗blotting結(jié)果④結(jié)果多克隆抗體Blotting的結(jié)果單抗blotting結(jié)四、

原位雜交對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落。需要目的基因的探針。四、原位雜交對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌33第四節(jié)

基因

擴(kuò)增技術(shù)PCR一、基因擴(kuò)增（geneamplification)指生物體內(nèi)或體外人工方式使基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。有下列五種方式：1.環(huán)境誘發(fā)擴(kuò)增2.基因的程序性擴(kuò)增5.PCR擴(kuò)增3.基因組進(jìn)化擴(kuò)增4.基因工程擴(kuò)增第四節(jié)基因擴(kuò)增技術(shù)PCR一、基因擴(kuò)增（gene1.環(huán)境誘發(fā)擴(kuò)增如氨甲喋呤誘發(fā)二氫葉酸還原酶基因擴(kuò)增。在環(huán)境因子的誘發(fā)下，某些基因產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增。在發(fā)育的某個(gè)階段，某些基因的大量擴(kuò)增。2.基因的程序性擴(kuò)增如非洲爪蟾卵子形成過(guò)程中rRNA基因的擴(kuò)增。1.環(huán)境誘發(fā)擴(kuò)增如氨甲喋呤誘發(fā)二氫葉酸還原酶基因擴(kuò)增。在環(huán)生物進(jìn)化過(guò)程中基因組中某些基因的拷貝數(shù)增加，結(jié)果相關(guān)的基因聚集成簇。5.PCR擴(kuò)增應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）技術(shù)，在體外特異性地?cái)U(kuò)增某個(gè)基因。3.基因組進(jìn)化擴(kuò)增4.基因工程擴(kuò)增載體攜帶目的基因在寄主細(xì)胞中大量復(fù)制。生物進(jìn)化過(guò)程中基因組中某些基因的拷貝數(shù)增加，結(jié)果相關(guān)的基因聚（1）1.PCR的發(fā)明二、PCR技術(shù)（2）Mullis由此獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1985年Cetus公司的科學(xué)家K.B.Mullis發(fā)明了PCR，使這一設(shè)想變成現(xiàn)實(shí)。1971年Khorana提出體外人工復(fù)制DNA的設(shè)想。當(dāng)時(shí)由于引物和DNA聚合酶及DNA測(cè)序技術(shù)都沒(méi)有解決，設(shè)想未能實(shí)現(xiàn)。PolymeraseChainReaction（1）1.PCR的發(fā)明二、PCR技術(shù)（2）Mullis由此基因工程的主要技術(shù)原理課件（3）TaqDNA聚合酶1988年

R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反應(yīng)中。使

PCR自動(dòng)循環(huán)儀成為可能。（4）PCR儀1988年

Cetus公司發(fā)明自動(dòng)熱循環(huán)儀。1986年

H.A.Erilish從嗜熱

水生菌分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37oC)，PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。（3）TaqDNA聚合酶1988年R.K.Saiki基因工程的主要技術(shù)原理課件PCR儀PCR儀2.PCR技術(shù)的原理模板DNA變性引物DNA復(fù)性引物DNA延伸2.PCR技術(shù)的原理模板DNA變性引物DNA復(fù)性引物DNA雙鏈DNA在受熱后，配對(duì)堿基的氫鍵斷裂，DNA兩條鏈分開(kāi)成為單鏈。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

TAGAACTTGACGTACGTA95oC（1）DNA模板變性模板模板（template）95oC雙鏈DNA在受熱后，配對(duì)堿基的氫鍵斷裂，DNA兩條鏈分開(kāi)成為T(mén)GCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

TAGAACTTGACGTACGTA3’

人工合成的單鏈DNA小片斷，堿基順序分別與所要擴(kuò)增的模板DNA雙鏈的5‘端相同。（2）DNA模板與引物復(fù)性模板模板ATCTTGAAC5’

3’

ACGTACGTA5’

3’

引物引物引物（primer）:40-65oCTGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGDNA聚合酶按堿基配對(duì)原則在模板上延伸DNA鏈。（3）DNA鏈的延伸TGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

TAGAACTTGACGTACGTA3’

模板模板ATCTTGAAC5’

ACGTACGTA5’

TaqTaq72oCDNA聚合酶按堿基配對(duì)原則在模板上延伸DNA鏈。（3）DNA理論上25-30次循環(huán)就可以合成225-230條DNA。變性—復(fù)性—延伸。（5）1個(gè)循環(huán)的結(jié)果（4）新一輪循環(huán)開(kāi)始DNAelongation理論上25-30次循環(huán)就可以合成225-230條DNA。變性3.PCR的過(guò)程（1）第一步

變性（denature）94-95oC下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。（2）第二步

復(fù)性（anneal）50-60oC下1分鐘，引物優(yōu)先與模板復(fù)性。①引物的濃度高，②引物的鏈短。3.PCR的過(guò)程（1）第一步變性（denat94oC下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。（4）第四步

變性（denature）72oC下1-2分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（3）第三步

延伸（extend）（5）第五步

重復(fù)（repeat）94oC下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。（4第二步——第三步——第四步復(fù)性延伸變性95oC5min50oC1min72oC2min94oC1min溫度循環(huán)第二步——第三步——第四步復(fù)性延伸變性95oC5min50PCR儀的溫度循環(huán)程序PCR儀的溫度循環(huán)程序基因工程的主要技術(shù)原理課件PCRPCR需要的模板量極低。4.PCR的特點(diǎn)（1）特異性強(qiáng)

①PCR使用專(zhuān)門(mén)合成的DNA引物。②延伸過(guò)程是在高溫下進(jìn)行。（2）敏感性高

這就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特異性。理論上只要一條模板鏈，32次循環(huán)就可合成約109條！需要的模板量極低。4.PCR的特點(diǎn)（1）特異性強(qiáng)RT-PCR：對(duì)模板的純度要求低。（5）可以擴(kuò)增mRNA（4）簡(jiǎn)便

先用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。（3）快速

整個(gè)PCR過(guò)程約4小時(shí)即可完成。不需要純化，甚至可以直接用細(xì)菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。RT-PCR：對(duì)模板的純度要求低。（5）可以擴(kuò)增mRNA自從H.A.Erilish分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37oC)，PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。（1）TaqDNA聚合酶

5.影響

PCR的因素TaqDNA聚合酶的最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合PCR過(guò)程的反復(fù)高溫變性要求。①

熱穩(wěn)定性自從H.A.Erilish分離出耐高溫的TaqDNA聚合最適溫度：

75-80oC

延伸速度：

約35-150nt/s.酶分子最長(zhǎng)延伸長(zhǎng)度：6.7kb②

最適溫度高③Taq酶的功能缺點(diǎn)具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但沒(méi)有3‘5’外切酶活性。因此不能修復(fù)錯(cuò)誤的堿基配對(duì)！

合成超過(guò)600bp長(zhǎng)度的DNA就有可能出現(xiàn)錯(cuò)配，用于克隆基因時(shí)必須測(cè)序。最適溫度：75-80oC②最適溫度高③金屬離子敏感（尤其是Mg2+

）。當(dāng)dNTP（能結(jié)合Mg2+）的濃度為0.7-0.8mmol/L時(shí)，MgCl2的最佳濃度應(yīng)是2.0mmol/L。④TaqDNA聚合酶的激活劑50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。4金屬離子敏感（尤其是Mg2+

）。當(dāng)dNTP（能結(jié)合Mg2+）的濃度為0.7-0.8mmol/L時(shí)，MgCl2的最佳濃度應(yīng)是2.0mmol/L。④TaqDNA聚合酶的激活劑50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。4金屬離子敏感（尤其是Mg2+）。④TaqDNA聚合酶（2）其它耐熱的

DNA聚合酶

①TthDNA聚合酶無(wú)3’5’DNA外切酶活性，但高溫下能逆轉(zhuǎn)錄cDNA，又能擴(kuò)增DNA。②VENTDNA聚合酶有3‘5’外切酶活性，能夠校正堿基的錯(cuò)配。能耐受100oC高溫。（2）其它耐熱的DNA聚合酶①TthDNA聚合③PfuDNAPolymerase④

TaqPlusDNAPolymerase有3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。但PCR產(chǎn)物為平端！

是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA聚合酶中出錯(cuò)率最低的。是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。

Taq的PCR產(chǎn)物3’端往往帶有一個(gè)A。③PfuDNAPolymerase④TaqPlus與待擴(kuò)增的模板DNA區(qū)段的兩3’端序列互補(bǔ)（

5‘端相同）的短DNA。（3）引物（primer)①位置3’

3’

與待擴(kuò)增的模板DNA區(qū)段的兩3’端序列互補(bǔ)（5‘端相同）的即2.751011bp的基因組中有一次完全與19個(gè)核苷酸的序列相同的機(jī)會(huì)（或機(jī)會(huì)是約2×10-11）。②引物的長(zhǎng)度理論計(jì)算：419=2.751011。一般引物設(shè)計(jì)為長(zhǎng)15—30bp。即2.751011bp的基因組中有一次完全與19個(gè)核苷酸③引物的堿基序列

5’端根據(jù)需要可設(shè)計(jì)成某個(gè)內(nèi)切酶的切點(diǎn)順序、RNA聚合酶識(shí)別序列、突變位點(diǎn)或生物素標(biāo)記等，方便與以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’

3’GCTAGCTACTTAAG5’

3’端必須與模板正確配對(duì)，5’端可以不配對(duì)。templateprimer③引物的堿基序列5’端根據(jù)需要可設(shè)計(jì)成某個(gè)內(nèi)切酶的切點(diǎn)順序盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力;④引物的堿基組成避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列。5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’

CTGCCAGTCTAC3’

GACGG5’

T發(fā)卡結(jié)構(gòu)1）2）盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力;④引物的堿基3）避免形成引物二聚體（dimer）。

兩個(gè)引物之間不能有兩個(gè)以上的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’

3’CAGGACTTAGTCACT5’

primer1primer2UpstreamprimervsDownstreamprimerSenseprimervsAntisenseprimerPrimer1vsPrimer2ForwardprimervsReverseprimer3）避免形成引物二聚體（dimer）。兩個(gè)引物之間不⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2當(dāng)引物中的（G+C）含量低于50%時(shí)，復(fù)性溫度低于55oC。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。實(shí)際復(fù)性溫度選擇低于Tm值5oC。手工計(jì)算：一般估計(jì)：⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2當(dāng)引物⑥引物的濃度一般使用終濃度各0.5mol/L。⑦簡(jiǎn)并引物

如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來(lái)的，就必須考慮密碼的簡(jiǎn)并性。需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個(gè)或幾個(gè)堿基差異。這樣的混合引物稱(chēng)簡(jiǎn)并引物。⑥引物的濃度一般使用終濃度各0.5mol/L。⑦簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)多組引物，結(jié)合位點(diǎn)依次位于前一組引物之間。增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。引物設(shè)計(jì)現(xiàn)在多用專(zhuān)業(yè)軟件

⑧套嵌引物（nestedprimers)1324如Primer5.0等設(shè)計(jì)多組引物，結(jié)合位點(diǎn)依次位于前一組引物之間。增加擴(kuò)增產(chǎn)物的Primer5.0Primer5.0基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件但不能有蛋白質(zhì)變性劑、DNA酶、Mg2+的螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。（4）模板（template)②

模板的量：不能太多，100l反應(yīng)體系中100ng足夠。①

純度：PCR對(duì)模板DNA的純度要求不高。但不能有蛋白質(zhì)變性劑、DNA酶、Mg2+的螯合劑等影響DNAdNTPs是

dATP、dTTP、dCTP和dGTP的總稱(chēng)。（5）dNTPs一般反應(yīng)體系中dNTPs混合液終濃度用0.2mmol/L。濃度過(guò)高會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加錯(cuò)配率。dNTPs是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的總TaqDNA聚合酶要求有游離的Mg2+

。（6）Mg2+

的濃度

所以Mg2+濃度不能太低。但太高會(huì)增加非特異產(chǎn)物（雜帶）。一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2終濃度。TaqDNA聚合酶要求有游離的Mg2+。（6）Mg2+借助于熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物?？梢宰龅絇CR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)Ct值確定起始DNA的拷貝數(shù)，做到真正意義上的DNA定量。

6.PCR技術(shù)的擴(kuò)展（1）熒光實(shí)時(shí)定量PCRReal—time

PCR（或TaqMan

PCR）Ct值：樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

借助于熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物?？梢宰龅絇CR每循環(huán)一次就收擴(kuò)增兩個(gè)引物外側(cè)的未知序列（2）反向PCR把線性DNA模板轉(zhuǎn)變成環(huán)形分子。templatetemplate3’

5’

5’

3’

（傳統(tǒng)PCR只擴(kuò)增兩個(gè)引物質(zhì)之間的已知序列）。技術(shù)關(guān)鍵：擴(kuò)增兩個(gè)引物外側(cè)的未知序列（2）反向PCR把線性DNA使引物的外側(cè)序列“轉(zhuǎn)變”成內(nèi)側(cè)序列。使引物的外側(cè)序列“轉(zhuǎn)變”成內(nèi)側(cè)序列。低濃度的引物（限制引物）首先被用完，隨后只有高濃度的引物，繼續(xù)合成單鏈DNA。最后產(chǎn)物中99%是單鏈DNA。（3）不對(duì)稱(chēng)PCR3’

5’

5’

3’

引物少用于擴(kuò)增單鏈DNA，單鏈DNA更適于測(cè)序。技術(shù)關(guān)鍵：兩個(gè)引物的濃度相差100倍。低濃度的引物（限制引物）首先被用完，隨后只有高濃度的引物，繼擴(kuò)增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。（4）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR)Temin,H.發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶，1975諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)關(guān)鍵：利用反轉(zhuǎn)錄酶，把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。（4）反轉(zhuǎn)錄PCR（RNAtemplate3’

5’

下游引物cDNAfirststrand3’

5’

上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’

5’

3’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶RNAtemplate3’5’下游引物cDNAfirFig.3.RT-PCRanalysisofGbd1andGbd2inPima90followinginfectionbyV.dahliaeafter0,2,4,8,12,24,48,72and96h,respectively.M:100bpDNAladder.his-3ofcottonasthecontrol.Fig.3.RT-PCRanalysisofGbd7.PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）擴(kuò)增某一段DNA從基因組中擴(kuò)增；從載體上擴(kuò)增；組織樣本原位擴(kuò)增；微量殘留DNA擴(kuò)增；分析模板序列；7.PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）擴(kuò)增某一段DNA從基因組中在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復(fù)、插入、替換等）。（2）基因的體外誘變技術(shù)關(guān)鍵：利用引物的5‘端序列不要求與模板嚴(yán)格配對(duì)，設(shè)計(jì)引物時(shí)引入突變序列。在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復(fù)、插入、替換等）。（2）基因的體外誘變技術(shù)關(guān)鍵：利用引物的5‘端序列不要求與模板嚴(yán)格配對(duì)，設(shè)計(jì)引物時(shí)引入突變序列。在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復(fù)、插入、替換等）。（2）基因的體外誘變技術(shù)關(guān)鍵：利用引物的5‘端序列不要求與模板嚴(yán)格配對(duì)，設(shè)計(jì)引物時(shí)引入突變序列。在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復(fù)、插入、替換等）。（2設(shè)計(jì)引物定點(diǎn)誘變?cè)O(shè)計(jì)引物定點(diǎn)誘變利用6bp長(zhǎng)度的隨機(jī)序列引物擴(kuò)增細(xì)胞中的總DNA，將會(huì)得到許多非特異性產(chǎn)物，反映了該引物序列在基因組中的分布狀況。（3）基因組的比較研究

比較不同物種之間的基因組特征和相似性。類(lèi)似于限制性內(nèi)切酶片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析，因而也稱(chēng)為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）分析。RAPD(RandomamplifiedpolymorphismDNA)利用6bp長(zhǎng)度的隨機(jī)序列引物擴(kuò)增細(xì)胞中的總DNA，將會(huì)得到許1970年人們就有足夠的理論知識(shí)來(lái)提出目前所用的快速DNA序列分析法。但當(dāng)時(shí)在認(rèn)識(shí)上和技術(shù)上存在兩個(gè)問(wèn)題：當(dāng)時(shí)沒(méi)有能把不同長(zhǎng)度的核苷酸片斷分離開(kāi)的技術(shù)。當(dāng)時(shí)的分析思路局限于RNA序列分析法。第五節(jié)

DNA序列分析（1965年Cornell大學(xué)的S.W.Holley等首次測(cè)定了75bp的酵母丙氨酸t(yī)RNA全序列。使用的是降解片斷法）。51970年人們就有足夠的理論知識(shí)來(lái)提出目前所用的快速DNA序Sanger等1977年發(fā)明。一、雙脫氧鏈終止法FrederickSanger,1980年NobelPrize化學(xué)獎(jiǎng)Sanger等1977年發(fā)明。一、雙脫氧鏈終止法Freder（1）DNA復(fù)制是以一條鏈為模板，按堿基配

對(duì)的原則進(jìn)行的。（2）脫氧核糖的連接是以3’5’磷酸二脂鍵。（3）復(fù)制反應(yīng)可以在體外進(jìn)行。（4）2’和3’雙脫氧的ddNTP會(huì)使復(fù)制反應(yīng)終

止。1.原理

（1）DNA復(fù)制是以一條鏈為模板，按堿基配1.原理基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件（1）制備單鏈DNA模板2.技術(shù)要點(diǎn)

就是待測(cè)序的

DNA鏈。①不能有5’3’和3’5’的外切酶活性；②與模板的親和力高，不會(huì)提前脫離模板。

（3）特殊的DNA多聚酶dNTP/ddNTP=100/1

（4）制備2’和3’雙脫氧的ddNTP時(shí),DNA電泳帶譜的分離效果最好，可讀出200多個(gè)核苷酸序列。（1）制備單鏈DNA模板2.技術(shù)要點(diǎn)就是待測(cè)序的需帶有放射性或熒光標(biāo)記。（2）制備一小段單鏈引物（DNA或RNA）需帶有放射性或熒光標(biāo)記。（2）制備一小段單鏈引物（DNA或R3.Sanger雙脫氧終止法測(cè)序過(guò)程3.Sanger雙脫氧終止法測(cè)序過(guò)程基因工程的主要技術(shù)原理課件模板序列模板序列1977年，哈佛大學(xué)的A.M.Maxam和W.Gilbert發(fā)明。二、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法WalterGilbert,1980年NobelPrize化學(xué)獎(jiǎng)1977年，哈佛大學(xué)的A.M.Maxam和W.Gilbe末端放射性標(biāo)記的DNA片單鏈長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的DNA鏈混合物化學(xué)試劑處理凝膠電泳放射性自顯影閱讀堿基順序特定的堿基中引入化學(xué)基團(tuán)DNA在被修飾的核苷酸位置斷裂1.原理

末端放射性標(biāo)記長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷化學(xué)試劑處理凝膠電泳放射性堿基特異修飾方法GpH8.0,用硫酸二甲脂對(duì)N7進(jìn)行甲基化，使C8-C9鍵對(duì)堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0,哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化，從而導(dǎo)致脫嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開(kāi)嘧啶環(huán)，后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易于除去C在1.5mol/LNaCl存在時(shí)，可用肼除去胞嘧啶2.堿基特異的化學(xué)修飾法

堿基特異修飾方法GpH8.0,用硫酸二甲脂對(duì)N7進(jìn)行甲基化，反應(yīng)切割堿基修飾修飾堿基的轉(zhuǎn)移DNA鏈的斷裂R1G>A硫酸二甲脂pH7.0加熱氫氧化鈉R2A>G硫酸二甲脂酸氫氧化鈉R3C+T肼六氫吡啶六氫吡啶R4C肼+鹽六氫吡啶六氫吡啶R5G硫酸二甲脂六氫吡啶六氫吡啶R6G+A酸酸六氫吡啶R7C+T肼六氫吡啶六氫吡啶R8C肼+鹽六氫吡啶六氫吡啶R9A>C氫氧化鈉六氫吡啶六氫吡啶R10G>A硫酸二甲脂pH7.0加熱六氫吡啶R11G亞甲藍(lán)六氫吡啶六氫吡啶R12T四氧化鋨六氫吡啶六氫吡啶3.堿基特異的化學(xué)切割法

反應(yīng)切割堿基修飾修飾堿基的轉(zhuǎn)移DNA鏈的斷裂R1G>A硫酸二4.測(cè)序過(guò)程

4.測(cè)序過(guò)程每組反應(yīng)只針對(duì)特定的堿基，共有4組反應(yīng)，可分別顯示G、A+G、C、C+T的終止位置。特點(diǎn)：讀出的序列就是要測(cè)的序列。Sanger測(cè)序法讀出的序列是新合成的互補(bǔ)鏈序列。每組反應(yīng)只針對(duì)特定的堿基，共有4組反應(yīng)，可分別顯示G、A+G基因工程的主要技術(shù)原理課件基因工程的主要技術(shù)原理課件測(cè)序讀片測(cè)序讀片90年代初期由英國(guó)、前南斯拉夫和俄羅斯的4個(gè)科學(xué)家小組同時(shí)提出來(lái)的。1.原理

（1）只有完全互補(bǔ)的DNA序列才能雜交形

成完全的雙鏈分子。雜交效率最高。三、DNA雜交測(cè)序（2）有個(gè)別不互補(bǔ)堿基時(shí)，雜交效率下降。（3）非互補(bǔ)堿基越多，雜交效率越差。90年代初期由英國(guó)、前南斯拉夫和俄羅斯的4個(gè)科學(xué)家小組同時(shí)提（4）用一段寡居聚苷酸（8-mer）的所有可能的堿基排列序列作探針。8mer探針有48=65536種序列。如：

8-mer靶DNA同65536中的一種探針完全雜交形成完全互補(bǔ)雙鏈。

（5）根據(jù)雜交效率可推斷出靶DNA的序列。5’-AGCCTAGC-3’

Target3’-TCGGATCG-5’

Probe假如探針序列已知，則可推知靶DNA序列。

（4）用一段寡居聚苷酸（8-mer）的所有可能的堿基排列序列但：

12mer靶DNA與8-mer探針雜交，將會(huì)有5種探針與之形成完全互補(bǔ)雙鏈。3’-TCGGATCG-5’

3’-CGGATCGA-5’

3’-GGATCGAC-5’

3’-GATCGACT-5’

3’-ATCGACTT-5’

5’-AGCCTAGCTGAA-3’

12-mertarget8-merprobe假如知道能與之完全雜交的所有5種探針序列，就可推知12bp的靶DNA序列。但：12mer靶DNA與8-mer探針雜交，將會(huì)有5種探（1）DNA芯片（chip）把寡聚核苷酸探針的3‘端或5’端與玻璃或凝膠形成共價(jià)連接。目前可以做出65536種8-mer探針芯片。2.技術(shù)要點(diǎn)

每種探針的序列和位置已知，可被電腦讀出。（1）DNA芯片（chip）把寡聚核苷酸探針的3‘端或5’端基因工程的主要技術(shù)原理課件DNAchip雜交DNAchip雜交（1）非放射性標(biāo)記1981年第一臺(tái)商業(yè)化生產(chǎn)的DNA自動(dòng)測(cè)序儀誕生。四、DNA自動(dòng)化測(cè)序熒光物質(zhì)標(biāo)記。用激光能激發(fā)出不同顏色的熒光。1.技術(shù)要點(diǎn)（2）不同的標(biāo)記對(duì)象既可標(biāo)記引物，也可標(biāo)記ddNTP。（1）非放射性標(biāo)記1981年第一臺(tái)商業(yè)化生產(chǎn)的DNA自動(dòng)測(cè)序（4）分析自動(dòng)化（3）讀片的自動(dòng)化激光探頭直接讀膠，實(shí)時(shí)閱讀。（2）反應(yīng)的自動(dòng)化Sanger脫氧終止法。電腦自動(dòng)把熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的堿基，并打印出DNA序列。（5）反應(yīng)可在一個(gè)試管中進(jìn)行標(biāo)記ddNTP時(shí)。（4）分析自動(dòng)化（3）讀片的自動(dòng)化激光探頭直接讀膠，實(shí)時(shí)閱2.熒光標(biāo)記引物的自動(dòng)化測(cè)序①分別用4種熒光物標(biāo)記引物，②區(qū)分反應(yīng)產(chǎn)物，③混合電泳，④激光一次讀膠，⑤電腦合成結(jié)果。2.熒光標(biāo)記引物的自動(dòng)化測(cè)序①分別用4種熒光物標(biāo)記引物，基因工程的主要技術(shù)原理課件3.熒光標(biāo)記ddNTP自動(dòng)測(cè)序原理圖解4種不同的熒光物分別標(biāo)記4種ddNTP。3.熒光標(biāo)記ddNTP自動(dòng)測(cè)序原理圖解4種不同的熒光物分別可在同一管中進(jìn)行可在同一管中進(jìn)行可在單一泳道電泳?？稍趩我挥镜离娪?。熒光標(biāo)記終止法測(cè)序熒光標(biāo)記終測(cè)序結(jié)果測(cè)序結(jié)果毛細(xì)管測(cè)序儀日本開(kāi)發(fā)的世界上最高速DNA測(cè)序儀。可同時(shí)解析384個(gè)樣品！標(biāo)記法：4色熒光、引物標(biāo)記/終端標(biāo)記。測(cè)序長(zhǎng)度：600bp/毛細(xì)管6毛細(xì)管測(cè)序儀日本開(kāi)發(fā)的世界上最高速DNA測(cè)序儀?？赏瑫r(shí)解析384個(gè)樣品！標(biāo)記法：4色熒光、引物標(biāo)記/終端標(biāo)記。測(cè)序長(zhǎng)度：600bp/毛細(xì)管6毛細(xì)管測(cè)序儀日本開(kāi)發(fā)的世界上最高速DNA測(cè)序儀?？赏瑫r(shí)解析3第六節(jié)

酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwoHybridSystem(Interactiontrap)90年代，紐約大學(xué)的S.Field等建立。第六節(jié)酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwoHybridConstructedthreesetoftestrecombinationPlasmidsintoyeast(雙因子雜交系統(tǒng))GAL4activationdomainLexDNA-bindingdomainGAL1operatorLacZasreporterUASGGAL1operatorLacZasreporterGAL1operatorLacZasreporterLexAenhancer1、雙因子雜交試驗(yàn)：ConstructedthreesetoftestGAL1operatorLacZasreporterUASGGAL1operatorLacZasreporterGAL1operatorLacZasreporterLexAΒ-galactosidase1800unitsNothing520unitsGAL4GAL4-LexAGAL4+UASenhanciingGAL1LacZNoactivatornoLacZexpressingLexA+LexA.GAL4activation

GAL1LacZexpressingenhancerGAL1operatorLacZasreporterTranscription-activatingandDNA-bindingdomainofGAL4canoperatequiteindependentlyFunctionofactivationdomain

recruitmenttheRNApolymerasetopromoterGAL1operatorLacZasreporterLexAConclusion：Transcription-activatingandD

Differentacidicactivationdomainmayregulatedifferentcis-factortargets

真核生物以多種轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體方式（多種組合）與cis-factor結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄

表現(xiàn)一種復(fù)雜而又靈活的

positivecontrolsystemDifferentacidicactivationd

雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程調(diào)控的認(rèn)識(shí)。轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular),即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,簡(jiǎn)稱(chēng)為DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain,簡(jiǎn)稱(chēng)為AD),

它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨(dú)的DB雖然能和啟動(dòng)子結(jié)合,但是不能激活轉(zhuǎn)錄。不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。如酵母細(xì)胞的Gal4蛋白的DB與大腸桿菌的一個(gè)酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點(diǎn)并激活轉(zhuǎn)錄。2、酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeasttwohybridsystem）雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄起

Fields等人建立了雙雜交系統(tǒng):（1）以兩個(gè)蛋白質(zhì)Snf1（X）和Snf2（Y）為對(duì)象,（X）與Gal4的DB結(jié)構(gòu)域融合,（Y）與Gal4的AD結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合。由DB和AD形成的融合蛋白分別稱(chēng)之為“誘餌”(bait)和“獵物”或靶蛋白(preyortargetprotein)。如果在X和Y之間存在相互作用,那么分別位于這兩個(gè)融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子,從而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。（2）這個(gè)被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱(chēng)之為報(bào)道基因(reportergene)。通過(guò)對(duì)報(bào)道基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè),反過(guò)來(lái)可判別作為“誘餌”和“獵物”的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。Fields等人采用編碼β-半乳糖苷酶的LacZ作為報(bào)道基因,并且在該基因的上游調(diào)控區(qū)引入受Gal4蛋白調(diào)控的GAL1序列。這個(gè)改造過(guò)的LacZ基因被整合到酵母染色體URA3位上。（3）酵母本身的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的負(fù)調(diào)控因子)被缺失,從而排除了細(xì)胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響。（4）結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有同時(shí)轉(zhuǎn)化了Snf1和Snf2融合表達(dá)載體的酵母細(xì)胞才有β-半乳糖苷酶活性，單獨(dú)轉(zhuǎn)化其中任何一個(gè)載體都不能檢測(cè)出β-半乳糖苷酶活性。Fields等人建立了雙雜交系統(tǒng):（1酵母雙雜交技術(shù)的基本原理DBAD酵母雙雜交技術(shù)的基本原理DBAD&*構(gòu)建雙雜交體系的宿主菌

刪除基因組中的內(nèi)源野生型GAL4基因使酵母菌只能利用載體表達(dá)的GAL4蛋白。如：SFY526;HF7c等菌株。&*構(gòu)建報(bào)告基因（reportergene）GAL4激活組氨酸合成酶的表達(dá)，使酵母菌能生長(zhǎng)在組氨酸缺乏培養(yǎng)基上。GAL4的效應(yīng)基因是his3/lacZ/URA3。此外還有其他營(yíng)養(yǎng)缺陷。3、酵母雙雜交的操作過(guò)程&*構(gòu)建雙雜交體系的宿主菌刪除基因組中的內(nèi)源野生型1）穿梭質(zhì)粒（shuttleplasmid）&*構(gòu)建雙雜交體系的穿梭質(zhì)粒既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在酵母菌中復(fù)制和表達(dá)的質(zhì)粒。2）雙雜交體系需要兩種穿梭質(zhì)粒分別攜帶已知的靶蛋白基因和攜帶未知基因序列。1）穿梭質(zhì)粒（shuttleplasmid）&*構(gòu)建靶基因按正確的讀碼結(jié)構(gòu)和取向克隆在GAL4的BD之后。①BD-plasmidP:ADH1啟動(dòng)子。T:ADH1終止子。篩選標(biāo)志：TRP核定位信號(hào)是GAL4本身的一部分ADH：Alcoholdehydrogenase靶基因按正確的讀碼結(jié)構(gòu)和取向克隆在GAL4的BD之后。①BD②AD-plasmid外源基因按正確閱讀框克隆到GAL4的AD片斷之后。P:ADHI啟動(dòng)子。T:ADHI終止子。篩選標(biāo)志：LEU2核定位信號(hào)是SV40的T抗原的序列②AD-plasmid外源基因按正確閱讀框克隆到GAL4的A&*酵母雙雜交的實(shí)驗(yàn)過(guò)程1）把蛋白A插入到BD質(zhì)粒上（pGBT9）2）把蛋白B插入到AD質(zhì)粒上（pGAD424）3）兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母菌（HF7c）報(bào)告基因：HIS（合成組氨酸）4）篩選觀察&*酵母雙雜交的實(shí)驗(yàn)過(guò)程1）把蛋白A插入到BD質(zhì)粒上（p（1）存活選擇在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）培養(yǎng)基上篩選雙載體轉(zhuǎn)化子。雙載體轉(zhuǎn)化才能合成亮氨酸和色氨酸，菌體存活。Trp-Leu-（1）存活選擇在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）培養(yǎng)基在缺少組氨酸（HIS）、亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）的培養(yǎng)基上篩選蛋白A和蛋白B能相互作用的雙載體轉(zhuǎn)化子。（2）蛋白結(jié)合選擇His-Trp-Leu-在缺少組氨酸（HIS）、亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）的基因工程的主要技術(shù)原理課件GeneticEngineering第二章基因工程的主要技術(shù)原理GeneticEngineering第二章基因工程的第二章

基因工程的主要技術(shù)原理第二章基因工程的主要技術(shù)原理由于提取DNA的目的、種類(lèi)、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法。第一節(jié)

DNA的提取與純化由于提取DNA的目的、種類(lèi)、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等基因工程的主要技術(shù)原理課件大腸桿菌基因組DNA大腸桿菌基因組DNA一、質(zhì)粒DNA的提取一、質(zhì)粒DNA的提取plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.

GenomicDNAplasmidDNAThegenomicDNAof閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（1）原理1.堿抽提法提取質(zhì)粒DNADNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強(qiáng)堿中性閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（1）原理1.堿抽提法提取質(zhì)粒DNADNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強(qiáng)堿中性閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（1）原理1染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。變性染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)（2）

所用的試劑作用①

溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。②

葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。