基礎(chǔ)與臨床-課件

p53基因治療的基礎(chǔ)與臨床研究北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院張珊文2007年11月p53基因治療的基礎(chǔ)與臨床研究北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院1

P53基因結(jié)構(gòu)：p53基因定位于人染色體17p13.1區(qū)位，全長16～20kb,有11個外顯子和10個內(nèi)含子，分子量為53KD的磷酸核蛋白，含393個氨基酸。功能：具轉(zhuǎn)錄因子的功能。野生型p53具細(xì)胞周期檢查點功能，使受損細(xì)胞阻滯于G1期（或G2期）并引導(dǎo)細(xì)胞凋亡。突變型p53即喪失該功能，起癌基因作用。P53基因結(jié)構(gòu)：p53基因定位于人染色體17p13.1區(qū)位2p53基因染色體定位p53基因染色體定位3p53基因結(jié)構(gòu)p53基因結(jié)構(gòu)4功能：基因組保護(hù)神功能：基因組保護(hù)神5第一部分研究

p53對人胃癌細(xì)胞放射敏感性和熱敏感性的作用第一部分研究p53對人胃癌細(xì)胞放射敏感性和熱敏感6

國家自然科學(xué)基因課題（95規(guī)劃）4種不同p53狀況胃癌細(xì)胞4Gy劑量照射后，僅wtp53細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的G1期阻滯(分別占原細(xì)胞總數(shù)的67.9％和61.1％)，和細(xì)胞凋亡(比例分別達(dá)13.0%和15.3%)。而其他3種p53異常的細(xì)胞都沒有出現(xiàn)明顯的G1期阻滯和凋亡效應(yīng)。國家自然科學(xué)基因課題（95規(guī)劃）74種胃癌細(xì)胞4Gy照射后w細(xì)胞、M細(xì)胞、neo細(xì)胞和823細(xì)胞生存率分別為0.1080.006、0.1550.004、0.1470.007和0.1400.013,W細(xì)胞生存率顯著地低于后三種細(xì)胞（p<0.05）4種胃癌細(xì)胞腫瘤10Gy照射后體積抑制曲線：w細(xì)胞腫瘤放射反應(yīng)曲線明顯受到抑制4種胃癌細(xì)胞4Gy照射后w細(xì)胞、M細(xì)胞、neo細(xì)胞和823細(xì)8p53對人胃癌細(xì)胞熱敏感性的作用4種不同p53狀況胃癌細(xì)胞在42°C2h或43°C30min后8h，僅W細(xì)胞S期比例明顯增加（P<0.05）分別占53.5％或50.0％，凋亡比率分別達(dá)10.5%和12.3%。而其他3種細(xì)胞的S期比例無明顯增高，凋亡比例都為0(p<0.05)。p53對人胃癌細(xì)胞熱敏感性的作用4種不同p53狀況胃癌細(xì)胞在94種細(xì)胞種植腫瘤兩次43°C20min加熱后，w細(xì)胞腫瘤抑制曲線增長緩慢，到20天時僅增大了1倍，而其他3種細(xì)胞腫瘤增長迅速，到20天時增大了2.73.6倍,生長速度顯著地高于W細(xì)胞（P<0.05）。4種細(xì)胞種植腫瘤兩次43°C20min加熱后，w細(xì)胞腫瘤10第二部分研究重組人p53腺病毒對人胃癌細(xì)胞放射敏感性和熱敏感性作用第二部分研究重組人p53腺病毒對人胃癌細(xì)胞放射敏感性和熱敏感11作用機(jī)制Bax凋亡壞死作用機(jī)制Bax凋亡壞死12重組腺病毒顆粒激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞提高抗腫瘤體液免疫和細(xì)胞免疫力免疫系統(tǒng)作用機(jī)制重組腺病毒顆粒激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞提高抗腫瘤體13轉(zhuǎn)染率與病毒劑量病毒量為50MOI時，四種胃癌細(xì)胞感染率40%左右；100MOI時，感染率達(dá)80～90%（multiplicityofinfection,MOI,效靶比）。轉(zhuǎn)染率與病毒劑量病毒量為50MOI時，四種胃癌細(xì)胞感染14Adp53表達(dá)定位1:100MOI效靶比Adp53產(chǎn)生細(xì)胞高轉(zhuǎn)染率（100％）和p53基因在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，產(chǎn)生G2/M期阻滯和凋亡增加和細(xì)胞增殖抑制Adp53表達(dá)定位1:100MOI效靶比Adp53產(chǎn)生細(xì)胞高15圖1100MOIAdp53感染4種胃癌細(xì)胞48小時后p53蛋白的免疫組化染色。Adp53感染細(xì)胞核著棕色。顯示p53表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)并達(dá)到100％轉(zhuǎn)染。1.Marker2.W+Adp533.Wcontrol4.M+Adp535.Mcontrol6.neo+Adp537.neocontrol8.823+Adp539.823control圖2：Westernblot印記法顯示4種胃癌細(xì)胞100MOIAdp53感染后48小時，在53KD位置上均有一條清晰的雜交帶，表明p53蛋白高表達(dá)。

Wt

MutNeoBGC-823圖1100MOIAdp53感染4種胃癌細(xì)胞48小時后p516圖3.4種胃癌細(xì)胞100MOIAdp53感染后48小時TUNEL法染色顯示高比率凋亡細(xì)胞被染成棕色。圖3.4種胃癌細(xì)胞100MOIAdp53感染后48小時T17表1Adp53結(jié)合4Gy照射胃癌細(xì)胞存活率

存活分?jǐn)?shù)

細(xì)胞系A(chǔ)d-p53組4Gy組p53+4Gy組

Wtp530.626±0.0190.117±0.0130.094±0.001

Mutp530.369±0.0240.169±0.0020.076±0.009Neo0.518±0.0160.152±0.004

0.110±0.005

8230.526±0.0230.150±0.005

0.108±0.025

注:采用HotellingT2檢驗表明Ad-p53+4Gy組存活分?jǐn)?shù)顯著低于4Gy組（P<0.001）Adp53結(jié)合放射實驗表1Adp53結(jié)合4Gy照射胃癌細(xì)胞存活率18

表2Adp53結(jié)合4Gy照射對4種胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響（FCM法）細(xì)胞系條件G1SG2/MSub-G1凋亡率比值Wtp53對照組48.25.029.64.022.24.04.91.1Adp5343.612.031.810.524.616.510.61.64Gy61.013.97.513.42.0

Adp53＋4Gy41.512.021.76.5

36.815.5

39.95.0

3.0#Mutp53對照組48.512.039.55.512.010.05.52.0Adp5340.32.038.716.021.010.017.93.24Gy40.514.044.516.014.03.012.74.0

Adp53＋4Gy34.84.034.316.5

30.811.0

45.510.0

3.6Neo對照組44.05.033.36.522.75.07.02.5Adp5339.25.534.76.526.17.518.02.94Gy43.09.030.27.526.86.511.45.0

Adp53＋4Gy29.78.036.27.5

34.19.5

25.12.5

2.2823對照組52.03.034.85.513.24.05.13.0Adp5342.54.039.82.021.66.015.84.84Gy53.612.529.510.516.92.011.83.0

Adp53＋4Gy9.0

27.97.0

29.86.3

2.5表2Adp53結(jié)合4Gy照射對4種胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期19表3Adp53結(jié)合4Gy照射4種胃癌細(xì)胞的凋亡率(TUNEL法)

凋亡率（%）

細(xì)胞系對照組Ad-534Gyp53+4Gy凋亡率比值

Wt-p531.018.00.512.02.0

40.02.53.3*Mut-p530.028.02.03.01.0

48.03.5

16.0Neo0.026.03.05.50.5

36.00.56.5BGC8230.025.04.05.01.0

35.01.57.0

*凋亡率比值＝Adp53＋4Gy的凋亡率/單純4Gy的凋亡率表3Adp53結(jié)合4Gy照射4種胃癌細(xì)胞的凋20W細(xì)胞腫瘤Adp53對6Gy照射的抑瘤率比值為1.41,而對M細(xì)胞腫瘤為1.91。

圖5.2示Adp53結(jié)合6Gy照射對M細(xì)胞腫瘤的抑制作用

圖5.1示Adp53結(jié)合6Gy照射對W細(xì)胞腫瘤的抑制作用相對體積W細(xì)胞腫瘤Adp53對6Gy照射的抑瘤率比值為1.41,而對21相對體積

表1Adp53結(jié)合加溫對W細(xì)胞周期和凋亡的作用（FCM）條件G1SG2/MSub-G1熱增效比對照7.322.0Adp5338.52.426.82.734.71.08.50.742C2h36.85.037.83.925.36.06.54.843C0.5h42.07.134.04.724.04.314.212.2Adp53+42C2h

6.7

34.02.9

21.49.8

3.3Adp53+43C0.5h7.6

23.87.1

22.512.2

1.6

表2Adp53結(jié)合加溫對M細(xì)胞周期和凋亡的作用（FCM）

條件G1SG2/MSub-G1熱增效比對照45.81.534.80.520.0Adp5341.32.442C2h41.35.036.512.222.043C0.5h43.83.938.54.712.2Adp53+42C2h42.510.832.03.3

25.3

2.1Adp53+43C0.5h41.52.536.39.9

22.512.513.30.5

1.8相對體積表1Adp53結(jié)合加溫對W細(xì)22

時間（天）圖6.1Adp53結(jié)合43C0.5hW細(xì)胞腫瘤抑制曲線

時間（天）圖6.2Adp53結(jié)合43C0.5hW細(xì)胞腫瘤抑制曲線相對體積

W細(xì)胞種植腫瘤相對生長曲線(見圖6.1)：單純43C0.5h加溫、單純Adp53和Adp53結(jié)合43C0.5h，腫瘤抑制率分別為15.8%、21.8%和27.2%,Adp53的熱增效比為1.7。M細(xì)胞種植腫瘤相對生長曲線（見圖6.2）：單純加溫、單純Adp53和Adp53結(jié)合加溫，腫瘤抑制率分別為24.2%、31.0%和37.8%，Adp53的熱增效比為1.6。時23臨床研究GeneTherapydream臨床研究GeneTherapydream24p53基因－放療

野生型p53促進(jìn)放射線引發(fā)的細(xì)胞周期阻滯和凋亡。而變異p53減弱甚至取消這種效應(yīng)腺病毒介導(dǎo)p53恢復(fù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)p53的功能，提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性。p53基因－放療野生型p53促進(jìn)放射線引發(fā)的細(xì)胞周期阻滯25試驗材料重組人p53腺病毒注射液（今又生）今又生結(jié)構(gòu)：E1基因缺失的攜帶人野生型p53基因的5型腺病毒試驗材料重組人p53腺病毒注射液（今又生）26基礎(chǔ)與臨床-課件27Adp53structure

GendicineisanE1substitutedreplication-incompetentrecombinantadenovirusencodingthehumanp53gene.E1A/E1Bdeletionp53StructuralproteinsE4E2E3Adp53structureGendicineisa28病毒表面的蛋白質(zhì)與細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)通過“配子與配體”結(jié)合的方式，整個病毒顆粒被細(xì)胞吞噬入細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞漿內(nèi)，病毒外殼與內(nèi)核的DNA分離，其中外殼蛋白質(zhì)被降解；DNA進(jìn)入細(xì)胞核。在核內(nèi)，DNA轉(zhuǎn)錄出RNA（mRNA),mRNA從胞核出來進(jìn)入細(xì)胞漿；在胞漿翻譯出p53蛋白質(zhì)，p53蛋白質(zhì)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)再進(jìn)入到細(xì)胞核與核內(nèi)的DNA結(jié)合，以調(diào)節(jié)DNA（基因）表達(dá)。病毒表面的蛋白質(zhì)與細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)通過“配子與配體”結(jié)合的方29P53基因治療的臨床機(jī)理瘤內(nèi)注射今又生p53基因及其靶基因的表達(dá)治療P53基因上調(diào)P21基因及Bax基因下調(diào)VEGF基因方法：IHC和RT－PCR及測序P53基因治療的臨床機(jī)理瘤內(nèi)注射今又生p53基因及其靶基因的30免疫組化法評價今又生瘤內(nèi)注射后p53基因表達(dá).張子苑NPC例，注藥前p53－Adp53注射后p53+75%免疫組化法評價今又生瘤內(nèi)注射后p53基因表達(dá).張子苑NPC例31劉凱惡性神經(jīng)鞘瘤例注藥前P53<+25%,PCR+何華樹注藥后P53＋25％何華樹骨肉瘤例，注藥前P53－,PCR±劉凱注藥后P53>+75%,PCR++P53基因表達(dá)劉凱惡性神經(jīng)鞘瘤例注藥前P53<+25%,PCR+何華樹32張沂擇舌癌例，注藥前P21－張沂擇注藥后P21＋50％丁先進(jìn)NPC例，注藥前P21—丁先進(jìn)注藥后P21＋25％P21基因表達(dá)張沂擇舌癌例，注藥前P21－張沂擇注藥后P21＋50％丁先進(jìn)33丁先進(jìn)NPC，注藥前Bax－丁先進(jìn)注藥后Bax＋25～50％鄭昌華NPC例，注藥前Bax—鄭昌華例注藥后Bax＋50%張沂擇例注藥后Bax＋25-50％張沂擇舌癌例注藥前Bax－丁先進(jìn)NPC，注藥前Bax－丁先進(jìn)注藥后Bax＋25～50％34丁先進(jìn)NPC例注藥前VEGF＋75％丁先進(jìn)例注藥后VEGF－馬冰清平滑肌肉瘤例注藥前VEGF＋75%馬冰清例注藥后VEGF－張子苑例注藥后VEGF＋25-50%張子苑NPC例注藥前VEGF＋>75%丁先進(jìn)NPC例注藥前VEGF＋75％丁先進(jìn)例注藥后VEGF－35胃體癌，低分化腺癌（上圖，療前）VEGF－P53灌注熱化療后手術(shù)，胃角殘存腫瘤，鏡下僅見間質(zhì)內(nèi)散在稀少變性癌細(xì)胞VEGF＋胃體癌，低分化腺癌（上圖，療前）VEGF－P53灌注熱化療后36今又生特有p53序列331bp今又生特有p53序列331bp37馬冰清，平滑肌肉瘤，IHC法示：用藥前>+75%,用藥后>+75%PCR法示：用藥前＋，用藥后＋＋注藥前僅38％吻合（如上圖），注藥后與p53專有序列比較100％吻合（如下圖）馬冰清，平滑肌肉瘤，IHC法示：用藥前>+75%,用藥后>+38馬冰清注藥前與p53專有序列圖比較僅38％吻合馬冰清注藥后與p53專有序列圖比較達(dá)100％吻合馬冰清注藥前馬冰清注藥后與p53專有序列圖比較達(dá)100％吻合39例2：(龔兆洪NPC,IHC示－)注今又生前樣品p53與今又生專有p53序列僅有38％吻合0720290_G1_P53F_B06_0721708:DNAMAN2identity=38%5

GTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAAC

41GTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGG65TACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATC101ACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTCTTC125ACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGT

161CAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTTACA185GCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCT221CATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGGCAC245CACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAA

281CACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACAC例2：(龔兆洪NPC,IHC示－)注今又生前樣品p53與40例1：注藥后樣品p53與今又生專有p53序列100％吻合（IHC示＋）0720299_G2~3_P53R_D09_0724712:DNAMAN1identity=100%1CTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCC38CTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCC61AGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTC

98AGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTC121TTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTT

158TTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTT181ACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGG218ACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGG241CACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAA

278CACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAA例1：注藥后樣品p53與今又生專有p53序列100％吻合（I41P53表達(dá)IHC法12/25(48%)

RT-PCR+測序法16/17(94.1%)P21表達(dá)IHC法11/25(44%)Bax表達(dá)IHC法9/24(37.5%)VEGF表達(dá)IHC11/24(45.7%)瘤內(nèi)注射Adp53后P53及其靶基因表達(dá)情況P53表達(dá)IHC法12/25(48%)42重組人P53腺病毒制劑臨床試驗1998年2000年1月完成臨床I期試驗2001年10月～2003年5月完成II/III期臨床試驗北京腫瘤醫(yī)院為牽頭單位重組人P53腺病毒制劑臨床試驗1998年2000年1月完成臨43李利華，鼻咽癌，右頸轉(zhuǎn)移,T2N2M0右上頸轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)6.1cm2纖維鼻咽鏡可見右鼻咽頂3cm腫物療前CT示右鼻咽頂腫物5.5cm2病理：低分化鱗癌方法1李利華，鼻咽癌，右上頸轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)6.1cm2纖維鼻咽鏡可見右44右上頸腫物B超探查右上頸腫物注射部位大小6.1cm2右上頸腫物，6.8cm2，注射今又生右上頸腫物B超探查右上頸腫物注射部位右上頸腫物，6.8cm45B超引導(dǎo)下，右上頸腫物穿刺注射今又生可見針尖位置在瘤內(nèi)注藥后即刻在瘤內(nèi)形成一片強(qiáng)回聲區(qū)B超引導(dǎo)下，右上頸腫物穿刺注射今又生可見針尖位置在瘤內(nèi)注藥后46方法2左：左側(cè)鼻咽頂腫瘤右：直接瘤內(nèi)注射今又生光纖鼻咽內(nèi)鏡引導(dǎo)下瘤內(nèi)注射今又生左下圖：60Gy，8次注今又生，鼻內(nèi)鏡見左鼻咽頂腫瘤消失方法2左：左側(cè)鼻咽頂腫瘤右：直接瘤內(nèi)注射今47各種給藥途徑各種給藥途徑48瘤內(nèi)注射的意義1.避免免疫攻擊2.腺病毒感染快而廣3.高感染率致高療效瘤內(nèi)注射的意義1.避免免疫攻擊49分組方案多中心隨機(jī)對照II/III期臨床試驗基因－放療組（GTRT）單純放療組（RT）分組方案多中心隨機(jī)對照II/III期臨床試驗50方案

基因－放療組（GTRT）每周5瘤內(nèi)注射今又生1012VP/次，第三天放療，病灶區(qū)采用與RT組相同照射,予70Gy/35f/7～8w,第五周(40Gy)，第八周(70Gy)，療后2個月為療效確認(rèn)，以CT測量腫瘤體積，計算40Gy、70Gy、和確認(rèn)時腫瘤縮小率（％）.按WHO實體腫瘤客觀療效評定標(biāo)準(zhǔn)，療效評定為CR、PR、SD、PD。

方案基因－放療組（GTRT）每周5瘤內(nèi)注射今又生1012V51實驗室特殊檢查腫瘤組織p53蛋白檢測（IHC法和測序法）病毒抗體檢測（ELASA法）實驗室特殊檢查腫瘤組織p53蛋白檢測（IHC法和測序法）52臨床常規(guī)檢驗每周血、尿、便每月血生化（BUN,Cr,AST,ALT)每月心電圖、胸片臨床常規(guī)檢驗每周血、尿、便53毒性反應(yīng)按WHO常見毒性分級標(biāo)準(zhǔn)評價毒付反應(yīng)，按輕⑴、中⑵、重⑶、威脅生命⑷評價和記錄。重點觀察體溫變化。一般在注射今又生后幾小時內(nèi)出現(xiàn)短暫的自限性發(fā)熱（self-limitedfever），38C以上發(fā)燒者可酌情給予退燒藥（消炎痛栓或柴胡注射液）。毒性反應(yīng)按WHO常見毒性分級標(biāo)準(zhǔn)評價毒付反應(yīng)，按輕⑴、中⑵、54統(tǒng)計學(xué)分析全部數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，瘤灶縮小率比較采用t檢驗（兩組方差不齊時，用t’檢驗），療效比較采用Pearson卡方檢驗，不良反應(yīng)測定值與基線比較采用Dunnett-t檢驗。統(tǒng)計學(xué)分析全部數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件55GTRTgroup(n=26)RTgroup(n=27)Gender(n)MaleFemaleAge(y)MedianRangeHistologictypeKeratinizingUndifferentiatedUICCstage(n)IIIIIIIV(M0)17948.512.419~7042208(30.8)8(30.8)10(38.4)19851.611.328~7132409(33.3)10(37.1)8(29.6)Table1.ComparisonofpatientcharacteristicsbetweenGTRTandRTgroups*Datapresentedasthenumberofpatients,withthepercentagesofthetotalinparentheses.GTRTgroup(n=26)RTgroup(n56表2鼻咽癌GTRT組26例和RT組27例瘤灶大?。╩m2）比較組別瘤灶數(shù)腫瘤大小GTRT組26

676.15437.84mm2RT組44

645.91448.97mm2GTRT組瘤灶大于RT組，但成組t檢驗：Z=-0.271,p=0.787,兩組瘤灶大小差別無統(tǒng)計學(xué)意義，說明兩組療效具有可比性。表2鼻咽癌GTRT組26例和RT組27例瘤灶大小（mm57GTRT組與GT組具可比性性別構(gòu)成、年齡、病理、腫瘤大小、臨床分期均無顯著差別GTRT組與GT組具可比性性別構(gòu)成、年齡、病理、腫瘤大小、臨58鼻咽癌T2N2M0,III,療前腫瘤23.5cm2充滿鼻咽和鼻腔照射40Gy結(jié)合6次注射今又生后腫瘤完全消失鼻咽癌T2N2M0,III,照射40Gy結(jié)合6次注59Left

upperfig：NPCstageIV

pretreatmetNasopharyngealtumorNaso-endoscopephotoUpperfig:pretreatInferiorfig:at44Gyand5timesinjectiontumordisappeared.CTimagingat70GYandGendicine8times，nasopharynxtructurenormalLeftupperfig：NPCstageIV60Table3.Tumorshrinkagerates(%)ofGendicine-injectedtumorsofGTRTgroupascomparedwithRTgroup40Gy70GyValidationGTRT64.5017.78#84.3516.97#90.2721.15#RT41.5324.59#

56.6028.01#

72.5023.17#

RER*1.551.491.25#Tumorshrinkagerate(%)(XS)Radio-enhancementratio(RER)＝tumorshrinkagerateofGendicine-injectedtumorofGTRTgroup/tumorshrinkagerateoftumorofRTgroupP<0.01foreachtreatmentpointat40Gy,70Gyandvalidation.Table3.Tumorshrinkagerates61Table4.Responserate(%)ofGTRTgroupascomparedwithRTgroupgroup40Gy70GyValidationaFNCRPRSDPDFNCRPRSDPDFNCRPRSDPDGTRT26

2186026916102616910RT44

019250473251902881460aFN:tumorfocusnumber.P<0.001foreachtreatmentpointat40Gy,70Gyandvalidation.AtvalidationtheCRratewere16/26(61.5%)

forGTRT-tumorsand8/28(28.6%)

forRT-tumors,respectively.*Atvalidationtimepoint,theCRrateofGTRTgroupwas2.15timestothatofRTgroup(61.5%/28.6%)Table4.Responserate(%)of62今又生的壞死效應(yīng)注射Adp53部位腫瘤B超顯示腫瘤血供迅速減少甚至消失，CT顯示腫瘤內(nèi)CT值明顯下降，壞死明顯。有3例在40Gy時穿刺病理證實未見癌細(xì)胞（1-10侯鳳才、1－14李文花、1－16邱禮斌）今又生的壞死效應(yīng)注射Adp53部位腫瘤B超顯示腫瘤血供迅速減63候鳳才，鼻咽癌，左上頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移左外上后為注P53，5.7cm2，注射后彌散好；左內(nèi)前下為對照，5.7cm240Gy,前LN，對照，2.9cm2,縮40％后LN1cm2，注P53,縮小72％，空洞壞死，針吸未見癌細(xì)胞第六次注射p53，LN，50Gy，活檢病理：大部分壞死，殘存少許纖維組織及橫紋肌。候鳳才，鼻咽癌，左上頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移左外上后為注P53，5.7c64AdverseEvents骨髓、肝、腎、肺、心功能今又生注射前后都保持在正常范圍107病例theincidenceoffeverwas78.5%,

grade1(lessthan38C)fever43%

grade2(range38C~40C)35.5%.大多數(shù)發(fā)生自限性發(fā)燒（self-limitedfever)AdverseEvents骨髓、肝、腎、肺、心功能今又生65p53基因治療的基礎(chǔ)與臨床研究北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院張珊文2007年11月p53基因治療的基礎(chǔ)與臨床研究北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院66

P53基因結(jié)構(gòu)：p53基因定位于人染色體17p13.1區(qū)位，全長16～20kb,有11個外顯子和10個內(nèi)含子，分子量為53KD的磷酸核蛋白，含393個氨基酸。功能：具轉(zhuǎn)錄因子的功能。野生型p53具細(xì)胞周期檢查點功能，使受損細(xì)胞阻滯于G1期（或G2期）并引導(dǎo)細(xì)胞凋亡。突變型p53即喪失該功能，起癌基因作用。P53基因結(jié)構(gòu)：p53基因定位于人染色體17p13.1區(qū)位67p53基因染色體定位p53基因染色體定位68p53基因結(jié)構(gòu)p53基因結(jié)構(gòu)69功能：基因組保護(hù)神功能：基因組保護(hù)神70第一部分研究

p53對人胃癌細(xì)胞放射敏感性和熱敏感性的作用第一部分研究p53對人胃癌細(xì)胞放射敏感性和熱敏感71

國家自然科學(xué)基因課題（95規(guī)劃）4種不同p53狀況胃癌細(xì)胞4Gy劑量照射后，僅wtp53細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的G1期阻滯(分別占原細(xì)胞總數(shù)的67.9％和61.1％)，和細(xì)胞凋亡(比例分別達(dá)13.0%和15.3%)。而其他3種p53異常的細(xì)胞都沒有出現(xiàn)明顯的G1期阻滯和凋亡效應(yīng)。國家自然科學(xué)基因課題（95規(guī)劃）724種胃癌細(xì)胞4Gy照射后w細(xì)胞、M細(xì)胞、neo細(xì)胞和823細(xì)胞生存率分別為0.1080.006、0.1550.004、0.1470.007和0.1400.013,W細(xì)胞生存率顯著地低于后三種細(xì)胞（p<0.05）4種胃癌細(xì)胞腫瘤10Gy照射后體積抑制曲線：w細(xì)胞腫瘤放射反應(yīng)曲線明顯受到抑制4種胃癌細(xì)胞4Gy照射后w細(xì)胞、M細(xì)胞、neo細(xì)胞和823細(xì)73p53對人胃癌細(xì)胞熱敏感性的作用4種不同p53狀況胃癌細(xì)胞在42°C2h或43°C30min后8h，僅W細(xì)胞S期比例明顯增加（P<0.05）分別占53.5％或50.0％，凋亡比率分別達(dá)10.5%和12.3%。而其他3種細(xì)胞的S期比例無明顯增高，凋亡比例都為0(p<0.05)。p53對人胃癌細(xì)胞熱敏感性的作用4種不同p53狀況胃癌細(xì)胞在744種細(xì)胞種植腫瘤兩次43°C20min加熱后，w細(xì)胞腫瘤抑制曲線增長緩慢，到20天時僅增大了1倍，而其他3種細(xì)胞腫瘤增長迅速，到20天時增大了2.73.6倍,生長速度顯著地高于W細(xì)胞（P<0.05）。4種細(xì)胞種植腫瘤兩次43°C20min加熱后，w細(xì)胞腫瘤75第二部分研究重組人p53腺病毒對人胃癌細(xì)胞放射敏感性和熱敏感性作用第二部分研究重組人p53腺病毒對人胃癌細(xì)胞放射敏感性和熱敏感76作用機(jī)制Bax凋亡壞死作用機(jī)制Bax凋亡壞死77重組腺病毒顆粒激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞提高抗腫瘤體液免疫和細(xì)胞免疫力免疫系統(tǒng)作用機(jī)制重組腺病毒顆粒激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞提高抗腫瘤體78轉(zhuǎn)染率與病毒劑量病毒量為50MOI時，四種胃癌細(xì)胞感染率40%左右；100MOI時，感染率達(dá)80～90%（multiplicityofinfection,MOI,效靶比）。轉(zhuǎn)染率與病毒劑量病毒量為50MOI時，四種胃癌細(xì)胞感染79Adp53表達(dá)定位1:100MOI效靶比Adp53產(chǎn)生細(xì)胞高轉(zhuǎn)染率（100％）和p53基因在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，產(chǎn)生G2/M期阻滯和凋亡增加和細(xì)胞增殖抑制Adp53表達(dá)定位1:100MOI效靶比Adp53產(chǎn)生細(xì)胞高80圖1100MOIAdp53感染4種胃癌細(xì)胞48小時后p53蛋白的免疫組化染色。Adp53感染細(xì)胞核著棕色。顯示p53表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)并達(dá)到100％轉(zhuǎn)染。1.Marker2.W+Adp533.Wcontrol4.M+Adp535.Mcontrol6.neo+Adp537.neocontrol8.823+Adp539.823control圖2：Westernblot印記法顯示4種胃癌細(xì)胞100MOIAdp53感染后48小時，在53KD位置上均有一條清晰的雜交帶，表明p53蛋白高表達(dá)。

Wt

MutNeoBGC-823圖1100MOIAdp53感染4種胃癌細(xì)胞48小時后p581圖3.4種胃癌細(xì)胞100MOIAdp53感染后48小時TUNEL法染色顯示高比率凋亡細(xì)胞被染成棕色。圖3.4種胃癌細(xì)胞100MOIAdp53感染后48小時T82表1Adp53結(jié)合4Gy照射胃癌細(xì)胞存活率

存活分?jǐn)?shù)

細(xì)胞系A(chǔ)d-p53組4Gy組p53+4Gy組

Wtp530.626±0.0190.117±0.0130.094±0.001

Mutp530.369±0.0240.169±0.0020.076±0.009Neo0.518±0.0160.152±0.004

0.110±0.005

8230.526±0.0230.150±0.005

0.108±0.025

注:采用HotellingT2檢驗表明Ad-p53+4Gy組存活分?jǐn)?shù)顯著低于4Gy組（P<0.001）Adp53結(jié)合放射實驗表1Adp53結(jié)合4Gy照射胃癌細(xì)胞存活率83

表2Adp53結(jié)合4Gy照射對4種胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響（FCM法）細(xì)胞系條件G1SG2/MSub-G1凋亡率比值Wtp53對照組48.25.029.64.022.24.04.91.1Adp5343.612.031.810.524.616.510.61.64Gy61.013.97.513.42.0

Adp53＋4Gy41.512.021.76.5

36.815.5

39.95.0

3.0#Mutp53對照組48.512.039.55.512.010.05.52.0Adp5340.32.038.716.021.010.017.93.24Gy40.514.044.516.014.03.012.74.0

Adp53＋4Gy34.84.034.316.5

30.811.0

45.510.0

3.6Neo對照組44.05.033.36.522.75.07.02.5Adp5339.25.534.76.526.17.518.02.94Gy43.09.030.27.526.86.511.45.0

Adp53＋4Gy29.78.036.27.5

34.19.5

25.12.5

2.2823對照組52.03.034.85.513.24.05.13.0Adp5342.54.039.82.021.66.015.84.84Gy53.612.529.510.516.92.011.83.0

Adp53＋4Gy9.0

27.97.0

29.86.3

2.5表2Adp53結(jié)合4Gy照射對4種胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期84表3Adp53結(jié)合4Gy照射4種胃癌細(xì)胞的凋亡率(TUNEL法)

凋亡率（%）

細(xì)胞系對照組Ad-534Gyp53+4Gy凋亡率比值

Wt-p531.018.00.512.02.0

40.02.53.3*Mut-p530.028.02.03.01.0

48.03.5

16.0Neo0.026.03.05.50.5

36.00.56.5BGC8230.025.04.05.01.0

35.01.57.0

*凋亡率比值＝Adp53＋4Gy的凋亡率/單純4Gy的凋亡率表3Adp53結(jié)合4Gy照射4種胃癌細(xì)胞的凋85W細(xì)胞腫瘤Adp53對6Gy照射的抑瘤率比值為1.41,而對M細(xì)胞腫瘤為1.91。

圖5.2示Adp53結(jié)合6Gy照射對M細(xì)胞腫瘤的抑制作用

圖5.1示Adp53結(jié)合6Gy照射對W細(xì)胞腫瘤的抑制作用相對體積W細(xì)胞腫瘤Adp53對6Gy照射的抑瘤率比值為1.41,而對86相對體積

表1Adp53結(jié)合加溫對W細(xì)胞周期和凋亡的作用（FCM）條件G1SG2/MSub-G1熱增效比對照7.322.0Adp5338.52.426.82.734.71.08.50.742C2h36.85.037.83.925.36.06.54.843C0.5h42.07.134.04.724.04.314.212.2Adp53+42C2h

6.7

34.02.9

21.49.8

3.3Adp53+43C0.5h7.6

23.87.1

22.512.2

1.6

表2Adp53結(jié)合加溫對M細(xì)胞周期和凋亡的作用（FCM）

條件G1SG2/MSub-G1熱增效比對照45.81.534.80.520.0Adp5341.32.442C2h41.35.036.512.222.043C0.5h43.83.938.54.712.2Adp53+42C2h42.510.832.03.3

25.3

2.1Adp53+43C0.5h41.52.536.39.9

22.512.513.30.5

1.8相對體積表1Adp53結(jié)合加溫對W細(xì)87

時間（天）圖6.1Adp53結(jié)合43C0.5hW細(xì)胞腫瘤抑制曲線

時間（天）圖6.2Adp53結(jié)合43C0.5hW細(xì)胞腫瘤抑制曲線相對體積

W細(xì)胞種植腫瘤相對生長曲線(見圖6.1)：單純43C0.5h加溫、單純Adp53和Adp53結(jié)合43C0.5h，腫瘤抑制率分別為15.8%、21.8%和27.2%,Adp53的熱增效比為1.7。M細(xì)胞種植腫瘤相對生長曲線（見圖6.2）：單純加溫、單純Adp53和Adp53結(jié)合加溫，腫瘤抑制率分別為24.2%、31.0%和37.8%，Adp53的熱增效比為1.6。時88臨床研究GeneTherapydream臨床研究GeneTherapydream89p53基因－放療

野生型p53促進(jìn)放射線引發(fā)的細(xì)胞周期阻滯和凋亡。而變異p53減弱甚至取消這種效應(yīng)腺病毒介導(dǎo)p53恢復(fù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)p53的功能，提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性。p53基因－放療野生型p53促進(jìn)放射線引發(fā)的細(xì)胞周期阻滯90試驗材料重組人p53腺病毒注射液（今又生）今又生結(jié)構(gòu)：E1基因缺失的攜帶人野生型p53基因的5型腺病毒試驗材料重組人p53腺病毒注射液（今又生）91基礎(chǔ)與臨床-課件92Adp53structure

GendicineisanE1substitutedreplication-incompetentrecombinantadenovirusencodingthehumanp53gene.E1A/E1Bdeletionp53StructuralproteinsE4E2E3Adp53structureGendicineisa93病毒表面的蛋白質(zhì)與細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)通過“配子與配體”結(jié)合的方式，整個病毒顆粒被細(xì)胞吞噬入細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞漿內(nèi)，病毒外殼與內(nèi)核的DNA分離，其中外殼蛋白質(zhì)被降解；DNA進(jìn)入細(xì)胞核。在核內(nèi)，DNA轉(zhuǎn)錄出RNA（mRNA),mRNA從胞核出來進(jìn)入細(xì)胞漿；在胞漿翻譯出p53蛋白質(zhì)，p53蛋白質(zhì)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)再進(jìn)入到細(xì)胞核與核內(nèi)的DNA結(jié)合，以調(diào)節(jié)DNA（基因）表達(dá)。病毒表面的蛋白質(zhì)與細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)通過“配子與配體”結(jié)合的方94P53基因治療的臨床機(jī)理瘤內(nèi)注射今又生p53基因及其靶基因的表達(dá)治療P53基因上調(diào)P21基因及Bax基因下調(diào)VEGF基因方法：IHC和RT－PCR及測序P53基因治療的臨床機(jī)理瘤內(nèi)注射今又生p53基因及其靶基因的95免疫組化法評價今又生瘤內(nèi)注射后p53基因表達(dá).張子苑NPC例，注藥前p53－Adp53注射后p53+75%免疫組化法評價今又生瘤內(nèi)注射后p53基因表達(dá).張子苑NPC例96劉凱惡性神經(jīng)鞘瘤例注藥前P53<+25%,PCR+何華樹注藥后P53＋25％何華樹骨肉瘤例，注藥前P53－,PCR±劉凱注藥后P53>+75%,PCR++P53基因表達(dá)劉凱惡性神經(jīng)鞘瘤例注藥前P53<+25%,PCR+何華樹97張沂擇舌癌例，注藥前P21－張沂擇注藥后P21＋50％丁先進(jìn)NPC例，注藥前P21—丁先進(jìn)注藥后P21＋25％P21基因表達(dá)張沂擇舌癌例，注藥前P21－張沂擇注藥后P21＋50％丁先進(jìn)98丁先進(jìn)NPC，注藥前Bax－丁先進(jìn)注藥后Bax＋25～50％鄭昌華NPC例，注藥前Bax—鄭昌華例注藥后Bax＋50%張沂擇例注藥后Bax＋25-50％張沂擇舌癌例注藥前Bax－丁先進(jìn)NPC，注藥前Bax－丁先進(jìn)注藥后Bax＋25～50％99丁先進(jìn)NPC例注藥前VEGF＋75％丁先進(jìn)例注藥后VEGF－馬冰清平滑肌肉瘤例注藥前VEGF＋75%馬冰清例注藥后VEGF－張子苑例注藥后VEGF＋25-50%張子苑NPC例注藥前VEGF＋>75%丁先進(jìn)NPC例注藥前VEGF＋75％丁先進(jìn)例注藥后VEGF－100胃體癌，低分化腺癌（上圖，療前）VEGF－P53灌注熱化療后手術(shù)，胃角殘存腫瘤，鏡下僅見間質(zhì)內(nèi)散在稀少變性癌細(xì)胞VEGF＋胃體癌，低分化腺癌（上圖，療前）VEGF－P53灌注熱化療后101今又生特有p53序列331bp今又生特有p53序列331bp102馬冰清，平滑肌肉瘤，IHC法示：用藥前>+75%,用藥后>+75%PCR法示：用藥前＋，用藥后＋＋注藥前僅38％吻合（如上圖），注藥后與p53專有序列比較100％吻合（如下圖）馬冰清，平滑肌肉瘤，IHC法示：用藥前>+75%,用藥后>+103馬冰清注藥前與p53專有序列圖比較僅38％吻合馬冰清注藥后與p53專有序列圖比較達(dá)100％吻合馬冰清注藥前馬冰清注藥后與p53專有序列圖比較達(dá)100％吻合104例2：(龔兆洪NPC,IHC示－)注今又生前樣品p53與今又生專有p53序列僅有38％吻合0720290_G1_P53F_B06_0721708:DNAMAN2identity=38%5

GTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAAC

41GTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGG65TACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATC101ACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTCTTC125ACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGT

161CAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTTACA185GCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCT221CATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGGCAC245CACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAA

281CACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACAC例2：(龔兆洪NPC,IHC示－)注今又生前樣品p53與105例1：注藥后樣品p53與今又生專有p53序列100％吻合（IHC示＋）0720299_G2~3_P53R_D09_0724712:DNAMAN1identity=100%1CTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCC38CTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCC61AGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTC

98AGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTC121TTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTT

158TTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTT181ACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGG218ACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGG241CACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAA

278CACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAA例1：注藥后樣品p53與今又生專有p53序列100％吻合（I106P53表達(dá)IHC法12/25(48%)

RT-PCR+測序法16/17(94.1%)P21表達(dá)IHC法11/25(44%)Bax表達(dá)IHC法9/24(37.5%)VEGF表達(dá)IHC11/24(45.7%)瘤內(nèi)注射Adp53后P53及其靶基因表達(dá)情況P53表達(dá)IHC法12/25(48%)107重組人P53腺病毒制劑臨床試驗1998年2000年1月完成臨床I期試驗2001年10月～2003年5月完成II/III期臨床試驗北京腫瘤醫(yī)院為牽頭單位重組人P53腺病毒制劑臨床試驗1998年2000年1月完成臨108李利華，鼻咽癌，右頸轉(zhuǎn)移,T2N2M0右上頸轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)6.1cm2纖維鼻咽鏡可見右鼻咽頂3cm腫物療前CT示右鼻咽頂腫物5.5cm2病理：低分化鱗癌方法1李利華，鼻咽癌，右上頸轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)6.1cm2纖維鼻咽鏡可見右109右上頸腫物B超探查右上頸腫物注射部位大小6.1cm2右上頸腫物，6.8cm2，注射今又生右上頸腫物B超探查右上頸腫物注射部位右上頸腫物，6.8cm110B超引導(dǎo)下，右上頸腫物穿刺注射今又生可見針尖位置在瘤內(nèi)注藥后即刻在瘤內(nèi)形成一片強(qiáng)回聲區(qū)B超引導(dǎo)下，右上頸腫物穿刺注射今又生可見針尖位置在瘤內(nèi)注藥后111方法2左：左側(cè)鼻咽頂腫瘤右：直接瘤內(nèi)注射今又生光纖鼻咽內(nèi)鏡引導(dǎo)下瘤內(nèi)注射今又生左下圖：60Gy，8次注今又生，鼻內(nèi)鏡見左鼻咽頂腫瘤消失方法2左：左側(cè)鼻咽頂腫瘤右：直接瘤內(nèi)注射今112各種給藥途徑各種給藥途徑113瘤內(nèi)注射的意義1.避免免疫攻擊2.腺病毒感染快而廣3.高感染率致高療效瘤內(nèi)注射的意義1.避免免疫攻擊114分組方案多中心隨機(jī)對照II/III期臨床試驗基因－放療組（GTRT）單純放療組（RT）分組方案多中心隨機(jī)對照II/III期臨床試驗115方案

基因－放療組（GTRT）每周5瘤內(nèi)注射今又生1012VP/次，第三天放療，病灶區(qū)采用與RT組相同照射,予70Gy/35f/7～8w,第五周(40Gy)，第八周(70Gy)，療后2個月為療效確認(rèn)，以CT測量腫瘤體積，計算40Gy、70Gy、和確認(rèn)時腫瘤縮小率（％）.按WHO實體腫瘤客觀療效評定標(biāo)準(zhǔn)，療效評定為CR、PR、SD、PD。

方案基因－放療組（GTRT）每周5瘤內(nèi)注射今又生1012V116實驗室特殊檢查腫瘤組織p53蛋白檢測（IHC法和測序法）病毒抗體檢測（ELASA法）實驗室特殊檢查腫瘤組織p53蛋白檢測（IHC法和測序法）117臨床常規(guī)檢驗每周血、尿、便每月血生化（BUN,Cr,AST,ALT)每月心電圖、胸片臨床常規(guī)檢驗每周血、尿、便118毒性反應(yīng)按WHO常見毒性分級標(biāo)準(zhǔn)評價毒付反應(yīng)，按輕⑴、中⑵、重⑶、威脅生命⑷評價和記錄。重點觀察體溫變化。一般在注射今又生后幾小時內(nèi)出現(xiàn)短暫的自限性發(fā)熱（self-limitedfever），38C以上發(fā)燒者可酌情給予退燒藥（消炎痛栓或柴胡注射液）。毒性反應(yīng)按WHO常見毒性分級標(biāo)準(zhǔn)評價毒付反應(yīng)，按輕⑴、中⑵、119統(tǒng)計學(xué)分析全部數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，瘤灶縮小率比較采用t檢驗（兩組方差不齊時，用t’檢驗），療效比較采用Pearson卡方檢驗，不良反應(yīng)測定值與基線比較采用Dunnett-t檢驗。統(tǒng)計學(xué)分析全部數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件120