大規(guī)模細胞培養(yǎng)及發(fā)酵技術

關于大規(guī)模細胞培養(yǎng)及發(fā)酵技術第一頁，共四十二頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)的概述動物細胞的特點：無細胞壁倍增時間長，生長緩慢需氧量少，對攪拌敏感聚集體形成原代細胞培養(yǎng)50代即開始退化第二頁，共四十二頁，2022年，8月28日動物細胞培養(yǎng)的概述動物細胞培養(yǎng)的定義：動物細胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出細胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細胞或者組織生存、生長并維持結構和功能的一門技術第三頁，共四十二頁，2022年，8月28日動物細胞培養(yǎng)的概述生長特性貼壁生長型：如人胚肺細胞，Hela細胞，巨噬細胞，神經(jīng)細胞懸浮生長型：如血液白細胞、淋巴細胞等第四頁，共四十二頁，2022年，8月28日體外培養(yǎng)細胞的基本技術體外培養(yǎng)特點體外培養(yǎng)工具體外培養(yǎng)條件體外細胞生長增殖過程培養(yǎng)方法大規(guī)模培養(yǎng)技術第五頁，共四十二頁，2022年，8月28日體外培養(yǎng)的特點營養(yǎng)條件苛刻適應性差，敏感培養(yǎng)時間長，易污染第六頁，共四十二頁，2022年，8月28日體外培養(yǎng)的條件溫度，37℃氣體：氧，二氧化碳，氮氣營養(yǎng)條件：需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可由血清提供第七頁，共四十二頁，2022年，8月28日細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術

第八頁，共四十二頁，2022年，8月28日細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法反應器貼壁培養(yǎng)容易換液，不需特殊的分離細胞和培養(yǎng)液的設備，可采用灌流培養(yǎng)獲得高密度，但擴大規(guī)模較難，適合制備量小，價值高的生物藥品。（CelliGenPlusTM）微載體培養(yǎng)最有前途的動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術，兼有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，易于放大。（Cytodex，Cytopore和Cytoline）無血清懸浮培養(yǎng)用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養(yǎng)技術第九頁，共四十二頁，2022年，8月28日動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中重要參數(shù)pH溶氧溫度谷氨酸/谷氨酰胺葡萄糖乳酸CO2第十頁，共四十二頁，2022年，8月28日動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中重要參數(shù)NH4+K+/Na+Ca++滲透壓細胞密度第十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)存在的問題細胞凋亡細胞在高密度條件下，由于細胞的多層生長，存在細胞接觸抑制效應，細胞的生長和表達均受到嚴重影響第十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)存在的問題細胞凋亡主要是細胞生長的條件較惡劣，包括：1.營養(yǎng)缺乏2.有害代謝產(chǎn)物的積累3.pH和溶氧控制不當4.機械攪拌剪切力較大5.滲透壓第十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日細胞大規(guī)模培養(yǎng)的應用生產(chǎn)疫苗蛋白質和多肽藥物基因治療單抗第十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日微生物培養(yǎng)技術概述傳統(tǒng)：釀酒、抗生素、制醋基因工程：生產(chǎn)蛋白質藥物、疫苗等（大腸桿菌、酵母）一般采用高密度發(fā)酵技術第十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日微生物培養(yǎng)培養(yǎng)過程決定于：菌種培養(yǎng)條件第十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日

微生物培養(yǎng)過程重要參數(shù)：溫度pH溶氧葡萄糖/甘油乙酸第十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日

乳酸NH4+磷酸鹽乙醇(酵母)甲醇(酵母)細胞密度第十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日微生物高密度培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基表達基因的調控宿主菌質粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性第十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日

高密度培養(yǎng)的關鍵是發(fā)酵的補料控制,根據(jù)重組菌的生長特點及產(chǎn)物的表達方式采取合理的營養(yǎng)物質的流加方式恒速流加變速流加指數(shù)流加第二十頁，共四十二頁，2022年，8月28日

微生物高密度培養(yǎng)乙酸的形成:培養(yǎng)液中葡萄糖的含量超過菌體生長所需量或在缺氧的情況下,便會大量產(chǎn)生乙酸.減少乙酸的策略:限制性流加葡萄糖甘油代替葡萄糖降低培養(yǎng)溫度第二十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日

宿主菌降低比生長速率透析培養(yǎng)第二十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵中的重要參數(shù)了解生物技術的應用GlucoseGlutamineAmmoniaLactate第二十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日pH不同的細胞具有不同最佳pH范圍pH能影響葡萄糖和谷氨酰胺的代謝，在低pH條件下，葡萄糖消耗速度慢

pH能影響細胞的生長和目標產(chǎn)物的量

第二十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日CO2在細胞培養(yǎng)過程中，CO2

與碳酸氫鹽形成緩沖對，穩(wěn)定培養(yǎng)液中的pHCO2也可用于計算呼吸商，反應細胞活力和代謝旺盛程度細胞代謝（呼吸作用）會產(chǎn)生CO2(廢物)CO2

水平增加會抑制細胞生長和細胞活性，從而影響目標蛋白的表達，當溶液中CO2達到14-15%時，會嚴重抑制細胞的生長CO2+H2O<<>>H2CO3<<>>H++HCO3-第二十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日DO(溶氧）葡萄糖等需氧來氧化產(chǎn)生ATP供細胞的能量用于測量和跟蹤細胞消耗氧的速率.

第二十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日溶氧在細胞培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，O2通常是限制營養(yǎng)成分，是因為它在溶液中低溶解度:通常關心對培養(yǎng)液中%O2,也就是“溶氧”值(DO):理論DO:80%+/-5%(哺乳動物細胞培養(yǎng))>90%DO2(細菌培養(yǎng)）O2也可能通過自由基形成對細胞造成傷害,在低pO2

水平，細胞的活性通常越高

(O2值必須維持在最低的水平)然而,原代細胞可能在低O2

條件下繁殖受延遲

因而，維持正確的O2的平衡，對保證所有細胞正確生長都非常重要,一般30-50%第二十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日葡萄糖葡萄糖兩個主要的功能:細胞的主要的能量物質主要的細胞碳源

葡萄糖和谷氨酰胺是相互補充的:產(chǎn)生其他代謝物(例如:天冬氨酸)提供能量在所有細胞中通過糖酵解途徑轉變成丙酮.

葡萄糖的代謝隨細胞生長而增加.葡萄糖通常是細胞生長的限制因素第二十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日葡萄糖監(jiān)控細胞反應器和發(fā)酵罐中的葡萄糖水平:保證細胞正常生長所需能量.開發(fā)延長細胞培養(yǎng)周期的標準補料策略.計算葡萄糖消耗速率和決定批次培養(yǎng)最佳的起始濃度.第二十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日乳酸=氧化問題在培養(yǎng)過程中，大多數(shù)乳酸來自于葡萄糖代謝，但也有一部分來自于谷氨酰胺代謝.基于高細胞密度和深液位，氧的消耗非常大.典型的范圍(組織培養(yǎng)):0-5g/LO2

消耗導致乳酸的形成，最終導致pH的下降.對恒定的pH:抑制細胞生長的乳酸水平在低到4mM到高達70mM(取決于細胞).在大多數(shù)情況下，銨對細胞生長的抑制比乳酸更嚴重.第三十頁，共四十二頁，2022年，8月28日乳酸監(jiān)控長時間細胞培養(yǎng)中乳酸的積累.計算乳酸產(chǎn)量與葡萄糖的消耗之間的代謝關系考察乳酸鹽對細胞表達產(chǎn)物的毒害影響第三十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日銨細胞培養(yǎng)和發(fā)酵中銨的來源:主要來源:代謝谷氨酰胺(谷氨酰胺降解)谷氨酰胺降解成銨和吡咯烷酮酸其他氨基酸的脫氨基作用

銨的水平也取決于細胞密度和細胞代謝方式.引起細胞抑制的銨離子濃度范圍:從: 0.5mM(LMouseCells)到: 40.0mM(M.AscitesTumorCells)

(不同的細胞株對銨有不同的耐受度)第三十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日銨pH會受NH3增加的影響:

NH4+<<>>NH3+H+

銨的增加也會改變細胞內(nèi)蛋白質的運動.監(jiān)控發(fā)酵罐和生物反應器中銨的水平（廢物）.

推算谷胺酰胺的降解水平.

考察銨濃度對細胞密度和產(chǎn)物濃度的影響.監(jiān)控引入培養(yǎng)基的質量.第三十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日限制銨抑制的策略增加換液的速率(補料).維持培養(yǎng)液中低的谷氨酰銨濃度減少其轉化和降解.在低的pH培養(yǎng)減少NH3形成.

去除培養(yǎng)液中的銨:酶轉化通過特殊的

“PTFE”

膜將NH3擴散到低pH溶液中使用能夠逐步接受高NH3

濃度的細胞第三十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日谷氨酰胺與葡萄糖一樣,谷氨酰胺也是細胞的主要物質:

*碳和氮 *能量谷氨酰胺通常被認為是細胞培養(yǎng)的主要限制營養(yǎng)谷氨酰胺是生物合成的前體物質:

*嘌呤 *嘌呤核苷谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬的主要氨基受體第三十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日谷氨酰胺監(jiān)控谷氨酰胺的水平:確保細胞生長所需的能量.

開發(fā)長時間細胞培養(yǎng)標準化補料策略.

計算谷氨酰胺的消耗速率和決定批次培養(yǎng)最佳的其始濃度.第三十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日谷氨酸需用來計算谷氨酰胺需確證谷氨酸的濃度，確保沒加進谷氨酰胺結果.谷氨酰胺的降解產(chǎn)物第三十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日Na/KNa-K:對合適培養(yǎng)基生產(chǎn)很重要.維持溶液/培養(yǎng)基合適的離子強度.第三十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日滲透壓滲透壓是溶液濃度的一個反應:測定滲透壓的參考方法是使用滲透壓計典型細胞培養(yǎng)液滲透壓值:

300+/-30mOsmol/kg.滲透壓升高50-100mOsmol/kg會明顯影響某些細胞的生長.某些溶液/化合物可作為滲透壓的保護劑(維持滲透壓穩(wěn)定和更低).這些物質:

甘氨酸，肌氨酸，脯氨酸第三十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日滲透壓用于對引進的培養(yǎng)基進行質量控制關聯(lián)滲透壓與細胞數(shù)、