質(zhì)譜分析技術(shù)課件

用于蛋白質(zhì)鑒定的兩種基本的質(zhì)譜分析技術(shù)1）MALDI-TOFMSMatrix-AssistedLaserDesorptionIonization/基質(zhì)輔助激光解吸附離子化Time-Of-Flightmassspectrometry飛行時(shí)間PMF:peptidemassfingerprinting肽質(zhì)量指紋譜MW:800-300,000用于蛋白質(zhì)鑒定的兩種基本的質(zhì)譜分析技術(shù)1）MALDI-TOF12）SELDI-TOFMSSurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization

表面增強(qiáng)激光解吸附離子化MW:2,000-50,0003）MS/MSTandemMS串連質(zhì)譜技術(shù)MW:200-3,0002）SELDI-TOFMS21）MALDI-TOFMS

（原理示意圖）SourceLength=sField-freedriftzoneLength=DEd=0MicrochannelplatedetectorExtractiongrid(sourcevoltage-Vs)UV(337nm)Detectorgrid-VsPulsevoltageAnalyte/matrix1）MALDI-TOFMS

（原理示意圖）SourceL3用MALDI-TOFMS和數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定細(xì)菌蛋白GroEL用MALDI-TOFMS和數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定細(xì)菌蛋白GroEL4PMF肽質(zhì)量指紋譜鑒定蛋白質(zhì)例子Myoglobin

GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASEDLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKHPGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQGPMF肽質(zhì)量指紋譜鑒定蛋白質(zhì)例子Myoglobin

GLS5Myoglobin用胰蛋白酶限制酶切后產(chǎn)生的肽段

（從堿性氨基酸的羧基端切斷）Myoglobin

GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASEDLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKHPGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQGMyoglobin用胰蛋白酶限制酶切后產(chǎn)生的肽段

（從堿性氨6質(zhì)譜分析技術(shù)課件7質(zhì)譜分析技術(shù)課件82）SELDI-TOFMS（原理示意圖）

EAM:能量吸收分子2）SELDI-TOFMSEAM:能量吸收分子9SELDI-TOFMS分析使用的各種蛋白質(zhì)芯片SELDI-TOFMS分析使用的各種蛋白質(zhì)芯片10質(zhì)譜分析技術(shù)課件11SELDI-TOFMA檢測(cè)結(jié)果與處理SELDI-TOFMA檢測(cè)結(jié)果與處理12實(shí)例：鼻咽癌病人血清標(biāo)志物檢測(cè)實(shí)例：鼻咽癌病人血清標(biāo)志物檢測(cè)13卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中分泌蛋白的SELDI-TOFMS檢測(cè)分析卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中分泌蛋白的SELDI-TOFMS檢測(cè)142）MS/MS

串連質(zhì)譜分析原理示意圖2）MS/MS

串連質(zhì)譜分析原理示意圖15限制酶切蛋白質(zhì)為肽段EnzymaticDigestandFractionation限制酶切蛋白質(zhì)為肽段EnzymaticDigest16第一步MS分離各個(gè)肽段

第二步MS對(duì)其中的一個(gè)肽段進(jìn)行氨基酸序列分析MS/MS第一步MS分離各個(gè)肽段

第二步MS對(duì)其中的一個(gè)肽段進(jìn)行氨基酸17碰撞誘導(dǎo)解離CID中多肽分子結(jié)構(gòu)中鍵斷裂的多種可能性-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-RiCH-R’biyn-iyn-i-1bi+1R”i+1i+1aixn-icizn-i碰撞誘導(dǎo)解離CID中多肽分子結(jié)構(gòu)中鍵斷裂的多種可能性-HN-18控制CID過(guò)程中的能量，使多肽主要從最弱的鍵肽鍵處斷裂產(chǎn)生N-端b系列和C-端y系列肽段-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-RiRi+1biyn-iyn-i-1bi+1控制CID過(guò)程中的能量，使多肽主要從最弱的鍵肽鍵處斷裂19串聯(lián)質(zhì)譜氨基酸序列分析例子

肽段SGFLEEDELK在理想條件下可生成的b、y系列離子S=serine87.08G=glycine57.05F=phenylalanine147.18L=leucine113.16E=glutamate129.12D=aspartate115.09K=lysine128.17串聯(lián)質(zhì)譜氨基酸序列分析例子

肽段SGFLEEDELK在理想條20先找出y系列離子K1166L1020E907D778E663E534L405F292G145S88bions10002505007501000m/z%Intensity147260389504633762875102210801166yionsy6y7y2y3y4y5y8y9先找出y系列離子K1166L1020E907D778E66321再找出b系列離子K1166L1020E907D778E663E534L405F292G145S88bions10002505007501000m/z%Intensity147260389504633762875102210801166yionsy6y7y2y3y4y5y8y9b3b5b6b7b8b9b4再找出b系列離子K1166L1020E907D778E66322新序列推測(cè)10002505007501000m/z%IntensityEL新序列推測(cè)10002505007501000m/z%Int23新序列推測(cè)210002505007501000m/z%IntensityELFKLSGFGEDELEEDEL新序列推測(cè)210002505007501000m/z%In24新序列推測(cè)原則

軟件輔助分析找出最佳路徑一個(gè)峰不能使用兩次，連續(xù)前進(jìn)或者退后。簡(jiǎn)單肽段模式軟件輔助分析（上網(wǎng)利用相關(guān)網(wǎng)站的軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)）新序列推測(cè)原則

軟件輔助分析找出最佳路徑25六、質(zhì)譜分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)中的應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)鑒定：

用于多肽，蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定外，還廣泛的應(yīng)用于肽指紋圖譜測(cè)定及氨基酸序列測(cè)定。

1）直接通過(guò)末端氨基酸序列分析鑒定蛋白質(zhì)

2）結(jié)合肽譜數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)（肽質(zhì)量指紋譜）

3）蛋白質(zhì)修飾鑒定

六、質(zhì)譜分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)中的應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)鑒定：

26用MALDI-TOFMS檢測(cè)特定部位氨基酸殘基的磷酸化用MALDI-TOFMS檢測(cè)特定部位氨基酸殘基的磷酸化274）分子量測(cè)定：

MALDI-TOF的準(zhǔn)確度高達(dá)0.1%~0.01%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術(shù)，目前可測(cè)定生物大分子的分子量高達(dá)300KDa。

5）另外分子量測(cè)定還可以提供分子結(jié)構(gòu)信息：

（1）分子式(樣品的元素組成)用同位素豐度比法（低分辨法）或高分辨質(zhì)譜儀測(cè)得的準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量，均可以確定分子式；

（2）鑒定某些官能團(tuán)如甲基(m/z15)、羰基(m/z28)、甲氧基(m/z31)、乙?；?m/z43)……

（3）分子結(jié)構(gòu)信息由分子結(jié)構(gòu)與裂解方式的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律,根據(jù)碎片離子的m/z及相對(duì)豐度RA提供分子結(jié)構(gòu)信息。4）分子量測(cè)定：

MALDI-TOF的準(zhǔn)確度282、質(zhì)譜峰圖譜比較：用于混合物比較

如血、尿、分泌液中的代謝物（大分子和小分子）等改變的監(jiān)測(cè)，可以用于生物標(biāo)記物分析鑒定，作為生物藥材的鑒定，監(jiān)測(cè)疾病過(guò)程，治療效果，預(yù)后評(píng)價(jià)，各種生理病理過(guò)程研究的監(jiān)測(cè)和評(píng)估

3、質(zhì)譜分析方法的選擇

1）質(zhì)譜峰圖譜比較：

SELDI-TOFMS2kDa–50kDa

MALDI-TOFMS0.8kDa–300kDa

2）蛋白質(zhì)鑒定：

MALDI-TOFMSPMF

串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS）氨基酸序列分析

2、質(zhì)譜峰圖譜比較：用于混合物比較

如血、尿29七、基本過(guò)程與樣品制備注意事項(xiàng)（一）基本過(guò)程1）蛋白質(zhì)分離純化：還原和巰基封閉（烷基化）等電聚焦-SDSPAGE電泳（500-10,000個(gè)點(diǎn)）混合HPLC層析直接接MS分析（用IEX/RPC方法可以產(chǎn)生~2,500洗脫帶）對(duì)SELDI-TOFMS溶解蛋白質(zhì)直接加在蛋白質(zhì)芯片上2）膠染色，圖像分析（比較找差異，雙染色如Cy3、Cy5染色），含蛋白膠切取（前后圖像對(duì)照）。以上各個(gè)步驟在自己的實(shí)驗(yàn)室完成七、基本過(guò)程與樣品制備注意事項(xiàng)（一）基本過(guò)程303）膠內(nèi)蛋白酶限制酶切，從此步驟可由公司完成

4）肽段提取純化，點(diǎn)樣

5）質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)獲取（質(zhì)譜儀器分析）

6）數(shù)據(jù)信息解讀

人工：氨基酸序列分析（可以自己人工分析）

軟件處理：蛋白質(zhì)鑒定、氨基酸序列分析

網(wǎng)站：/tools/#proteome

可以選擇轉(zhuǎn)向相關(guān)網(wǎng)站

軟件：MASCOT等適用于PMF和氨基酸序列分析

數(shù)據(jù)庫(kù)：MSDB、NCBInr、SwissProt

3）膠內(nèi)蛋白酶限制酶切，從此步驟可由公司完成

4）肽段提取31（二）樣品制備注意事項(xiàng)

1）防止蛋白質(zhì)降解2）需要還原與烷基化處理3）電泳膠塊處理過(guò)程中（取膠、染色、切取膠塊等），不可皮膚直接接觸，和頭皮削掉落其上。4）切膠前后留膠的圖像5）送作質(zhì)譜分析樣品達(dá)到必須的濃度6）有可帶電荷基團(tuán)、適當(dāng)?shù)膒H值、不含各種去污劑、DMSO、DMF、甘油、磷酸鹽、其它鹽和緩沖劑<100mM。（二）樣品制備注意事項(xiàng)1）防止蛋白質(zhì)降解32ThefollowingcomponentsareACCEPTABLE

Aceticorformicacid,Acetonitrile,ethanol,

Guanidine/HCl4M,

Hexafluoroisopropanolupto40%,

Methanol,Sodiumchloride10mM,

Urea1MThefollowingcomponentsare33八、質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件使用

（以Mascot為例）ExPASyProteomicsToolsMatrixScience主頁(yè)P(yáng)MF分析MS/MS分析八、質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件使用

（以Mascot為例）ExPASy34用于蛋白質(zhì)鑒定的兩種基本的質(zhì)譜分析技術(shù)1）MALDI-TOFMSMatrix-AssistedLaserDesorptionIonization/基質(zhì)輔助激光解吸附離子化Time-Of-Flightmassspectrometry飛行時(shí)間PMF:peptidemassfingerprinting肽質(zhì)量指紋譜MW:800-300,000用于蛋白質(zhì)鑒定的兩種基本的質(zhì)譜分析技術(shù)1）MALDI-TOF352）SELDI-TOFMSSurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization

表面增強(qiáng)激光解吸附離子化MW:2,000-50,0003）MS/MSTandemMS串連質(zhì)譜技術(shù)MW:200-3,0002）SELDI-TOFMS361）MALDI-TOFMS

（原理示意圖）SourceLength=sField-freedriftzoneLength=DEd=0MicrochannelplatedetectorExtractiongrid(sourcevoltage-Vs)UV(337nm)Detectorgrid-VsPulsevoltageAnalyte/matrix1）MALDI-TOFMS

（原理示意圖）SourceL37用MALDI-TOFMS和數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定細(xì)菌蛋白GroEL用MALDI-TOFMS和數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定細(xì)菌蛋白GroEL38PMF肽質(zhì)量指紋譜鑒定蛋白質(zhì)例子Myoglobin

GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASEDLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKHPGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQGPMF肽質(zhì)量指紋譜鑒定蛋白質(zhì)例子Myoglobin

GLS39Myoglobin用胰蛋白酶限制酶切后產(chǎn)生的肽段

（從堿性氨基酸的羧基端切斷）Myoglobin

GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASEDLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKHPGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQGMyoglobin用胰蛋白酶限制酶切后產(chǎn)生的肽段

（從堿性氨40質(zhì)譜分析技術(shù)課件41質(zhì)譜分析技術(shù)課件422）SELDI-TOFMS（原理示意圖）

EAM:能量吸收分子2）SELDI-TOFMSEAM:能量吸收分子43SELDI-TOFMS分析使用的各種蛋白質(zhì)芯片SELDI-TOFMS分析使用的各種蛋白質(zhì)芯片44質(zhì)譜分析技術(shù)課件45SELDI-TOFMA檢測(cè)結(jié)果與處理SELDI-TOFMA檢測(cè)結(jié)果與處理46實(shí)例：鼻咽癌病人血清標(biāo)志物檢測(cè)實(shí)例：鼻咽癌病人血清標(biāo)志物檢測(cè)47卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中分泌蛋白的SELDI-TOFMS檢測(cè)分析卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中分泌蛋白的SELDI-TOFMS檢測(cè)482）MS/MS

串連質(zhì)譜分析原理示意圖2）MS/MS

串連質(zhì)譜分析原理示意圖49限制酶切蛋白質(zhì)為肽段EnzymaticDigestandFractionation限制酶切蛋白質(zhì)為肽段EnzymaticDigest50第一步MS分離各個(gè)肽段

第二步MS對(duì)其中的一個(gè)肽段進(jìn)行氨基酸序列分析MS/MS第一步MS分離各個(gè)肽段

第二步MS對(duì)其中的一個(gè)肽段進(jìn)行氨基酸51碰撞誘導(dǎo)解離CID中多肽分子結(jié)構(gòu)中鍵斷裂的多種可能性-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-RiCH-R’biyn-iyn-i-1bi+1R”i+1i+1aixn-icizn-i碰撞誘導(dǎo)解離CID中多肽分子結(jié)構(gòu)中鍵斷裂的多種可能性-HN-52控制CID過(guò)程中的能量，使多肽主要從最弱的鍵肽鍵處斷裂產(chǎn)生N-端b系列和C-端y系列肽段-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-RiRi+1biyn-iyn-i-1bi+1控制CID過(guò)程中的能量，使多肽主要從最弱的鍵肽鍵處斷裂53串聯(lián)質(zhì)譜氨基酸序列分析例子

肽段SGFLEEDELK在理想條件下可生成的b、y系列離子S=serine87.08G=glycine57.05F=phenylalanine147.18L=leucine113.16E=glutamate129.12D=aspartate115.09K=lysine128.17串聯(lián)質(zhì)譜氨基酸序列分析例子

肽段SGFLEEDELK在理想條54先找出y系列離子K1166L1020E907D778E663E534L405F292G145S88bions10002505007501000m/z%Intensity147260389504633762875102210801166yionsy6y7y2y3y4y5y8y9先找出y系列離子K1166L1020E907D778E66355再找出b系列離子K1166L1020E907D778E663E534L405F292G145S88bions10002505007501000m/z%Intensity147260389504633762875102210801166yionsy6y7y2y3y4y5y8y9b3b5b6b7b8b9b4再找出b系列離子K1166L1020E907D778E66356新序列推測(cè)10002505007501000m/z%IntensityEL新序列推測(cè)10002505007501000m/z%Int57新序列推測(cè)210002505007501000m/z%IntensityELFKLSGFGEDELEEDEL新序列推測(cè)210002505007501000m/z%In58新序列推測(cè)原則

軟件輔助分析找出最佳路徑一個(gè)峰不能使用兩次，連續(xù)前進(jìn)或者退后。簡(jiǎn)單肽段模式軟件輔助分析（上網(wǎng)利用相關(guān)網(wǎng)站的軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)）新序列推測(cè)原則

軟件輔助分析找出最佳路徑59六、質(zhì)譜分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)中的應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)鑒定：

用于多肽，蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定外，還廣泛的應(yīng)用于肽指紋圖譜測(cè)定及氨基酸序列測(cè)定。

1）直接通過(guò)末端氨基酸序列分析鑒定蛋白質(zhì)

2）結(jié)合肽譜數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)（肽質(zhì)量指紋譜）

3）蛋白質(zhì)修飾鑒定

六、質(zhì)譜分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)中的應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)鑒定：

60用MALDI-TOFMS檢測(cè)特定部位氨基酸殘基的磷酸化用MALDI-TOFMS檢測(cè)特定部位氨基酸殘基的磷酸化614）分子量測(cè)定：

MALDI-TOF的準(zhǔn)確度高達(dá)0.1%~0.01%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術(shù)，目前可測(cè)定生物大分子的分子量高達(dá)300KDa。

5）另外分子量測(cè)定還可以提供分子結(jié)構(gòu)信息：

（1）分子式(樣品的元素組成)用同位素豐度比法（低分辨法）或高分辨質(zhì)譜儀測(cè)得的準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量，均可以確定分子式；

（2）鑒定某些官能團(tuán)如甲基(m/z15)、羰基(m/z28)、甲氧基(m/z31)、乙?；?m/z43)……

（3）分子結(jié)構(gòu)信息由分子結(jié)構(gòu)與裂解方式的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律,根據(jù)碎片離子的m/z及相對(duì)豐度RA提供分子結(jié)構(gòu)信息。4）分子量測(cè)定：

MALDI-TOF的準(zhǔn)確度622、質(zhì)譜峰圖譜比較：用于混合物比較

如血、尿、分泌液中的代謝物（大分子和小分子）等改變的監(jiān)測(cè)，可以用于生物標(biāo)記物分析鑒定，作為生物藥材的鑒定，監(jiān)測(cè)疾病過(guò)程，治療效果，預(yù)后評(píng)價(jià)，各種生理病理過(guò)程研究的監(jiān)測(cè)和評(píng)估

3、質(zhì)譜分析方法的選擇

1）質(zhì)譜峰圖譜比較：

SELDI-TOFMS2kDa–50kDa

MALDI-TOFMS0.8kDa–300kDa

2）蛋白質(zhì)鑒定：

MALDI-TOFMSPMF

串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS）氨基酸序列分析

2、質(zhì)譜峰圖譜比較：用于混合物比較

如血、尿63七、基本過(guò)程與樣品制備注意事項(xiàng)（一）基本過(guò)程1）蛋白質(zhì)分離純化：還原和巰基封閉（烷基化）