實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)染色法

關(guān)于實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)染色法第一頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日Pleasebequiet,上課了?。〉诙?yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日

1、學(xué)習(xí)利用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理及方法；

2、掌握分光光度計(jì)的使用方法；

3、掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模旱谌?yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日

考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性溶液中游離狀態(tài)下為棕紅色。當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過(guò)范德華鍵結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色.

蛋白質(zhì)染料復(fù)合物對(duì)595nm可見光有最大光吸收.

在一定范圍內(nèi)（10-1000ug/ml）其OD595nm值與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用分光光度法進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。二、實(shí)驗(yàn)原理：第四頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日考馬斯亮藍(lán)G-250染色法原理465nm595nm酸性環(huán)境下呈棕紅色與蛋白質(zhì)結(jié)合變藍(lán)色加入蛋白質(zhì)第五頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日雙縮脲反應(yīng)：Folin-酚試劑法（Lowry法）：紫外吸收法：微量凱式定氮法：其他蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法第六頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日（1）雙縮脲法：

原理是蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵（-CO-NH-）因此，有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，故可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量.第七頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日（2）Folin-酚試劑法（Lowry法）：

是雙縮脲法的發(fā)展，第一步涉及到堿性溶液中銅蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，然后這個(gè)復(fù)合物還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物）比雙縮脲法靈敏，但費(fèi)時(shí)；

第八頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日（3）紫外吸收法：

蛋白質(zhì)中Trp，Phe，Tyr的殘基中的苯環(huán)含有共軛雙鍵，吸收高峰在280nm處，所以蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，并且蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與其含量成正比，可用作定量測(cè)定。簡(jiǎn)單、靈敏、快速、不耗樣品，低濃度的鹽類不干擾。

第九頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日（4）微量凱式定氮法：

根據(jù)蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，因此，測(cè)得1g蛋白氮，相當(dāng)于6.25g蛋白質(zhì)。

第十頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日

1、實(shí)驗(yàn)材料：豆芽

2、儀器：(1)S-22pc可見光分光光度計(jì)(2)研缽

(3)離心機(jī)(4)試管(5)容量瓶等

3、試劑：（1）染色液：考馬斯亮藍(lán)G-250

(100mg考馬斯亮藍(lán)溶于50ml95%乙醇，加100ml85%磷酸，加水稀釋至1L)（2）濃度：0.25mg/ml的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：第十一頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

取7支試管，依次分別加入0.0，0.10,0.15,0.20,0.30,0.40,0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水補(bǔ)足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即搖勻，置室溫下放置5分鐘。然后測(cè)各管的OD595nm值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。四、實(shí)驗(yàn)步驟：

第十二頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

編號(hào)1(空白）234567樣品標(biāo)準(zhǔn)蛋白

(ml)0.00.10.150.20.30.40.50.5ml

水(ml)0.50.40.350.30.20.10.0濃度(mg/ml)0.00.050.0750.10.150.20.25C0染色液(ml)55555555OD值第十三頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度OD值0樣品OD值C00.050.0750.1

0.150.20.25OD1OD2OD3OD4OD5OD6

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（圖）y=ax+bR2=第十四頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制目的：得到樣品中蛋白質(zhì)的濃度。首先，用一組已知濃度的蛋白質(zhì)溶液與考馬斯亮藍(lán)G-250反應(yīng),然后在595nm處測(cè)定吸光度（OD）。其次，繪制濃度與吸光度對(duì)應(yīng)的曲線圖。最后，測(cè)定樣品蛋白質(zhì)的吸光度然后在曲線上找到對(duì)應(yīng)的濃度。第十五頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日

稱取豆芽葉片2g→研缽中加2ml水→研成勻漿→轉(zhuǎn)入離心管→用水分三次沖洗研缽，每次2ml→均轉(zhuǎn)入同一離心管→等重后4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘→取上清液轉(zhuǎn)入25ml容量瓶→定容。2、樣品蛋白質(zhì)提?。旱谑?yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日

吸取0.5ml提取液于試管中,加入考馬斯亮藍(lán)G-250染色劑5ml，充分混勻，放置5分鐘，測(cè)OD595nm，記錄結(jié)果，查曲線，得蛋白質(zhì)濃度C0(mg/ml)。3、測(cè)定：第十七頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日分光光度技術(shù)

利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測(cè)定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計(jì).

紅外吸收光譜：波長(zhǎng)范圍2.51000m,主要用于有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定。紫外吸收光譜：波長(zhǎng)范圍200400nm（近紫外區(qū)）可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析?？梢娢展庾V：波長(zhǎng)范圍400750nm，主要用于溶液等的定量分析。第十八頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日

朗伯—比爾(Lambert-bee)光吸收定律：A＝lg（I0/It)＝-lgT＝εbc（1）A—吸光度“OD”：描述溶液對(duì)光的吸收程度；同一種溶液對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸光度是不相同的，在吸光度最大處所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大光吸收處。同一種物質(zhì)不同濃度的吸光度，在某一定波長(zhǎng)下有差異，在最大光吸收處吸光度的差異最大。這是分光光度法進(jìn)行物質(zhì)定量分析的重要依據(jù)。I0：表示入射光強(qiáng)度，It：表示光線通過(guò)溶液后的強(qiáng)度。光吸收定律：第十九頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日（2）T—透光度：描述入射光透過(guò)溶液的程度；

（3）ε—摩爾吸光系數(shù)(是溶液的特征常數(shù))，在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時(shí)該溶液在某一波長(zhǎng)下的吸光度；單位mol·L－1；（4）b—樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收地，b=1cm（5）C—樣品濃度（mol/L）由上式可以看出：吸光度OD與物質(zhì)的濃度“C”和溶液吸光的厚度成正比。A＝lg（I0/It)=-lgT＝εbc

第二十頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日

分光光度計(jì)的組成和構(gòu)造：（1）光源；（2）單色器（3）吸收池；（4）接收檢測(cè)放大系統(tǒng)(檢測(cè)器)；（5）信號(hào)指示系統(tǒng)(顯示或記錄器)。第二十一頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日

⑴光源：

用于可見光光源是鎢燈和鹵鎢

，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（Halogenlamp），適用波長(zhǎng)范圍是320～1100nm。用于紫外光區(qū)的是氫燈和氘燈適用波長(zhǎng)范圍是195～400nm。第二十二頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日⑵單色器：?jiǎn)紊魇欠止夤舛扔?jì)的心臟部分。把來(lái)自光源的混合光波分解為單一波長(zhǎng)的光能隨意改變光的波長(zhǎng)。單色器一般由入射狹縫、準(zhǔn)光器（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色散元件:主要是棱鏡和光柵第二十三頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日⑶吸收池吸收池（即比色杯）：用來(lái)盛裝被測(cè)試的溶液。光學(xué)比色杯和石英比色杯兩種。光學(xué)比色杯適用波長(zhǎng)范圍是400nm～2000nm，只能用于可見光。石英比色杯可透過(guò)紫外光、可見光和紅外光，是最常使用的吸收池，使用波長(zhǎng)范圍是180nm～3000nm。光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容積3ml）第二十四頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日比色杯使用注意事項(xiàng)：①比色杯在使用前后都要徹底的清洗。②嚴(yán)禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。③嚴(yán)禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。④嚴(yán)禁加熱烘烤。急用干的杯子時(shí)，可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。

第二十五頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日⑷檢測(cè)器：檢測(cè)器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，即把光強(qiáng)度以電訊號(hào)顯示出來(lái)，常用的檢測(cè)器有光電管，光電倍增管和光電二極管等。

⑸顯示裝置：分光光度計(jì)現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示，有的還連有打印機(jī)。高性能分光光度計(jì)均可以連接微機(jī)，而且有的主機(jī)還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機(jī)和打印繪圖機(jī)，有的還帶有標(biāo)準(zhǔn)軟驅(qū)，存取數(shù)據(jù)更加方便。第二十六頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日偏離朗伯—比耳定律的原因

標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定未知溶液的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時(shí)），這種現(xiàn)象稱為對(duì)朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學(xué)性因素。第二十七頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日（1）物理性因素

難以獲得真正的純單色光。

朗伯—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。分光光度計(jì)只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)致對(duì)朗伯—比耳定律的正或負(fù)偏離。

非單色光、雜散光、散射光和反射光、非平行入射光都會(huì)引起對(duì)Beer-Lambert定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。

第二十八頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日(2)化學(xué)性因素

朗—比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點(diǎn)之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時(shí)才基本符合。當(dāng)溶液濃度c>10－2mol/L時(shí)，溶液中溶質(zhì)可因濃度改變而有離解、締合、互變異構(gòu)、配合物的形成和與溶劑間的作用，使吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。

例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：CrO42-＋2H