實(shí)驗(yàn)同源重組

關(guān)于實(shí)驗(yàn)同源重組第一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

內(nèi)容一、什么是Red/ET同源重組二、技術(shù)的特點(diǎn) 三、作用機(jī)制 四、功能元件 五、操作流程及關(guān)鍵因素 六、在基因工程中的主要應(yīng)用 七、新技術(shù)的發(fā)展八、在其他細(xì)菌中的應(yīng)用 第二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

遺傳重組基因組的可變性和穩(wěn)定性之間必須維持一個(gè)恰到好處的平衡，這樣才能使生物體得以生存并能世代相傳，繁衍不息。染色體的遺傳差異主要由兩種機(jī)制產(chǎn)生，一種是突變，一種是遺傳重組。第三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日?重組可分為四類（DNA序列、蛋白質(zhì)因子）?狹義遺傳重組：涉及到DNA分子內(nèi)斷裂-復(fù)合的基因交流?遺傳重組與重組DNA技術(shù)異常廣義遺傳重組：任何造成基因型變化的基因交流過(guò)程第四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日一、什么是Red/ET同源重組1.概念Red/ET重組是新近出現(xiàn)的一種利用來(lái)自E.coli中λ

噬菌體的重組酶Redα/Redβ

或者是來(lái)自Rac噬菌體的重組酶RecE/RecT進(jìn)行基因同源重組的DNA工程技術(shù)。2.原理首先重組酶沿5’→3’方向消化雙鏈DNA，露出粘性末端（15-50bp）。隨后重組酶介導(dǎo)單鏈退火修復(fù)（single-strandannealing），即載體和插入片段的黏性末端（15-50bp）互補(bǔ)形成穩(wěn)定的帶缺刻的環(huán)狀重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后能自動(dòng)被修復(fù)為閉合的環(huán)狀質(zhì)粒

第五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日3.特點(diǎn)：

Red同源重組技術(shù)具有同源序列短(15～50bp)、重組效率高、操作簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)。4.應(yīng)用

這種技術(shù)可在DNA靶標(biāo)分子的任意位點(diǎn)進(jìn)行基因敲除、敲入、點(diǎn)突變等操作,無(wú)需使用限制性內(nèi)切酶和連接酶。此外,這種新型重組技術(shù)可直接將目的基因克隆到載體上,目的基因既可來(lái)源于細(xì)菌人工染色體也可是基因組DNA。Red同源重組技術(shù)使難度較大的基因工程實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行,大大推動(dòng)功能基因組研究的發(fā)展。第六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日第七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日gbalphageETRacphageRacrecE/recT

操縱子=λ

red

操縱子,操縱子中的重組酶（Redα/Redβ

或者RecE/RecT）協(xié)同配合完成重組作用；recE=redα

：5’→3’dsDNA核酸外切酶；

recT=redβ

：ssDNA結(jié)合和退火蛋白；

redγ：防止E.coli中的核酸酶RecBCD對(duì)外源線性DNA片段的消化。λ噬菌體的pL操縱子示意圖

第八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日Reda(RecE)Red同源重組原理示意圖Single-strandannealingStrandinvasion3’5’DigestionBinding3’5’Redb(RecT)Repair/ReplicationSelection第九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日RecE/RecT和Redα/Redβ兩重組系統(tǒng)的差異“線狀DNA＋線狀DNA”重組，選用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)；“線狀DNA＋環(huán)狀DNA”重組，選用Redα/Redβ重組酶系統(tǒng)；

根據(jù)需要選擇含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（pBAD、pTet）的重組酶系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒:pSC101-BAD-gbaA(amp)pSC101-BAD-gbaA(tet)pSC101-BAD-gbaA(hyg)pSC101-Tet-gbaA(tet)pSC101-BAD-ETgA(tet)pSC101-Tet-ETgA

(amp)第十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日RecE/RecT和Redα/Redβ兩重組系統(tǒng)對(duì)不同類型底物重組效率的差異第十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日Red同源重組技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)第十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日NatureGenetics(1998)NatureBiotechnology(2000)第十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日1.不依賴RecA蛋白，在重組酶系統(tǒng)（Redα/Redβ或RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供體DNA分子能直接重組到受體DNA分子上，實(shí)現(xiàn)替換、插入、刪除、突變等；2.不受靶標(biāo)DNA分子大小的限制；3.不受內(nèi)切酶切位點(diǎn)的限制；4.精確性：不依賴RecA蛋白，減少了引入非預(yù)期的突變、缺失、替換等的幾率；

5.簡(jiǎn)便快捷：省去了中間質(zhì)粒的構(gòu)建，減少實(shí)驗(yàn)步驟、縮短實(shí)驗(yàn)周期。二、Red/ET同源重組技術(shù)的特點(diǎn)第十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日三、Red/ET重組的作用機(jī)制Red/ET重組鏈入侵模型1.鏈入侵模式第十五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日Red/ET同源重組鏈退火模型2.鏈退火模型第十六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日四、Red/ET重組中的功能元件1.Redα、Redβ和RedγRedα：以三聚體的形式形成“漏斗型”活性的蛋白，5’-3’外切酶活性。Redα結(jié)構(gòu)（A）和與DNA相互作用的模式（B）（圖片來(lái)自Subramanianetal.2003）

Redβ：與ssDNA結(jié)合形成絲狀體，催化與互補(bǔ)ssDNA之間的退火。

Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶對(duì)外源DNA的降解。第十七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日2.RecE和RecTRecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，對(duì)5’端為羥基的底物也有活性。RecT：與ssDNA結(jié)合形成絲狀體，催化與互補(bǔ)ssDNA之間的退火。3.RecA

４個(gè)亞基形成有活性的RecA蛋白，細(xì)菌中廣泛存在且高度保守，有同源重組酶、DNA損傷修復(fù)、DNA依賴ATPase活性等功能?？烧T導(dǎo)SOS反應(yīng)、挽救DNA復(fù)制叉等，提高電擊后細(xì)胞的活力，增加電轉(zhuǎn)化效率。第十八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日五、Red/ET重組操作流程引物設(shè)計(jì)合成線性供體dsDNA底物的制備線性載體的制備重組反應(yīng)重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞重組子篩選重組子檢測(cè)第十九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日1.設(shè)計(jì)合成引物

設(shè)計(jì)引物時(shí)要遵循一般引物設(shè)計(jì)的基本原則，但是上下游引物要加上15-20bp的載體同源序列。載體同源序列如何添加主要分以下兩種情況：（1）載體酶切后是5’端突出或平末端，則引物上的同源序列包括5’端突出序列的同源序列。（2）載體酶切后是3’端突出，則引物上的同源序列不包括3’端突出序列的同源序列。第二十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日引物設(shè)計(jì)方法第二十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日同源臂長(zhǎng)度對(duì)Red/ET重組效率的影響（數(shù)據(jù)來(lái)自Zhangetal.1998）

同源臂的長(zhǎng)度在15～50bp時(shí)，重組效率就能滿足實(shí)驗(yàn)要求，重組效率隨著同源臂長(zhǎng)度的增加而增加。第二十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日2.線性供體dsDNA底物的制備

選用保真度高的DNA聚合酶（如Phusion、Pyrobest等，減少PCR反應(yīng)中的突變；擴(kuò)增GC含量較高的DNA片段時(shí)，選用Triplemaster、HotStarTaq等），用合成的引物PCR擴(kuò)增獲得dsDNA底物；純化PCR產(chǎn)物：

（1）減少模板背景對(duì)篩選工作帶來(lái)的難度；（2）降低其剩余引物與靶標(biāo)DNA片段的結(jié)合，提高重組效率；（3）去處PCR產(chǎn)物中的鹽離子，提高轉(zhuǎn)化效率。降低模板對(duì)篩選工作帶來(lái)的難度；

（1）純化回收PCR產(chǎn)物；（2）內(nèi)切酶消化處理模板；（3）使用R6K復(fù)制子。第二十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日線性化載體可以通過(guò)酶切或PCR擴(kuò)增兩種方法獲得。1）酶切

選取合適的位點(diǎn)，單酶切或雙酶切皆可,質(zhì)粒的線性化不徹底，將導(dǎo)致陰性克隆的產(chǎn)生，為了提高陽(yáng)性率，建議通過(guò)雙酶切進(jìn)行質(zhì)粒線性化。2）PCR擴(kuò)增

選取合適的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)正向和反向引物，引物長(zhǎng)度一般在18-20bp左右，建議用高保真的聚合酶擴(kuò)增。為了避免模板質(zhì)粒DNA對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的影響，建議用DpnI內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，降低背景，提高陽(yáng)性率。不管采取哪種方法，最終線性化載體的濃度需>50ng/ul，高濃度的載體有利于提高效率。

3.線性載體的制備第二十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日4.同源重組反應(yīng)試劑加量10xBuffer1ulRecombinationEnzyme1ul線性化載體（>50ng/ul）

50-100ng插入片段（>50ng/ul）150-200ngddH2O補(bǔ)足至10ul（1）配置反應(yīng)體系

將目的DNA片段和線性化載體以一定的摩爾比加到管子中進(jìn)行重組反應(yīng)（摩爾比可計(jì)算方法見附錄），10ul體系(見下表)注意：1.目的片段與載體的摩爾比在2:1-5:1之間，摩爾比低于2:1效率會(huì)降低；2.反應(yīng)時(shí)間在15-30分鐘，時(shí)間太短不利于重組反應(yīng)（2）短暫離心混勻，37℃孵育15分鐘。（3）反應(yīng)結(jié)束后，取5-10ul反應(yīng)液立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化，剩余反應(yīng)液可在4℃或-20℃保存待用。

第二十五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日5.重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞冰上融化一管100μl的DH5α感受態(tài)細(xì)胞。加入5-10μl反應(yīng)液到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上孵育30分鐘。42℃水浴中熱激45-90秒后，冰浴3分鐘。注意：所使用的感受態(tài)細(xì)胞效率≥1×108cfu/μg.加入890μlSOC液體培養(yǎng)基，37℃復(fù)蘇45-60分鐘。第二十六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日6.重組子篩選

復(fù)蘇培養(yǎng)物8000rpm離心1分鐘收集菌體，根據(jù)需要將一定量的菌體均勻的涂布在含抗生素平板上,37℃倒置培養(yǎng)12-16h后觀察菌落生長(zhǎng)情況。使用抗生素的最低抑菌濃度，有利于獲得更多的重組子：在10μg/mL的卡那霉素平板上重組子的數(shù)目是60μg/mL的卡那霉素平板上重組子的數(shù)目的6倍。

抗生素使用濃度與Red/ET重組效率的關(guān)系

第二十七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日常用抗生素的工作濃度第二十八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日7.重組子的檢測(cè)

檢測(cè)方法：酶切分析、PCR檢測(cè)、平板雙劃線、測(cè)序等；

一般采用菌落PCR進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定。為避免假陽(yáng)性結(jié)果，鑒定引物選擇一條為載體特異性引物，另一條引物為目的片段特異性引物。高拷貝質(zhì)粒修飾存在“質(zhì)粒多聚體”現(xiàn)象；“質(zhì)粒多聚體”問(wèn)題解決辦法：采用“線性DNA+線性DNA”重組方式；利用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)；減低質(zhì)粒拷貝數(shù)。第二十九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日卡那霉素抗性基因（Kan）替換pUC19中的氨芐抗性基因（Amp）“質(zhì)粒多聚體”現(xiàn)象解決辦法：采用“線性DNA+線性DNA”重組方式；利用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)；減低質(zhì)?？截悢?shù)。第三十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日六、Red/ET重組技術(shù)的主要應(yīng)用1.重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.染色體的修飾3.亞克隆（Subcloning）4.直接克?。―irectcloning）第三十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日1.重組質(zhì)粒的構(gòu)建(1)傳統(tǒng)基因克隆技術(shù)的缺點(diǎn)

傳統(tǒng)克隆技術(shù)依賴限制性酶切位點(diǎn)和內(nèi)切酶的消化，當(dāng)缺少合適的酶切位點(diǎn)或者某個(gè)酶切位點(diǎn)在目的片段中大量存在時(shí)，利用內(nèi)切酶消化難以得到相應(yīng)的產(chǎn)物。方法看似簡(jiǎn)單，但實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。大片段難以與載體正確連接。無(wú)法同時(shí)連接多個(gè)（2個(gè)以上）的DNA片段。限制性內(nèi)切酶連接酶第三十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日步驟1：酶切目的片段步驟2：酶切載體步驟3:目的片段與載體連接同源重組克隆步驟傳統(tǒng)克隆步驟步驟4:重組子轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞第三十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日同源重組克隆傳統(tǒng)克隆克隆片段長(zhǎng)度50bp-10kb50bp-2kb一次克隆片段數(shù)1-5個(gè)1個(gè)感受態(tài)效率要求1×108cfu/ug以上1×107cfu/ug以上所用的酶重組酶T4連接酶片段的插入位點(diǎn)任何位點(diǎn)特定位點(diǎn)片段酶切不需要需要載體線性化方法酶切或PCR酶切同源重組克隆與傳統(tǒng)克隆比較第三十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日插入選擇標(biāo)記插入無(wú)選擇標(biāo)記的DNA片段2.染色體的修飾第三十五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日E.coli染色體上插入抗性基因第三十六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

傳統(tǒng)基因工程技術(shù)（A）和Red/ET重組技術(shù)（B）修飾E.coli染色體實(shí)驗(yàn)步驟比較第三十七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（B）不同復(fù)制子能承載外源DNA片段的大小3.亞克?。⊿ubcloning）4.直接克?。―irectcloning）（A）亞克隆和直接克隆示意圖第三十八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日Red/ETsubcloning亞克隆pGB-15A載體抗性基因簇第三十九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日直