SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳課件

第5章SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS主要用于測定蛋白質(zhì)亞基的分子質(zhì)量5.1原理5.2方法5.3實驗考慮5.1原理

5.1.1蛋白質(zhì)分子的解聚原理：在樣品介質(zhì)和凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小，而電荷因素可以被忽略。SDS陰離子去污劑電泳成功關(guān)鍵：（1）溶液中SDS單體的濃度（單體濃度與總濃度重量比1：3或1：4為宜）（2）樣品緩沖液的離子強度（低離子強度溶液中SDS有較高的平衡濃度）（3）二硫鍵是否完全被還原（只有二硫鍵徹底被還原，蛋白質(zhì)分子才能解聚）5.1.3凝膠濃度的選擇凝膠濃度太大，孔徑太小，容易拖尾凝膠濃度太小，孔徑太大，降低分辨率根據(jù)蛋白質(zhì)的不同分子量范圍選擇不同的凝膠濃度分離具有不同遷移率的多組分樣品應(yīng)選擇梯度膠，并使感興趣的組分正好走在凝膠的中間位置凝膠濃度與分子質(zhì)量測定的關(guān)系5.1.4分子質(zhì)量測定

5.1.4.1分子質(zhì)量測定的理論背景Ferguson作圖法：測量蛋白質(zhì)分子在不同濃度凝膠中的相對遷移率來排除電荷因素的影響基團添加：用帶有相當(dāng)大大量電荷的基團（如SDS）結(jié)合到蛋白質(zhì)分子以克服原有電荷的影響，在SDS系統(tǒng)中分子質(zhì)量和相對遷移率有線性關(guān)系

5.1.4.2蛋白標(biāo)準(zhǔn)用SDS電泳技術(shù)測量未知蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量時通常使用蛋白標(biāo)準(zhǔn)：1.蛋白標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)與特性應(yīng)盡可能與未知蛋白相近2.蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量范圍應(yīng)在未知蛋白附近3.蛋白標(biāo)準(zhǔn)和未知樣品必須用相同的方法制備4.有異常的氨基酸組成的蛋白質(zhì)不宜做蛋白標(biāo)準(zhǔn)5.糖蛋白不能用通常的標(biāo)準(zhǔn)曲線來求分子質(zhì)量異常蛋白:如RNA酶,DNA酶,胰凝乳蛋白酶原,酪蛋白及分子量低于15kDa的蛋白5.1.5低分子質(zhì)量多肽的SDS電泳分子量低于15kDa的多肽在常規(guī)Tris-甘氨酸-鹽酸系統(tǒng)中電泳分辨率不足Schagger等使用濃縮膠，增加緩沖液摩爾濃度并用三羥甲基氨基酸甘氨酸代替甘氨酸作為終止離子，這樣便可再1-100kDa得到線性關(guān)系Swank等采用合適孔徑，即增加Bis的濃度以及在含有SDS的凝膠中加8mol/L的尿素，能使測定的分子量接近于預(yù)期值Kyte等發(fā)現(xiàn)由25-250個殘基組成的多肽可用8mol/L尿素和0.1%SDS的20%的聚丙烯酰胺凝膠分離5.2.1制膠（用于垂直電泳或水平電

泳）SDS的制膠方法與native的灌注方法基本相同，只是在SDS電泳制膠時單體貯液不需要抽氣，以免產(chǎn)生泡沫，且聚合后的凝膠在室溫下而不是4℃放置過夜這樣既可使凝膠充分聚合以提高電泳分辨率，又防止SDS在凝膠中結(jié)晶。自制SDS凝膠最多室溫保存4天，因為SDS的高pH會使丙烯酰胺水解，如需長期保存做好選用pH6.7的Tris-醋酸緩沖溶液SDS電泳連續(xù)電泳凝膠配方SDS不連續(xù)電泳用的凝膠配方（垂直電泳用）SDS不連續(xù)電泳用的凝膠配方（水平電泳用）小孔梯度SDS凝膠配方5.2.2.2蛋白標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)備選擇合適分子量范圍的市售蛋白標(biāo)準(zhǔn)或自己配制(5-7種蛋白)溶解在樣品緩沖液中，與樣品一起在100℃煮3-5分鐘，分裝后-20℃可保存6個月使用前需再煮，若以β-巰基乙醇為還原劑需現(xiàn)加5.2.2.3樣品濃度和加樣要求樣品濃度取決樣品的組成，分析目的和檢測方法加樣要求：要求與native陽極電泳相同，進行垂直電泳時輕拔梳子，慎防氣泡，樣品數(shù)目不夠時加緩沖液占位。水平電泳可在膠面直接加樣或用濾紙塊加樣，或在加樣孔中加樣5.2.3.2水平電泳濾紙搭橋的SDS水平電泳方法與native方法相同連續(xù)和不連續(xù)電泳的電極緩沖液和上述SDS垂直電泳相同，電泳可采用恒電流方式，加樣時用低電流，以使樣品分子順利地進入凝膠SDS連續(xù)和不連續(xù)電泳的參數(shù)5.2.4檢測在SDS電泳中，由于SDS和還原劑使蛋白質(zhì)變性失活，故電泳之后的檢測方法有限，一般多為考馬斯亮藍染色和銀染色，其次為熒光方法和轉(zhuǎn)移后檢測5.2.4.1考馬斯亮藍染色由于SDS和蛋白質(zhì)分子競爭染料而干擾考馬斯亮藍染色，所以SDS電泳后的凝膠的固定和染色時間應(yīng)比native長1倍左右，或用多倍體積的染色液染色以排除SDS的影響考馬斯亮藍R為紅藍色，G為藍綠色?？捡R斯亮藍R-250結(jié)合于蛋白質(zhì)堿性基團，一定pH時染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物被完全解聚考馬斯亮藍染色可先固定再進行染色和脫色或同時進行固定和染色染色時間超過12小時，染色強度不再增加對堿性蛋白和低分子質(zhì)量的多肽的檢測Steck認(rèn)為做好使用甲醛固定，因為甲醛能交聯(lián)蛋白和聚丙烯酰胺凝膠，使蛋白質(zhì)不會再染色時丟失考馬斯亮藍G-250染色方法常同時進行固定和染色SDS電泳后凝膠的銀染色蛋白質(zhì)SDS電泳后的銀染色5.2.4.3其他染色方法在用Stainsall染色時，為克服SDS干擾可將凝膠放在25%的異丙醇中，在50℃加熱15minRemazolBrilliantBlueR用于電泳前的蛋白染色酸性條件下的在鉬酸鹽存在時的苯三酚紅蛋白檢測α-萘酚為第五用快紅B或快藍BB染色亞金染料染色5.2.4.4熒光探針法熒光探針實際山也是一種蛋白染色，其特點是染料本身或反應(yīng)產(chǎn)物在一定環(huán)境中必須是發(fā)熒光的。其可分為電泳前預(yù)標(biāo)記和電泳后再標(biāo)記兩種方法。常見熒光探針如：丹磺酰氯（早期）熒光胺熒光探劑MDPFBis-ANS5.2.4.5電泳轉(zhuǎn)移電泳轉(zhuǎn)移也稱蛋白質(zhì)印跡，即把從電泳或?qū)游龇蛛x的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上的過程。詳見11章5.4.2.6電泳后蛋白帶的氨基酸組成和序

列分析電泳后蛋白帶氨基酸組成的分析：電泳分離后，水解前將感興趣的蛋白片段洗脫進行氨基酸分析（5μg即可）或不進行洗脫直接用酸水解便可在氨基酸分析儀上分析電泳分離后蛋白質(zhì)N端氨基酸序列分析能通過與異硫氰酸苯酯（PITC）反應(yīng)，順利的出去N端氨基酸來測定，即Edman降解法

5.2.4.7電泳后的肽圖分析用SDS在電泳分離的多肽在凝膠上用放射性碘標(biāo)記和用胰蛋白酶水解，肽片從凝膠上洗脫，再用雙向?qū)游龊头派渥燥@影分析。（限制是蛋白中必須含有對放射性碘化作用敏感的氨基酸殘基）在電泳后的凝膠上直接進行蛋白水解裂解，然后在進行第二向的只根據(jù)分子大小分離的SDS電泳后進行肽圖分析5.2.5照相、凝膠干燥照相凝膠干燥儀自然干燥5.2.6定量測定已知和未知樣品必須使用相同的溶劑系統(tǒng)、濃度、加樣量，并在同一塊凝膠上電泳和染色按說明書采用合適的辦法扣除背景對未知和一只樣品的掃描和數(shù)據(jù)處理應(yīng)用相同參數(shù)選擇合適的染色方法以保證濃度和吸光度的線性關(guān)系一些畸變的帶不能進行準(zhǔn)確定量5.3實驗考慮

5.3.1SDS電泳是測定蛋白質(zhì)亞基分子量的最佳選擇與其他技術(shù)相比，SDS電泳測定亞基分子量是一種簡單、經(jīng)濟，快速、高分辨的好方法因為SDS蛋白膠束均一帶負(fù)電荷且電荷量大，故向陽極有較高的遷移速度，SDS處理后的蛋白呈伸展?fàn)顟B(tài)，分離可在排阻性凝膠中完成，這樣便可限制擴散，得到高分辨率的窄帶5.3.2凝膠濃度和緩沖系統(tǒng)的選擇SDS電泳只取決于分子解聚后SDS-蛋白質(zhì)膠束的大小，因此凝膠濃度的選擇會直接影響分辨率5.3.3SDS瓊脂糖凝膠電泳用SDS處理的蛋白質(zhì)的遷移距離與瓊脂糖凝膠濃度有著線性變化。瓊脂糖型號和質(zhì)量影響SDS-蛋白帶的分辨率5.3.4去污劑的選擇非離子去污劑，如Lubrow,Tween等陽離子去污劑，如CTAB，CPC等陰離子去污劑，如DOC，SDS等5.3.4.1陽離子和陰離子去污劑陰離子去污劑SDS作為變性劑和助溶劑幾乎可以溶解所有的蛋白質(zhì)，故通常為陽極電泳高堿性蛋白（如精蛋白）和高酸性蛋白（如鐵氧化還原蛋白）由于不能很好的結(jié)合SDS應(yīng)該用CTAB來替代，方法與SDS電泳基本相同，只是電泳方向是向陰極遷移（陰極電泳）5.3.4.2非離子去污劑不同于陰陽離子去污劑，可以溫和地使蛋白解聚，并保留活性，所以許多膜蛋白和酶可以用非離子去污劑溶解，如Tween80，Triton100等其無離子特性不能消除蛋白質(zhì)間電荷的差異，故不同的蛋白質(zhì)不具有恒定的荷-質(zhì)比，所以必須用Ferguson作圖法測定分子量5.3.4.3酸-尿素去污劑由于尿素的存在，去污劑的結(jié)合量被減少，電泳譜帶隨尿素和去污劑的濃度而改變。用很低交聯(lián)度（C=0.67%）的凝膠和不連續(xù)電泳系統(tǒng)對組蛋白的分離會有很好的結(jié)果，并且可以進而做雙向電泳5.3.4.4電荷位移電泳可用于鑒別從外面結(jié)合到膜上的疏水蛋白以及有很強疏水性的兩性蛋白形成的一個完整的膜結(jié)構(gòu)的差別5.3.5樣品的處理樣品的處理方法對分離的質(zhì)量和重復(fù)性有重要影響。根據(jù)分離的目的可以分三種：還原SDS處理帶有烷基化作用的還原SDS處理非還原的SDS處理5.3.5.1還原SDS處理當(dāng)加入還原試劑二硫蘇糖醇（DTT）或β-巰基乙醇后，蛋白質(zhì)被完全去折疊，只根絕亞基分子質(zhì)量分離，為防氧化，還原劑貯液應(yīng)現(xiàn)配5.3.5.2帶有烷基化作用的還原SDS處理碘乙酰胺的烷基化作用可以很好并且經(jīng)久牢固地保護SH基團，而得到窄的譜帶。另外碘乙酰胺可以捕集過量的DTT防止在銀染時的紋理現(xiàn)象5.3.5.3非還原SDS處理許多樣品，如生理體液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100℃煮3min而無需加還原試劑，此時二硫鍵不被斷裂5.3.6半干技術(shù)SDS電泳的半干技術(shù)原理和方法同native大面積SDS使用半干技術(shù)時應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠條5.3.7檢測方法的選擇由于SDS電泳后樣品已經(jīng)變性，所以檢測方法通常用各種考馬斯亮藍和銀染色，通常SDS電泳凝膠染色后更易脫色，并且得到更高的靈敏度5.3.8生物活性的恢復(fù)從蛋白中除去所有的SDS，許多蛋白會恢復(fù)活性，或至少恢復(fù)部分活性，因為SDS不一定導(dǎo)致不可逆變性，但有許多因素影響活性的恢復(fù)1.SDS的純度2.蛋白酶的影響3.活性不受二硫鍵影響和非均一亞基組成蛋白最易恢復(fù)4.盡可能排除所有結(jié)合和非結(jié)合的SDS，使變性蛋白有足夠時間復(fù)性5.恢復(fù)活性所用的緩沖液應(yīng)包括在電泳過程中被遷移出的輔助因子和輔酶6.疏水蛋白復(fù)性時，必用無離子（兩性）去污劑以保持蛋白可溶5.3.8.1在凝膠中恢復(fù)活性只有單體蛋白和有相同亞基的蛋白才能用這種形式恢復(fù)活性，因為對非均一蛋白來說，不同尺寸亞基多肽鏈將定位在凝膠的不同地方5.3.8.2電泳轉(zhuǎn)移后恢復(fù)生物活性電泳后保存原始結(jié)果的方法5.3.8.3洗脫后在自由溶液中恢復(fù)生物活

性

透析方法不能完全除去SDS，用離子對萃取和用離子-阻滯樹脂等蛋白回收率通常高于80%5.3.9電泳過程中不正?，F(xiàn)象和對策與native基本相同電源上沒有顯示電壓-保險絲斷了或電源故障沒有電流或電流很小-凝膠，緩沖液凝膠條接觸不好前沿指示劑向相反方向移動-電源正負(fù)極錯置或緩沖液選擇錯誤“微笑現(xiàn)象”-凝膠冷卻不均，中間部分冷卻不好“皺眉”現(xiàn)象