本科生免疫學(xué)專業(yè)技能培養(yǎng)方案2

動(dòng)物醫(yī)學(xué)與動(dòng)物藥學(xué)專業(yè)本科生《獸醫(yī)免疫學(xué)》專業(yè)技能培養(yǎng)方案獸醫(yī)微生物學(xué)與獸醫(yī)免疫學(xué)課程組王家鑫2010年9月6日免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課的目的和要求免疫學(xué)是動(dòng)物醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域中的一門重要學(xué)科。在學(xué)習(xí)免疫學(xué)的過(guò)程中，不僅需要掌握本學(xué)科的基礎(chǔ)知識(shí)、基本理論，同樣重要的是不能忽視免疫學(xué)作為實(shí)驗(yàn)性科學(xué)而不斷發(fā)展的事實(shí)。因而，我們?cè)诮虒W(xué)過(guò)程中，注重對(duì)學(xué)生進(jìn)行免疫學(xué)技術(shù)操作及實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ呐囵B(yǎng)。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課是整個(gè)免疫教學(xué)中重要的有機(jī)組成部分。一、實(shí)驗(yàn)課目的：加深和鞏固對(duì)系統(tǒng)理論知識(shí)的理解和體會(huì)。熟悉和掌握免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本技能。培養(yǎng)正確的科學(xué)態(tài)度和思維分析能力。二、實(shí)驗(yàn)課要求：為提高實(shí)驗(yàn)課效果，每次實(shí)驗(yàn)前必須認(rèn)真預(yù)習(xí)。了解實(shí)驗(yàn)原理、材料與方法、注意事項(xiàng)以及預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。認(rèn)真寫實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。加強(qiáng)基礎(chǔ)訓(xùn)練，每次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意基本技術(shù)、基本操作、基本訓(xùn)練。堅(jiān)持嚴(yán)肅性、嚴(yán)格性和嚴(yán)謹(jǐn)性。示教實(shí)驗(yàn)和錄像實(shí)驗(yàn)要仔細(xì)觀察。自行操作要認(rèn)真、準(zhǔn)確。為提高科學(xué)思維、分析、總結(jié)能力，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后必須認(rèn)真地記錄結(jié)果，進(jìn)行分析，得出結(jié)論，完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。全部實(shí)驗(yàn)課結(jié)束后，以小組為單位，完成一份科研項(xiàng)目申請(qǐng)書的撰寫任務(wù)，并按時(shí)交給老師。實(shí)驗(yàn)室守則尊重教師、友愛(ài)同學(xué)，嚴(yán)肅認(rèn)真，嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室應(yīng)穿白大衣，保持安靜，遵守秩序，不允許在實(shí)驗(yàn)室接聽(tīng)電話。愛(ài)護(hù)儀器設(shè)備。節(jié)約試劑。尤其是貴重儀器的使用，未經(jīng)指導(dǎo)教師許可，不得擅自動(dòng)用。如遇器材損壞或其它意外情況應(yīng)及時(shí)報(bào)告指導(dǎo)教師。保持實(shí)驗(yàn)室整潔、衛(wèi)生，實(shí)驗(yàn)完畢后應(yīng)整理好器材、物品，關(guān)好水、電、門窗，廢棄物應(yīng)根據(jù)不同性質(zhì)作適當(dāng)處理，并將實(shí)驗(yàn)室打掃干凈。桌椅放回原處。嚴(yán)格遵守國(guó)家生物安全法和動(dòng)物傳染病法，不得擅自處理試驗(yàn)后的動(dòng)物及其器官，要在專業(yè)教師的指導(dǎo)下進(jìn)行嚴(yán)格消毒和無(wú)害化處理。本科生免疫學(xué)試驗(yàn)計(jì)劃寫作格式淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)計(jì)劃專業(yè)與班級(jí)姓名學(xué)號(hào)成績(jī)：理論依據(jù)或原理；本試驗(yàn)的用途（舉例說(shuō)明，例如，診斷、治療、疫苗評(píng)價(jià)等）；目的（解決什么問(wèn)題，達(dá)到什么要求）；材料：必須有3種主要試劑的公司聯(lián)系電話、價(jià)格、試劑規(guī)格、多少優(yōu)惠、到貨時(shí)間、保存條件；儀器設(shè)備，規(guī)格，型號(hào)等注明；試驗(yàn)方法：寫明方法名稱，主要步驟等；小組人員分工：小組內(nèi)人員的安排；注意事項(xiàng)，安全，衛(wèi)生，記錄等。實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫《獸醫(yī)免疫學(xué)》實(shí)驗(yàn)報(bào)告按學(xué)校的統(tǒng)一格式進(jìn)行書寫。特別注意：每次試驗(yàn)結(jié)束后，要求各位同學(xué)到圖書館查找一篇學(xué)術(shù)論文，這篇論文的研究方法中應(yīng)用了你剛學(xué)過(guò)的方法，并要寫出短評(píng)，對(duì)其方法應(yīng)用是否合理作出評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)一凝集反應(yīng)一、目的了解血清學(xué)方法的原理血清學(xué)方法在微生物診斷中的作用學(xué)會(huì)利用血清稀釋法測(cè)定免疫血清的效價(jià)。二、原理：顆粒性抗原（如細(xì)菌或紅血球）的懸液與含有特異性抗體的血清混合，在適量電解質(zhì)存在的情況下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集塊，稱為凝集反應(yīng)。參加反應(yīng)的抗原稱凝集原（滅活的布魯氏菌體），其血清（布魯氏菌陽(yáng)性血清）中的抗體，稱為凝集素。凝集反應(yīng)的機(jī)制是由于抗原與其相應(yīng)抗體間存在著相對(duì)應(yīng)的極性基。極性基的相互吸附，使抗原外周的水化膜除去，由親水溶膠變成憎水溶膠。憎水溶膠性質(zhì)不穩(wěn)定，水中的電解質(zhì)使抗原顆粒間的排斥力消除，從而產(chǎn)生了凝集現(xiàn)象。試管凝集反應(yīng)（agglutinationintesttubes）是用已知顆粒性抗原檢測(cè)未知抗體及其相對(duì)含量的半定量試驗(yàn)。此法為免疫血清定量測(cè)定效價(jià)法。三、應(yīng)用：凝集試驗(yàn)可以用于定性的檢測(cè)，即根據(jù)凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果陽(yáng)性或陰性；也可以進(jìn)行半定量檢測(cè)，即將標(biāo)本作一系列倍比稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，以出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度作為血清效價(jià)。可進(jìn)行細(xì)菌的抗原分析、鑒定及分型，也可應(yīng)用已知細(xì)菌檢查未知血清的抗體。診斷傷寒、副傷寒病的肥達(dá)氏反應(yīng)（Widaltest）、布魯氏氏病的瑞特氏反應(yīng)（Wrighttest）均屬定量凝集反應(yīng)。這種反應(yīng)適用于各種抗體和可溶性抗原的檢測(cè)，其敏感度高于沉淀反應(yīng)，因此被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床檢驗(yàn)。四、材料：（1）耗材：試管、試管架、移液器、記號(hào)筆；（2）試劑：生理鹽水、布魯氏菌懸液、陽(yáng)性血清、陰性血清；（3）儀器：恒溫箱；五、方法：（1）取清潔干燥的小試管12支，排列在試管架上，（最好標(biāo)記好序號(hào)，以免弄混）。（2）用移液管加入生理鹽水，第1管加入2.3m1，其余2-9管加入0.5m1生理鹽水。（3）用移液管吸取待檢血清0.5m1，注入第一管，并吸吹三次混勻；然后由第一管依次吸取0.5m1注入第二管、第二管到第三管如此類推到第九管為止。（從第九管吸出0.5m1棄去）（以上九管為倍比稀釋）。（4）在每管中加入0.5m1經(jīng)處理的布魯氏菌菌懸液，作為抗原。第10-12管作為對(duì)照。第10試管為抗原對(duì)照，加抗原與生理鹽水。第十一管加陽(yáng)性血清（0.5ml）和抗原。第十二管加陰性血清和抗原。（5）搖勻，并置37。0恒溫箱內(nèi)作用，次日再觀察結(jié)果。觀察結(jié)果時(shí)勿搖動(dòng)試管六、觀察管底是否有凝集現(xiàn)象。記錄結(jié)果完全凝集，凝集塊完全沉于管底，液體澄清，以“十十十十”記錄；疑集塊沉于管底，液體稍混，以“十十十”記錄；部分凝集，液體混濁，以“十十”記錄；極少凝集.液體混濁.以“十”記錄。無(wú)變化記以“一”*取“十十”的稀釋度作為免疫血清的效價(jià)。實(shí)驗(yàn)二沉淀試驗(yàn)一一雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)一、目的要求：1.掌握雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的原理和用途；熟悉雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：1.沉淀反應(yīng)：可溶性抗原（如細(xì)菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂解液、病毒、組織浸出液等）與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，在適量電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見(jiàn)的白色沉淀，稱為沉淀試驗(yàn)。抗原抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)血清學(xué)反應(yīng)條件下，抗原抗體均帶負(fù)電荷，使極化的水分子在其周圍形成水化層，成為親水膠體。當(dāng)抗原與抗體結(jié)合后，表面電荷減少，水化層變薄；而且由于抗原抗體復(fù)合物形成后，與水接觸的表面積減少，由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。在電解質(zhì)作用下，各疏水膠體之間靠攏，形成可見(jiàn)的抗原抗體復(fù)合物。雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)：將可溶性抗原和抗體分別加到瓊脂板上相應(yīng)的小孔中，使兩者各自向四周擴(kuò)散，若抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，兩者相遇即發(fā)生特異性結(jié)合，并在比例合適處形成白色沉淀線?？乖贵w反應(yīng)的特點(diǎn)：1.特異性2.比例性3.可逆性帶現(xiàn)象：Ag與Ab比例不適而不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。前帶（prozone）抗體過(guò)量時(shí)；后帶（postzone）抗原過(guò)量時(shí)。沉淀反應(yīng)的抗原可以是多糖、類脂、蛋白質(zhì)或它們的結(jié)合物等。與相應(yīng)的抗體相比，抗原的分子量小，單位體積內(nèi)所含抗原量多，具有較大的反應(yīng)面積。因此，在作定量沉淀試驗(yàn)時(shí)，為了不使抗原過(guò)剩而生成不可見(jiàn)的可溶性復(fù)合物，通常應(yīng)稀釋抗原。每一對(duì)應(yīng)抗原和抗體可出現(xiàn)一條沉淀線，出現(xiàn)沉淀帶的抗體最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價(jià)。參與沉淀試驗(yàn)的抗原稱沉淀原，抗體稱為沉淀素。三、應(yīng)用：沉淀試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于病原微生物的診斷（雞馬立克氏病、法氏囊病、炭疽桿菌抗原），各種免疫血清效價(jià)和毒素、抗毒素的測(cè)定。四、材料：（1）耗材：平皿、試管、槍頭；（2）試劑：瓊脂粉、8.5%高滲鹽水、待檢血清、法氏囊抗原；（3）儀器：高壓鍋、打孔器、移液器、濕盒、恒溫箱。五、實(shí)驗(yàn)方法：瓊脂板的制備：1克瓊脂粉溶于100ml8.5%高滲鹽水，高壓滅菌，待溫度降至55oC左右時(shí)，無(wú)菌操作下傾注于平皿中，制成厚約2mm左右的瓊脂板。打孔：在瓊脂板上打梅花孔，孔徑為2mm,中間空和周圍孔間的距離大約為3mm.加樣：將待檢血清作倍比稀釋，即1：2、1：4、1：8、1：16，分別加至周圍孔中，中間加抗原（法氏囊抗原）。作用：將瓊脂板放置濕盒中，在37oC恒溫箱中作用24h.結(jié)果觀察：抗原抗體在凝膠為擴(kuò)散，在兩孔之間比例最適合的位置出現(xiàn)沉淀帶，出現(xiàn)沉淀帶的抗體最大稀釋倍數(shù)即抗體效價(jià)。四、注意事項(xiàng)：打孔加樣時(shí)，不要將瓊脂劃破，以免影響沉淀線的形成。孔間距要相等。實(shí)驗(yàn)三免疫血清（多克隆抗體）的制備一、目的要求：加深對(duì)抗體基本知識(shí)的了解。掌握多克隆抗體的制備及純化的基本方法。熟練運(yùn)用檢測(cè)抗體效價(jià)的方法。二、原理當(dāng)將抗原注射入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，一系列抗體生成細(xì)胞會(huì)不同程度的與抗原結(jié)合，受抗原刺激后在血液中產(chǎn)生不同類型的抗體，這種由一種抗原刺激產(chǎn)生的抗體稱為多克隆抗體。多克隆抗體中不同的抗體分子可以以不同的親和能力與抗原分子表面不同的部分一抗原決定簇相結(jié)合。將抗原導(dǎo)入敏感動(dòng)物體內(nèi)后，可刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)，尤其是淋巴結(jié)和脾臟中的淋巴細(xì)胞大量增殖。如圖所示，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)初次免疫和二次免疫的應(yīng)答有明顯的不同。通常初次免疫應(yīng)答往往比較弱，尤其是針對(duì)于易代謝，可溶性的抗原。首次注射后大約7天，在血清中可以觀察到抗體但抗體的濃度維持在一個(gè)較低的水平，在大約10天左右抗體的滴度會(huì)達(dá)到最大值。但同種抗原注射而產(chǎn)生的二次免疫應(yīng)答的結(jié)果明顯不同，和初次免疫應(yīng)答相比抗體的合成速度明顯增加并且保留時(shí)間也長(zhǎng)。免疫應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)結(jié)果取決于抗原和免疫動(dòng)物的種類，但初次和再次免疫應(yīng)答之間的關(guān)系是免疫應(yīng)答的一個(gè)重要特點(diǎn)。三次或以后的抗原注射所產(chǎn)生的應(yīng)答和再次應(yīng)答結(jié)果相似:抗體的滴度明顯增加并且血清中抗體的種類和性質(zhì)發(fā)生了改變，這種改變被稱為免疫應(yīng)答的成熟，具有重要的實(shí)際意義。通常在抗原注射4-6周后會(huì)產(chǎn)生具有高親和力的抗體。三、應(yīng)用在臨床上，多克隆抗體可用于緊急治療。在實(shí)驗(yàn)室，多克隆抗體可用于蛋白質(zhì)的分離與鑒定，還可用于病原體的蛋白質(zhì)組學(xué)診斷。四、材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供免疫用的動(dòng)物主要是哺乳動(dòng)物和禽類，常選擇家兔、綿羊、山羊、馬、騾和豚鼠及小鼠等。動(dòng)物的選擇常根據(jù)抗體的用途和量來(lái)決定，也與抗原的性質(zhì)有關(guān)。如要獲得大量的抗體，多采用大動(dòng)物；如要是獲得直接標(biāo)記診斷的抗體，則直接采用本動(dòng)物；如要獲得間接的標(biāo)記診斷用抗體，則必須用異源動(dòng)物制備抗體；如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以采用純系小鼠制備；一般實(shí)驗(yàn)室采用的抗體，多用兔和綿羊制備。免疫用的動(dòng)物應(yīng)選擇適齡的健康雄性動(dòng)物，雌性動(dòng)物特別是妊娠動(dòng)物用于制備免疫抗體則非常不合適，有時(shí)甚至不產(chǎn)生抗體。由于對(duì)免疫應(yīng)答的個(gè)別差異，免疫時(shí)應(yīng)同時(shí)選用數(shù)只動(dòng)物進(jìn)行免疫。本實(shí)驗(yàn)用成年健康遠(yuǎn)交系公兔。實(shí)驗(yàn)器材家兔保定臺(tái)；刀片；25G針頭；1ml注射器；20ml血液收集管；藥匙；離心機(jī)以及塑料離心管；加樣器及加樣管；燒杯。實(shí)驗(yàn)試劑⑴抗原；乙醇；20mM磷酸緩沖溶液pH7.2。⑵福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑：福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑的成分成分完全佐劑不完全佐劑石蠟油6份++無(wú)水羊毛脂4份++殺死的分枝桿菌3-5mg+-磷酸緩沖溶液10份++（福氏完全佐劑的制備：使用前在福氏不完全佐劑中加入適量殺死的分枝桿菌）4.乳化將抗原與佐劑混合的過(guò)程稱為乳化。乳化的方法很多，可采用研缽乳化；可直接在旋渦振蕩器上乳化；可用組織搗碎器乳化。少量時(shí)，特別是福氏佐劑與抗原乳化時(shí)，常采用注射器乳化，用兩個(gè)注射器，一個(gè)吸入抗原液，一個(gè)吸入佐劑，兩注射器頭以膠管連接，注意一定扎緊，然后來(lái)回抽吸。當(dāng)大量乳化時(shí)，可采用膠體磨進(jìn)行。五、實(shí)驗(yàn)方法抗原的制備抗原制備的主要目的在于使被免疫動(dòng)物能夠產(chǎn)生最強(qiáng)、最適當(dāng)?shù)目贵w。由于純化的抗原適合產(chǎn)生抗體，因此在注射前通常采用一些經(jīng)典的方法，比如柱層析、分級(jí)萃取、凝膠電泳等進(jìn)行抗原的分離和純化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中為清晰可見(jiàn)的單一條帶，將該條帶連同周圍的凝膠一塊切下，用適當(dāng)緩沖液浸泡，使該多肽從凝膠中解離出來(lái)（此步稱為洗脫），即可制得純化的抗原。對(duì)于從臨床病例中分離到的病原體，在國(guó)家法律許可的前提下，可直接與完全弗氏佐劑按一定比例混合，制成疫苗類似物。用此免疫動(dòng)物也可獲得高效價(jià)的多克隆抗體。預(yù)放血輕輕的將兔子放在特制兔盒中，處于放松狀態(tài)的兔子采血會(huì)較容易。按壓兔子耳根部直至血管突出，然后將針頭插入耳部血管的中上部，觀察到進(jìn)針后小心推出活塞收集血液1ml-5ml。結(jié)束收集后，退出針頭并按壓傷處以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C恒溫箱中放置30分鐘以防止激活補(bǔ)體系統(tǒng)，再將試管在4°C放置過(guò)夜使血液凝固。用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4°C，10,000g離心10分鐘，收集上清液在4°C保存。注射抗原⑴準(zhǔn)備兩只成年兔，將100院抗原/兔溶入1ml磷酸緩沖溶液中待用。在1ml福氏不完全佐劑中加入分枝桿菌制成完全佐劑，并加入1ml抗原溶液，劇烈震蕩使之充分乳化，用3ml注射器抽取該乳化液，接上25G針頭，排除注射器中的氣泡。從籠中取出兔子放在平坦處，在4個(gè)不同的部位進(jìn)行皮下注射，兩處在后背，兩處在大腿處。撫去注射處的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮膚。捏出皮膚，將針頭以相對(duì)皮膚15度的角度進(jìn)針，進(jìn)針深度為1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4個(gè)不同部位分別各注射約500pl抗原溶液。注射結(jié)束后，將針在注射處放置幾秒鐘后再輕輕拔出，并用乙醇在注射處消毒。在4個(gè)部位重復(fù)上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步驟2收集血液。將收集的血液與注射前收集的血液進(jìn)行比較，檢查是否有抗體產(chǎn)生。待確定產(chǎn)生抗體后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。收集血液⑴將家兔輕輕放入固定架上，二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片傾斜45°在該處切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在結(jié)束之前出現(xiàn)凝固可用溫水輕擦切口處，再繼續(xù)收集。收集適量血液后可用消毒后的紗布輕擦患處，輕按患處10秒-20秒確定血流停止后方可結(jié)束。⑵將血液在37°C恒溫箱中放置30分鐘，再在4°C放置過(guò)夜。用藥匙將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4°C，10,000g離心10分鐘，收集上清液即為抗血清，可在-20°C保存數(shù)年。六、結(jié)果若用顆粒性抗原免疫動(dòng)物，則用試管凝集法檢測(cè)抗體效價(jià)。若用可溶性抗原免疫動(dòng)物，則用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)。七、注意事項(xiàng)乳化一定要徹底（乳化好的標(biāo)志是取一滴乳化劑滴入水中呈現(xiàn)球形而不分散。如出現(xiàn)平展擴(kuò)散即為未乳化好。乳化過(guò)的物質(zhì)放置一段時(shí)間（在保存期內(nèi)）出現(xiàn)油水分層也是未乳化好的表現(xiàn)。）根據(jù)抗原的性質(zhì)和動(dòng)物的免疫應(yīng)答狀態(tài)來(lái)決定免疫途徑、免疫次數(shù)和間隔時(shí)間等。細(xì)菌和異種動(dòng)物細(xì)胞可直接用于免疫動(dòng)物。再次注射（即強(qiáng)化免疫）時(shí)應(yīng)減慢注射速度，以免動(dòng)物出現(xiàn)超敏反應(yīng)而死亡。在制備抗原、免疫動(dòng)物和收集血液等過(guò)程中，必須嚴(yán)格無(wú)菌操作。八、自助實(shí)驗(yàn)（是由學(xué)生自己組織并自行實(shí)施的必做實(shí)驗(yàn)）通過(guò)上述方法所制備的免疫血清只有在鑒定與純化后才能用于免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，其目的是為了確定免疫血清中特異性抗體的含量，即抗體效價(jià)。常用微量滴定板法進(jìn)行抗體效價(jià)的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小鼠，其它試劑與材料參見(jiàn)溶血空斑實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)四免疫細(xì)胞分離與計(jì)數(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誇icoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的技術(shù)與細(xì)胞計(jì)數(shù)法。掌握脾細(xì)胞的分離與計(jì)數(shù)方法。二、實(shí)驗(yàn)原理外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralmononuclearcells,PMBC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其中T細(xì)胞約占50-70%，B細(xì)胞約占10-15%，單核細(xì)胞約占10-25%，還有部分NK細(xì)胞和其他細(xì)胞。常規(guī)的促分裂原誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖試驗(yàn)和特異性抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖試驗(yàn)可直接用PMBC作為靶細(xì)胞，其中混雜的單核細(xì)胞可作為抗原遞呈細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞增殖。對(duì)于要求較高純度T細(xì)胞的試驗(yàn)，可以從PMBC中再純化T細(xì)胞。因此，分離和獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞（PMBC）是檢測(cè)T細(xì)胞免疫功能的基礎(chǔ)。目前常用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法直接分離PMBC。用來(lái)分離人和動(dòng)物外周血PMBC的分離液的比重是1.077±0.001kg/L的聚蔗糖（Ficoll）一泛影酸葡甲胺（Urografin）（F/H）分離液。當(dāng)將抗凝血疊加在淋巴細(xì)胞分離液表面水平離心后，由于紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、血漿等的比重不同，會(huì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象，即在離心管中出現(xiàn)5層：最上層是血漿（內(nèi)含血小板），血漿層和淋巴細(xì)胞分離液層之間是PMBC，淋巴細(xì)胞分離液層和最下面的紅細(xì)胞層之間是粒細(xì)胞層，又稱為棕黃層。吸取血漿與淋巴細(xì)胞分離液層之間的白色細(xì)胞，即為所需的PMBC。*—稀禪的謎液2pOOi7iniH

20niin分離液稀釋的皿案撾燃確—單個(gè)核細(xì)施曲細(xì)胞紅細(xì)胞三、*—稀禪的謎液2pOOi7iniH

20niin分離液稀釋的皿案撾燃確—單個(gè)核細(xì)施曲細(xì)胞紅細(xì)胞比重為1.077±0.001kg/L的淋巴細(xì)胞分離液；無(wú)菌Hank’s液（4°C冰箱保存，臨用時(shí)將PH值調(diào)至7.3—7.6）；1%臺(tái)盼藍(lán)染液；檸檬酸鈉抗凝劑；含10%犢牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液；其它：無(wú)菌注射器、碘酒、酒精、無(wú)菌試管、無(wú)菌吸管、無(wú)菌槍頭、血球計(jì)數(shù)板、微量移液器、顯微鏡、計(jì)數(shù)器、水平離心機(jī)等。四、操作步驟在一15mL無(wú)菌離心管中加入適量的檸檬酸鈉溶液，采集雞靜脈血，迅速輕柔混勻;取1mL抗凝血與等體積的無(wú)菌Hank’s液混勻；再取一無(wú)菌試管，加入1mL淋巴細(xì)胞分離液；然后將2mL稀釋的血液沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液液面上；將試管置于水平離心機(jī)中，2000rpm，離心20min；用毛細(xì)吸管輕輕插到上層（血漿層）與中間層（分層液）之間的乳白色渾濁的PMBC層，吸取PMBC，然后移入另一試管中；加入5倍體積以上的Hank’s液，輕輕混勻，1500rpm，離心15min，吸棄上清液。重復(fù)洗滌細(xì)胞2次；末次離心后，棄上清，加入1mL含10%犢牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞；取一滴細(xì)胞懸液與一滴1%臺(tái)盼藍(lán)染液混勻，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)；PMBC細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/mL細(xì)胞懸液）=（4個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)/4）x104x2（稀釋倍數(shù)）細(xì)胞活力檢測(cè)：死細(xì)胞可被染成藍(lán)色、體積略膨大，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞百分率，正常情況下，活細(xì)胞百分率應(yīng)在95%以上人活細(xì)胞百分率％=（活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）x100%五、注意事項(xiàng)采血時(shí)應(yīng)注意無(wú)菌操作，試驗(yàn)中所用材料、試劑均應(yīng)無(wú)菌；將稀釋的血液疊加于分層液上時(shí)，應(yīng)細(xì)心，動(dòng)作輕柔，避免沖散分層液與分層液混合，進(jìn)而影響分離效果；吸取PMBC時(shí)，應(yīng)避免吸出過(guò)多上清液分層液而導(dǎo)致血小板污染；試驗(yàn)中所用的溶液均要求等滲，具有緩沖作用，并對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性；配置好的細(xì)胞可置于0-4。C暫時(shí)保存；整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)盡可能在短時(shí)間內(nèi)完成，減少死細(xì)胞數(shù)。六、自助實(shí)驗(yàn)（是由學(xué)生自己組織并自行實(shí)施的必做實(shí)驗(yàn)）小鼠脾細(xì)胞的分離與計(jì)數(shù)：現(xiàn)將小鼠實(shí)施安樂(lè)死，并對(duì)其體表進(jìn)行徹底消毒，在左側(cè)季肋部將腹壁切開(kāi)，暴露脾臟，切斷脾系膜，迅速將脾放入盛有RPMI1640培養(yǎng)基的平皿中，將脾臟的兩端各剪斷2mm，用注射器抽吸平皿中的培養(yǎng)基，再將針頭刺入脾臟的實(shí)質(zhì)內(nèi)，輕推注射器活塞，使培養(yǎng)基進(jìn)入脾臟內(nèi)，于是在高壓下，脾內(nèi)的淋巴細(xì)胞被沖出，反復(fù)幾次，直至脾臟的顏色顯著變淺。收集平皿中的培養(yǎng)基，按上述方法進(jìn)行淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小鼠，其它試劑與材料同上。實(shí)驗(yàn)五免疫細(xì)胞的活力測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆粘Ｓ玫募?xì)胞活性測(cè)定方法二、實(shí)驗(yàn)原理：在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞樣本中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色技術(shù)測(cè)定免疫細(xì)胞的活力，因?yàn)檎＝】档募?xì)胞具有完整的細(xì)胞膜而能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，不著色；而臺(tái)盼藍(lán)卻能擴(kuò)散到細(xì)胞膜完整性喪失而死亡的細(xì)胞中，使其著色。借助細(xì)胞對(duì)染料臺(tái)盼藍(lán)的排斥作用可以測(cè)定細(xì)胞群體中活細(xì)胞的數(shù)目。三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑：1、細(xì)胞總數(shù)已知的細(xì)胞懸液2、1%臺(tái)盼藍(lán)染液3、其它：無(wú)菌試管、無(wú)菌吸管、無(wú)菌槍頭、血球計(jì)數(shù)板、微量移液器、顯微鏡、計(jì)數(shù)右器^等。四、實(shí)驗(yàn)方法：1、取0.5ml已計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液加入無(wú)菌試管中。2、加入1%臺(tái)盼藍(lán)染液0.5ml，染色2?3min。3、吸取一滴染色后懸液涂于血球計(jì)數(shù)板上。4、于顯微鏡下計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)的死細(xì)胞數(shù)（著染為藍(lán)色）。5、計(jì)數(shù)出的死細(xì)胞數(shù)，按下式計(jì)算出細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（細(xì)胞總數(shù)-死亡數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)X100%五、備注：1、死細(xì)胞能被臺(tái)盼藍(lán)染色，鏡下可見(jiàn)深藍(lán)色膨脹細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無(wú)色透明狀。2、計(jì)數(shù)時(shí)要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種方法一、試驗(yàn)?zāi)康模菏煜げ⒄莆諏?shí)驗(yàn)動(dòng)物的疫苗接種途徑與方法二、試驗(yàn)原理：接種疫苗的目的是激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答并形成免疫記憶，從而使動(dòng)物免遭感染的危害。疫苗種類：根據(jù)傳統(tǒng)與習(xí)慣，疫苗可分為減毒活疫苗、滅活疫苗、抗毒素、亞單位疫苗、載體疫苗、核酸疫苗等。接種途徑的確定應(yīng)根據(jù)疫苗種類、畜禽日齡及免疫目的而定，主要有以下幾種途徑：氣霧法、注射法（肌肉、皮下、皮內(nèi)、靜脈、腹腔內(nèi)）、飲水法、點(diǎn)眼、滴鼻法、灌胃法等。一般活苗采用飲水、噴霧、滴鼻、點(diǎn)眼、注射免疫，滅活苗則需肌肉或皮下注射。三、實(shí)驗(yàn)材料：1ml注射器、生理鹽水、滴管、灌胃器、每?jī)扇艘恢恍∈笏?、?shí)驗(yàn)方法：注射法（肌肉、皮下、皮內(nèi)、靜脈、腹腔內(nèi)）、點(diǎn)眼、滴鼻法、灌胃法。注射接種方法（1）皮下注射接種（多點(diǎn)注射法）皮下注射接種是將藥液推入皮下結(jié)締組織，經(jīng)毛細(xì)血管、淋巴管吸收進(jìn)入血液循環(huán)的過(guò)程。作皮下注射常選項(xiàng)背或大腿內(nèi)側(cè)的皮膚。操作時(shí)，常規(guī)消毒注射部位皮膚，然后將皮膚提起，注射針頭取一鈍角角度刺入皮下，把針頭輕輕向左右擺動(dòng)，易擺動(dòng)則表示已刺入皮下，再輕輕抽吸，如無(wú)回血，可緩慢地將藥物注入皮下。拔針時(shí)左手拇、食指捏住進(jìn)針部位片刻，以防止藥物外漏。注射量約為0.1-0.3ml/10g體重。（2）皮內(nèi)注射接種（多點(diǎn)注射法）是將藥液注入皮膚的表皮和真皮之間，觀察皮膚血管的通透性變化或皮內(nèi)反應(yīng)，接種、過(guò)敏實(shí)驗(yàn)等一般作皮內(nèi)注射。先將注射部位的被毛剪掉，局部常規(guī)消毒，左手拇指和食指按住皮膚使之繃緊，在兩指之間，用結(jié)核菌素注射器連接4.5針頭穿刺，針頭進(jìn)入皮膚淺層，再向上挑起并梢刺入，將藥液注入皮內(nèi)。注射后皮膚出現(xiàn)一白色小皮丘，而皮膚上的毛孔極為明顯。注射量為0.1ml/次。（3）肌肉注射接種（多點(diǎn)注射法）小鼠體積小，肌肉少，很少采用肌肉注射。當(dāng)給小鼠注射不溶于水而混懸于油或其他溶劑中的藥物時(shí)，采用肌肉注射。操作時(shí)1人保定小鼠，另一人用左手抓住小鼠的1條后肢，右手拿注射器。將注射器與半腱肌呈90。角迅速插入1/4,注入藥液.用藥量不超過(guò)0.1ml/10g體重.（4）靜脈注射接種將小鼠放在金屬籠或鼠夾中，通過(guò)金屬籠或鼠夾的孔拉出尾巴，用左手抓住小鼠尾巴中部.小鼠的尾部有2條動(dòng)脈和3條靜脈,2條動(dòng)脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面,3條靜脈呈品字型分布，一般采用左右兩惻的靜脈.拔去沿尾部靜脈走向的毛，置尾巴于45-50°C溫水中浸泡幾分鐘或用75%酒精棉球反復(fù)擦拭尾部,以達(dá)到消毒和使尾部血管擴(kuò)張及軟化表皮角質(zhì)的目的.行尾部靜脈注射時(shí)，以左手拇指和食指捏住鼠尾兩惻，使靜脈更為充盈,用中指從下面托起尾巴，以無(wú)名指夾住尾巴的末梢，右手持4號(hào)針頭注射器，使針頭與靜脈平行（小于30°角），從尾巴的下1/4處進(jìn)針，開(kāi)始注入藥物時(shí)應(yīng)緩慢，仔細(xì)觀察，如果無(wú)阻力，無(wú)白色皮丘出現(xiàn)，說(shuō)明已刺入血管，可正式注入藥物.有的實(shí)驗(yàn)需連日反復(fù)尾靜脈注射接種，注射部位應(yīng)盡可能從尾端開(kāi)始,按次序向尾根部移動(dòng)，更換血管位置注射接種。注射量為0.05-0.1ml/10g體重。拔出針頭后，用拇指按住注射部位輕壓1-2min，防止出血。應(yīng)當(dāng)注意，此途徑因繞過(guò)淋巴結(jié)，故不利于細(xì)胞免疫的建立。腹腔注射左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，鼠頭略低于尾部，右手持注射器將針頭在下腹部靠近腹白線的兩惻進(jìn)行穿刺，針頭刺入皮膚后進(jìn)針3nm左右，接著使注射針頭與皮膚呈45°角刺入腹肌，穿過(guò)腹肌進(jìn)入腹膜腔，當(dāng)針尖穿過(guò)腹肌進(jìn)入腹膜腔后抵抗感消失。固定針頭，保持針尖不動(dòng)，回抽針?biāo)?，如無(wú)回血、腸液和尿液后即可注射藥液。注射量為0.1-0.2ml/10g體重。滴鼻接種左手保定住小鼠，右手用滴管吸取疫苗，對(duì)準(zhǔn)鼻孔滴入1-2滴疫苗。待完全吸入后方能松手，吸入不準(zhǔn)的要重滴。點(diǎn)眼接種法左手保定住小鼠，右手用滴管吸取疫苗，對(duì)準(zhǔn)眼睛滴入1-2滴疫苗。待完全吸入后方能松手，吸入不準(zhǔn)的要重滴。灌胃法小鼠專用灌胃針由注射器和喂管組成，喂管長(zhǎng)約1nm，喂管尖端焊有一金屬小圓球，金屬球中空，用途是防止喂管插入時(shí)造成損傷。金屬球彎成20度角，以適應(yīng)口腔與食道之間彎曲。將喂管插頭緊緊連接在注射器的接口上，吸入定量的藥液；左手捉住小鼠，右手拿起準(zhǔn)備好的注射器。將喂管針頭尖端放進(jìn)小鼠口腔，壓迫鼠頭部，使口腔與食管成一直線。輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)針頭以刺激鼠的吞咽，將針頭順咽后壁輕輕插入食管下段，如遇阻力，可輕輕上下滑動(dòng)，不能強(qiáng)行插入。一旦感覺(jué)阻力突然消失有落空感時(shí)，輕抽注射器，如無(wú)氣泡抽出，則表明針頭已進(jìn)入胃。如此時(shí)動(dòng)物安靜，呼吸無(wú)異常，可將藥液注入。若動(dòng)物出現(xiàn)劇烈掙扎，進(jìn)針阻力很大或動(dòng)物呼吸困難，則可能是插入氣管內(nèi)，此時(shí)必須立即退出重插。操作時(shí)動(dòng)作輕柔以防損傷食管及膈肌。一般灌胃針頭插入長(zhǎng)度小鼠為2.5cm-3.5cm。用中指與拇指捏住針筒，食指按著針竿的頭慢慢往下壓，即可將注射器忠的藥液灌入小鼠的胃中。五、注意事項(xiàng)注意安全，避免被動(dòng)物咬傷。注射器要避免重復(fù)使用，注射部位的消毒要徹底。實(shí)驗(yàn)七淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)匹1=1一、目的要求：實(shí)驗(yàn)七淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)匹1=1掌握淋巴增殖試驗(yàn)的原理與用途；熟悉淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)常用的技術(shù)方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)又稱淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（Lymphocyteproliferation/transformationtest）,是指淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，受到特異性抗原或非特異性促有絲分裂原如植物血凝素（PHA）或刀豆蛋白A（ConA）刺激后，可出現(xiàn)蛋白質(zhì)及核酸合成增加，細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)增加，出現(xiàn)空泡，核仁明顯，染色質(zhì)疏松，并能進(jìn)行分裂的淋巴母細(xì)胞，此稱為淋巴細(xì)胞增殖或淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其增殖能力或轉(zhuǎn)化率的高低，可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)常用的方法有形態(tài)學(xué)方法、3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入法，MTT比色以及熒光染料流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法等，可根據(jù)不同的試驗(yàn)條件及試驗(yàn)?zāi)康?，選擇不同的試驗(yàn)方法。本試驗(yàn)?zāi)康氖切螒B(tài)學(xué)方法，觀察小鼠血液中的T淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)加入促有絲分裂原ConA（刀豆蛋白A）刺激后，可轉(zhuǎn)化為體積較大的淋巴母細(xì)胞，胞漿增多而深染，核增大并可見(jiàn)核仁，把細(xì)胞制成涂片，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞轉(zhuǎn)化的典型形態(tài)。為什么只考慮T淋巴細(xì)胞而不考慮B淋巴細(xì)胞？因?yàn)椋捍儆薪z分裂原小鼠T細(xì)胞小鼠B細(xì)胞ConA/PHA+也就是說(shuō)，ConA/PHA能刺激T細(xì)胞增殖，而不能刺激B細(xì)胞，而其他細(xì)胞如中性粒細(xì)胞在培養(yǎng)72h后，絕大部分衰變或死亡成碎片。三、應(yīng)用：該實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞免疫學(xué)功能檢測(cè)的一項(xiàng)基本技術(shù)，即可在臨床上作為測(cè)定機(jī)體細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)之一，也可用于免疫藥理學(xué)的研究，T細(xì)胞功能檢測(cè)（新藥開(kāi)發(fā)，疫苗研制）。四、實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物：清潔級(jí)小鼠20只/班；試劑：肝素抗凝劑，RPMI-1640完全細(xì)胞培養(yǎng)基，NH4cl（8.5g/L）,甲醇，吉姆薩-瑞士染液，ConA；耗材：無(wú)菌青霉素小瓶，離心管，吸管，載玻片；儀器：離心機(jī)，水浴鍋，CO2培養(yǎng)箱，顯微鏡。五、試驗(yàn)方法：先向無(wú)菌的1.5ml離心管中加入肝素抗凝劑50gl；取清潔級(jí)小鼠，75%酒精消毒（吸水紙吸干），在無(wú)菌操作臺(tái)中用酒精棉球?qū)⑿∈笱矍蛑車?，無(wú)菌條件下摘取眼球采血，滴入盛有抗凝劑的離心管中；去無(wú)菌肝素抗凝血0.3ml加入盛有2.7mlRPMI-1640培養(yǎng)液的無(wú)菌青霉素小瓶中，同時(shí)加入ConA（5pg/ml）0.05ml,對(duì)照組不加ConA;將細(xì)胞置37°C,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，每天搖動(dòng)1次；培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物搖勻并移入離心管中，1500r/minx10min;棄上清，用4ml氯化銨液在室溫下溶解紅血球，約10min,1700r/minx10min，棄上清；取沉淀細(xì)胞推片，火焰固定，滴數(shù)滴瑞氏-吉姆薩染液入玻片蓋滿標(biāo)本，4min，再加入2-3滴PBS倍染1-3min，傾去染液，蒸餾水洗，上油鏡觀察。六、油鏡觀察結(jié)果：轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞體積增大，直徑約20-30gm，形態(tài)不整齊，常有小突起，核變大，有核仁1-2個(gè)，胞漿增多，常出現(xiàn)胞漿空泡。未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞直徑一般為6-8gm,核染色致密，一般無(wú)核仁。油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，按下式計(jì)算轉(zhuǎn)化率。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=(轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)『200)X100%七、注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)中須嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止污染。實(shí)驗(yàn)八酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)一、目的要求熟悉酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理及用途；掌握生物素-親和素系統(tǒng)ELISA法的原理和操作方法。二、原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。生物素-親和素系統(tǒng)ELISA(BA-ELISA)法是結(jié)合生物素(Biotin)與親和素(Avidin)間的高度放大作用，建立的一種檢測(cè)系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，可以和生物素分子親密結(jié)合；生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價(jià)鍵結(jié)合。首先將抗原(或抗體)結(jié)合到聚苯乙烯微量反映板孔中并保持其免疫活性；然后加入待檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)，使其與聚苯乙烯微量反映板孔中的抗原或抗體起反應(yīng)；再加入生物素和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特技性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級(jí)放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時(shí)的催化作用而呈色，達(dá)到檢測(cè)未知抗原(或抗體)分子的目的。三、應(yīng)用：ELISA法可以檢測(cè)體液中微量的特異性抗體或抗原，故廣泛用于動(dòng)物傳染病的診斷、獸醫(yī)藥理學(xué)試驗(yàn)、食品衛(wèi)生檢驗(yàn)和各種細(xì)胞蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)。四、材料：試劑：動(dòng)物干擾素(IFN-y)ELISA試劑盒1個(gè)/班；儀器：酶標(biāo)儀，移液器；耗材：槍頭，酶標(biāo)板。五、操作步驟(用于檢測(cè)未知抗原的BA-ELISA)：包被抗體：配制包被緩沖液：取出包被緩沖液原液，用去離子水將其10倍稀釋(0.4ml:3.6ml)；稀釋抗體(CaptureAb):用包被緩沖液稀釋抗體(卻l:4ml)；在每個(gè)聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加100叫，用封板膜封板，放入濕盒中4°C過(guò)夜(18-24h)；洗板：次日，棄取孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液(每孔200gl)洗1次，每次2min；封閉：(1)配液(Assaydiluent):用去離子水5倍稀釋Assaydiluent:5xAssaydiluent:去離子水=1:4=4ml:16ml每孔加200gl，室溫孵育10min；洗板：同2；加樣：(1)配標(biāo)準(zhǔn)樣：分別配成2000pg/ml,1000pg/ml,500pg/ml,250pg/ml,125pg/ml,62.5pg/ml,31.25pg/ml,15.625pg/ml;在第一豎排的孔中加入100|il/well配好的標(biāo)準(zhǔn)樣，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；加待測(cè)樣：加入待測(cè)樣品100|il/well(未知抗原)于反應(yīng)孔中，同時(shí)作空白孔。用封板膜封板，放入濕盒中37。0孵育10min,洗板；加生物素：稀釋DetectionAb:DetectionAb:AssayDiluent=1gl:1ml=4gl:4ml加于每孔100|il，用封板膜封板，放入濕盒中37^孵育10min，洗板；加A-HRP:稀釋Avidin-HRP(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素)：Avidin-HRP：AssayDiluent=16gl:4ml加于每孔100gl，用封板膜封板，放入濕盒中37^孵育10min，洗板；底物顯色：于上述各反應(yīng)孔中加入TMB底物應(yīng)用液(Substrate)100gl，室溫孵育10min;終止反應(yīng)：加2MH2SO450gl/well以終止反應(yīng)；10結(jié)果測(cè)定：450nm酶標(biāo)儀提前30min預(yù)熱，讀出OD值，分析數(shù)據(jù)。六、注意事項(xiàng)；加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不要濺出，不可產(chǎn)生氣泡。每次加標(biāo)本應(yīng)更換槍頭，以免發(fā)生交叉污染。在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，為把非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)，充分的洗滌和浸泡是必要的。實(shí)驗(yàn)九腹腔巨噬細(xì)胞收集與吞噬試驗(yàn)一、目的要求掌握分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的操作方法；掌握巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定的原理；掌握巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫的重要組成細(xì)胞，同時(shí)又是一類主要的抗原提呈細(xì)胞，在特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用：巨噬細(xì)胞能有效的吞噬和清除病原微生物；巨噬細(xì)胞能夠有效的加工和處理抗原，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答；巨噬細(xì)胞能夠介導(dǎo)并促進(jìn)炎癥反應(yīng)；巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤和病毒感染細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺傷功能。因此，巨噬細(xì)胞的分離和檢測(cè)對(duì)于了解機(jī)體的免疫功能狀態(tài)具有重要意義。小鼠是分離巨噬細(xì)胞最常用的材料來(lái)源。由于直接收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的數(shù)量較少，因此通常先于小鼠腹腔內(nèi)注射刺激劑(如6%可溶性淀粉肉湯、石蠟油、蛋白豚、血清或甘油等)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞滲出、聚集，然后收集腹腔滲出液中的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞具有吞噬較大顆粒性異物的特性。如將雞紅細(xì)胞注入小鼠腹腔，腹腔巨噬細(xì)胞將會(huì)吞噬雞紅細(xì)胞，并進(jìn)一步將其消化。取小鼠腹腔液涂片，染色，在顯微鏡下可見(jiàn)雞紅細(xì)胞被吞噬的現(xiàn)象。計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)，可判斷巨噬細(xì)胞的吞噬功能。同時(shí)，通過(guò)觀察紅細(xì)胞被消化的程度，可以判斷巨噬細(xì)胞的消化能力。本試驗(yàn)采用小鼠腹腔內(nèi)注入雞紅細(xì)胞法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。三、應(yīng)用該方法可廣泛用于獸藥的篩選與臨床治療效果評(píng)價(jià)。四、材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)小鼠20只/班，雞1只；試劑：阿氏液，生理鹽水，牛肉膏，蛋白豚，氯化鈉，磷酸氫二鉀，蒸餾水，0.1mol/L氫氧化鈉，可溶性淀粉，75%酒精棉球，生理鹽水，甲醇，瑞氏-吉姆薩染液，PBS，瑞氏染粉，吉姆薩染粉，甘油；儀器：冰箱，離心機(jī)，顯微鏡；耗材：離心管，吸管，濾紙，眼科鑷子、剪子、載玻片。五、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備雞紅細(xì)胞按1：5比例保存于阿氏保養(yǎng)液中，置4oC冰箱可保存一個(gè)月。臨用前，將雞紅細(xì)胞懸液用生理鹽水洗滌3次，2000r/min,離心5min，棄上清，按壓積比用生理鹽水配成1%雞紅細(xì)胞懸液。肉湯培養(yǎng)液：(1)按以下劑量稱取各種試劑(先稱取鹽類再稱蛋白胴及牛肉膏)，置于燒杯中。牛肉膏0.5g蛋白豚1g氯化鈉0.5g磷酸氫二鉀0.1g蒸餾水100ml將上述成分混合加熱溶解后，以0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整酸堿度至pH7.4-7.60將pH測(cè)定后的肉湯培養(yǎng)基用濾紙過(guò)濾。可溶性淀粉肉湯取可溶性淀粉6g加入肉湯培養(yǎng)液100ml中，混勻后煮沸滅菌備用。瑞氏一姬姆薩染色方法原料：A：瑞氏染色劑0.8-1克；吉姆薩染色劑0.5克B：甘油33mlC：甲醇500ml配法：將A放入研缽中，加入少量B研磨，再加入少量B研磨，靜置5min,倒出液體，將未溶部分繼續(xù)加入B研磨，直至染色劑全部溶解，再加入C研磨均勻，或中間加入C，并徹底研磨均勻，靜置后倒入深棕色瓶?jī)?nèi)保存。六、實(shí)驗(yàn)方法試驗(yàn)前三天，于小鼠腹腔注射6%可溶性淀粉肉湯，每只2ml。注意針尖勿傷及內(nèi)臟。試驗(yàn)時(shí)，于小鼠腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸液每只1-2ml,并輕揉腹部。注射后30min,于小鼠腹腔注射生理鹽水每只5ml,并輕揉腹部數(shù)次（10min），使腹腔內(nèi)液體與細(xì)胞充分混合。用頸椎脫臼法處死小鼠，用注射器吸出小鼠腹腔液，注于離心管中，1500r/min離心10min,棄上清。結(jié)果觀察：（1）取細(xì)胞懸液一滴滴于潔凈載玻片上，推成薄片或涂片，火焰固定，滴數(shù)滴瑞氏-吉姆薩染液入玻片蓋滿標(biāo)本，1min，再加入PBS倍染1-3min，傾去染液，蒸餾水洗，用油鏡觀察。（2）取細(xì)胞懸液一滴滴于潔凈載玻片上，推成薄片或涂片，火焰固定，滴數(shù)滴臺(tái)盼藍(lán)染液入玻片蓋滿標(biāo)本，5min，再加入PBS倍染30s，傾去染液，用40倍物鏡觀察。七、結(jié)果判斷：鏡下可見(jiàn)巨噬細(xì)胞核呈藍(lán)色，被吞噬的雞紅細(xì)胞呈橢圓形，核呈藍(lán)色，而胞漿被染成紅色。鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，記錄吞噬有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)和被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)，分別計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬率（%）=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞總數(shù)/100（巨噬細(xì)胞）X100%吞噬指數(shù)的計(jì)算公式：吞噬指數(shù)=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞總數(shù)/100（巨噬細(xì)胞）實(shí)驗(yàn)十溶血空斑試驗(yàn)一、目的掌握溶血空斑試驗(yàn)的原理和用途熟悉溶血空斑試驗(yàn)的操作方法二、原理溶血空斑試驗(yàn)是體外檢測(cè)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的一種方法，其原理是用綿羊紅細(xì)胞（SRBC）免疫小鼠，取此小鼠脾臟制成脾細(xì)胞懸液（含抗體形成細(xì)胞），與一定量的SRBC混合后加入瓊脂凝膠中，于37。0作用下，抗體形成細(xì)胞釋放出抗SRBC抗體（即溶血素），在補(bǔ)體的參與下，能使抗體形成細(xì)胞周圍的SRBC溶解，從而在每一個(gè)抗體形成細(xì)胞周圍，形成肉眼可見(jiàn)的溶血空斑，每個(gè)空斑均代表一個(gè)抗體形成細(xì)胞，空斑的大小表示抗體形成細(xì)胞產(chǎn)生抗體的多少，空斑的數(shù)量反映抗體產(chǎn)生能力的強(qiáng)弱。三、應(yīng)用由于溶血空斑試驗(yàn)具有特異性高、篩選力強(qiáng)、可直接觀察等優(yōu)點(diǎn)，故可用于判定免疫功能的指標(biāo)，觀察免疫應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)變化，并可進(jìn)行抗體種類及亞類的研究。在獸醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，該方法可用于獸藥篩選、療效分析與疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)。四、材料與試劑耗材：平皿、吸管、刻度離心管、注射器、錐形瓶、剪子、鑷子、血球計(jì)數(shù)板，200目不銹鋼網(wǎng)，1ml注射器；儀器：溫箱、水浴鍋、離心機(jī)、顯微鏡、高壓鍋、冰箱；動(dòng)物：清潔級(jí)小鼠20只/班,綿羊1只；豚鼠2只。試劑：生理鹽水，PBS，磷酸氫二鈉（NaHPO4-12H2O）,磷酸二氫鉀（KH2PO4）,NaCl,蒸餾水，Hanks液，小牛血清，瓊脂，補(bǔ)體。阿氏溶液（Alsever’ssolutionTOC\o"1-5"\h\z葡萄糖2.05克檸檬酸鈉（5H2O）0.8克氯化鈉0.42克檸檬酸0.55克蒸餾水100毫升充分溶解后過(guò)濾，分裝成小瓶，每瓶20ml，高壓蒸汽滅菌15-20分鐘，冷卻后4°0保存?zhèn)溆?。五、?shí)驗(yàn)準(zhǔn)備SRBC懸液取綿羊血，用無(wú)菌生理鹽水洗三次，每次2000r/min離心5min,最后取壓積紅細(xì)胞，懸于滅菌PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2x109個(gè)/ml0.1mol/LpH7.2PBS磷酸氫二鈉（NaHPO4-12H2O）3.71g,磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.43g,NaCl7.2g,溶于1000ml蒸餾水中。底層和頂層瓊脂底層瓊脂：1.4%瓊脂。用PBS配置1.4%的瓊脂糖頂層瓊脂：0.7%瓊脂。用PBS配置1.4%的瓊脂糖補(bǔ)體（即無(wú)菌豚鼠血清）用PBS1：10稀釋六、實(shí)驗(yàn)步驟與方法免疫小鼠取2x109個(gè)/ml的SRBC懸液，五倍稀釋到4x108個(gè)/ml的SRBC懸液，腹腔注射，每只小鼠接種1ml。脾細(xì)胞懸液：免疫4天后的小鼠拉頸處死，取出脾，用Hanks液漂洗一次后，放入含有10%小牛血清Hanks液的平皿中，然后置200目不銹鋼網(wǎng)上，用1ml注射器針芯研磨成單細(xì)胞懸液，用Hanks液洗兩次（在冰浴中進(jìn)行），每次均作離心處理，轉(zhuǎn)速為1500r/min，離心5min，調(diào)整脾細(xì)胞數(shù)為1x107個(gè)/ml。置于4°C冰箱中備用。制備底層瓊脂糖凝膠用PBS配置1.4%的瓊脂糖，加熱溶化，傾倒于平皿中，每皿3.5ml,均勻平鋪，凝固后，4。。冰箱備用。頂層瓊脂制備將0.7%的瓊脂溶化后，置于45恒溫水浴鍋中，每3.5ml0.7%的瓊脂依次加入以下試劑：（1）2x109個(gè)/mlSRBC懸液0.1ml（2）1x107個(gè)/ml脾細(xì)胞懸液0.1ml，（健康組或免疫組）迅速混勻后，傾注到已經(jīng)鋪好底層瓊脂的平皿內(nèi)，每個(gè)平皿3.7ml，使之平鋪凝固后，37C孵育1h。加入補(bǔ)體從溫箱中取出平皿，每皿加入補(bǔ)體（1：10稀釋）1.5ml，使其均勻覆蓋表面，置37C溫箱中孵育30min，觀察結(jié)果。七、結(jié)果空斑大小均勻，邊緣整齊，圓形透明，將平皿對(duì)著光亮處，肉眼即可見(jiàn)到圓形透明區(qū)（空斑），也可在低倍鏡下觀察。空斑計(jì)數(shù)一般以3-5個(gè)平皿上的空斑均數(shù)為該組的空斑數(shù)，然后推算每百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的空斑數(shù)。如每個(gè)平皿加入的細(xì)胞數(shù)為1x106，出現(xiàn)空斑數(shù)為50個(gè)，那么每百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生空斑數(shù)為50個(gè)。分別計(jì)算并比較試驗(yàn)組與對(duì)比組的空斑數(shù)?？瞻咝纬陕实挠?jì)算：空斑形成率=單位面積上的空斑數(shù)/脾細(xì)胞數(shù)八、注意事項(xiàng)將0.7%的瓊脂溶化后，置于45C恒溫水浴鍋中。溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致脾細(xì)胞死亡或溶血，過(guò)低會(huì)發(fā)生凝固。傾倒時(shí)要充分混勻細(xì)胞，但要避免起氣泡。SRBC要新鮮，洗滌不超過(guò)三次，阿氏溶液保存的血液可用一周。實(shí)驗(yàn)十一接觸性超敏反應(yīng)一、目的掌握接觸性超敏反應(yīng)的原理與臨床應(yīng)用；掌握接觸性超敏反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法。二、原理小鼠接觸性超敏反應(yīng)試驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單可靠的體內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞介導(dǎo)免疫功能的方法，在臨床上主要用于免疫調(diào)節(jié)藥物的篩選、療效評(píng)價(jià)、藥物安全性試驗(yàn)以及診斷動(dòng)物細(xì)胞免疫功能是否正常。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理如下：在正常動(dòng)物的表皮內(nèi)分布著郎格罕斯細(xì)胞，表皮細(xì)胞接觸半抗原后，郎格罕斯細(xì)胞的表面分子被半抗原修飾，然后遷移到引流淋巴結(jié)內(nèi)，啟動(dòng)機(jī)體對(duì)半抗原的初次免疫應(yīng)答。若第二次接觸到同一半抗原分子，半抗原修飾郎格罕斯細(xì)胞的表面分子，與郎格罕斯細(xì)胞的MHC-II分子結(jié)合，被提呈給皮膚抗原特異性T細(xì)胞?；罨腃D4+T細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，觸發(fā)接觸性超敏反應(yīng)和耳廓水腫的發(fā)生，據(jù)此，測(cè)量耳廓厚度變化，即可知道機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的狀態(tài)。三、應(yīng)用本方法主要用于動(dòng)物免疫調(diào)節(jié)藥物的療效分析、藥物安全性試驗(yàn)和單克隆抗體檢測(cè)等。四、材料與試劑8-12周齡的清潔級(jí)雌性小鼠每個(gè)班20只，耳廓厚度測(cè)量?jī)x。7%（W/V）TNCB（三硝基氯苯）溶于4：1（V/V）丙酮/橄欖油，1%（W/V）TNCB溶于橄欖油內(nèi)（TNCB:橄欖油為1：9），硫化鈉，半抗原。五、實(shí)驗(yàn)步驟與方法將8克硫化鈉溶于100毫升蒸餾水中，以此溶液涂擦在小鼠腹部皮膚上，數(shù)分鐘后即可去除被毛。將7%TNCB溶液100gl涂抹于小鼠腹部皮膚。固定小鼠3-5秒鐘，使皮膚表面溶劑揮發(fā)。6天后測(cè)量小鼠右耳耳廓厚度基數(shù)，隨即在右耳兩側(cè)表面各滴加1%TNCB溶液10gl