植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的影響

植物細(xì)胞培養(yǎng)條件溫度：培養(yǎng)溫度對植物細(xì)胞生長及二次代謝產(chǎn)物生成有重要影響。通常，植物細(xì)胞培養(yǎng)采用25°C。攪拌：在搖瓶實驗中，通常搖床的轉(zhuǎn)速取90—120r/min。pH值：通過細(xì)胞膜進行的H+離子傳遞對細(xì)胞的生育環(huán)境、生理活性來說無疑是重要的。在培養(yǎng)過程中，通常pH作為一個重要參數(shù)被控制在一定范圍內(nèi)。植物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜pH值一般為5—6。通氣：通氣是細(xì)胞液體深層培養(yǎng)重要的物理化學(xué)因子。好氣培養(yǎng)系統(tǒng)的通氣與混合及攪拌是相互關(guān)聯(lián)的。對搖瓶試驗，通常500m1的三角瓶內(nèi)裝80—200m1的植物細(xì)胞培養(yǎng)液較適宜。當(dāng)然，氣液傳質(zhì)還與瓶塞的材料有關(guān)。試驗表明，從溶氧速率考慮，以棉花塞最好，微孔硅橡膠塞次之，鋁箔塞最差。光：光對植物有著特殊的作用。光照射條件不僅通過光照周期、光的質(zhì)量（即種類、波長）而且通過光照量（光強度）的調(diào)節(jié)來影響植物細(xì)胞的生理特性和培養(yǎng)特性。研究表明，光調(diào)節(jié)著細(xì)胞中的關(guān)鍵酶的活性，有時光能大大促進代謝產(chǎn)物的生成，有時卻起著阻害作用。細(xì)胞齡：在培養(yǎng)過程的不同時期，細(xì)胞的生理狀況、生長與物質(zhì)生產(chǎn)能力差異顯著。而且，使用不同細(xì)胞齡的種細(xì)胞，其后代的生長與物質(zhì)生產(chǎn)狀況也會大不一樣。通常，使用處于對數(shù)生長期后期或穩(wěn)定期前期的細(xì)胞作為接種細(xì)胞較合適。接種量：在植物細(xì)胞培養(yǎng)中，接種量也是一個影響因素。在再次培養(yǎng)中，往往取前次培養(yǎng)液的5—20%作為種液，也以接種細(xì)胞濕重為基準(zhǔn)，其接種濃度為15—50g（濕細(xì)胞）/L。由于接種量對細(xì)胞產(chǎn)率及二次代謝物質(zhì)的生產(chǎn)有一定影響，故應(yīng)根據(jù)不同的培養(yǎng)對象通過試驗，確定其最大接種量。影響植物細(xì)胞培養(yǎng)的因素植物細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成動力學(xué)也可分為三種類型：①生長偶聯(lián)型，產(chǎn)物的合成與細(xì)胞的生長呈正比；②中間型，產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長一段時間后才能合成，但細(xì)胞生長停止時，產(chǎn)物合成也停止；③非生長偶聯(lián)型，產(chǎn)物只有在細(xì)胞生長停止時才能合成。事實上，由于細(xì)胞培養(yǎng)過程較復(fù)雜，細(xì)胞生長和次級代謝物的合成很少符合以上模式，特別是在較大的細(xì)胞群體中，由于各細(xì)胞所處的生理階段不同，細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成也許是群體中部分細(xì)胞代謝的結(jié)果。此外，不同的環(huán)境條件對產(chǎn)物合成的動力學(xué)也有很大的影響。1、細(xì)胞的遺傳特性從理論上講，所有的植物細(xì)胞都可看做是一個有機體，具有構(gòu)成一個完整植物的全部遺傳信息。在生化特征上，單個細(xì)胞也具有產(chǎn)生其親本所能產(chǎn)生的次生代謝物的遺傳基礎(chǔ)和生理功能。但是，這一概念決不能與個別植株的組織部位相混淆，因為某些組織部位所具有的高含量的次生代謝物并不一定就是該部位合成的，而有可能是在其他部位合成后通過運輸在該部位上積累的。有的植物在某一部位合成了某一產(chǎn)物的直接前體而轉(zhuǎn)運到另一部位，通過該部位上的酶或其他因子轉(zhuǎn)化。如尼古丁是在煙草根部細(xì)胞內(nèi)合成后輸送到葉部細(xì)胞內(nèi)的，另外有些次生物在植物某一部位形成中間體，然后再轉(zhuǎn)移另一部位經(jīng)酶轉(zhuǎn)化而成。因此，在進行植物細(xì)胞的培養(yǎng)時，必須弄清楚產(chǎn)物的合成部位。同時，在注意到整體植物的遺傳性時，還必須考慮到各種不同的細(xì)胞。細(xì)胞種質(zhì)影響2、培養(yǎng)環(huán)境由于各類代謝產(chǎn)物是在代謝過程的不同階段產(chǎn)生的，因此通過植物細(xì)胞培養(yǎng)進行次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)所受的限制因子是比較復(fù)雜的。各種影響代謝過程的因素都可能對它們發(fā)生影響，這些因素主要有光、溫度、攪拌、通氣、營養(yǎng)、pH值、前體和調(diào)節(jié)因子等。溫度植物細(xì)胞培養(yǎng)通常是在25°C左右進行的，因此一般來說在進行植物細(xì)胞培養(yǎng)時很少考慮溫度對培養(yǎng)影響。但是實際上，無論是細(xì)胞培養(yǎng)物的生長或是次生代謝物的合成和積累，溫度都是起著一定的作用，需要引起一定的重視。pH值植物細(xì)胞培養(yǎng)的最適pH值一般在5?6。但由于在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的pH值可能有很大的變化，對培養(yǎng)物的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累十分不利，因此需要不斷調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值，以滿足細(xì)胞的生長和產(chǎn)物代謝、積累的需要。營養(yǎng)成分盡管植物細(xì)胞能在簡單的合成培養(yǎng)基生長，但營養(yǎng)成分對植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝產(chǎn)物的生成仍有很大的影響。營養(yǎng)成分一方面要滿足植物細(xì)胞的生生長所需，另一方面要使每個細(xì)胞都能合成和積累次生代謝產(chǎn)物。普通的培養(yǎng)基主要是為了促進細(xì)胞生長而設(shè)計的，它對次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生并不一定最合適。一般地說增加氮、磷和鉀的含量會使細(xì)胞的生長加快，增加培養(yǎng)基中的蔗糖含量可以增加細(xì)胞培養(yǎng)物的次生代謝物。光光照時間的長短、光的強度對次生代謝產(chǎn)物的合成都具有一定的作用。一般來說愈傷組織和細(xì)胞生長不需要光照，但是光對細(xì)胞代謝產(chǎn)物的合成有很重要的影響。有人研究了光對黃酮化合物形成的影響，結(jié)果表明，培養(yǎng)物在光照特別是紫外光下黃酮及黃酮類醇糖苷積累的所有酶活性均增加。通常光照采用熒光燈，或者熒光燈和白熾燈混合，其光強度是300?100001x(6?100〃m/m2程)可以連續(xù)光照，也可以每天光照12?18h。攪拌和通氣植物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中需要通入無菌空氣，適當(dāng)控制攪拌程度和通氣量。在懸浮培養(yǎng)中更要如此。在煙草細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，如果KaW5h-1。，對生物產(chǎn)量有明顯抑制作用。當(dāng)仲5?1g，初始的*和生物產(chǎn)量之間有線性關(guān)系。當(dāng)然不同的細(xì)胞系，對氧的需求量是不相同的。為了加強氣-液-固之間的傳質(zhì)，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時，需要攪動。植物細(xì)胞雖然有較硬的細(xì)胞壁，但是細(xì)胞壁很脆，對攪拌的剪切力很敏感，在搖瓶培養(yǎng)時，搖瓶機振蕩范圍在100?150r/min。由于搖瓶培養(yǎng)細(xì)胞受到剪切比較小，因此植物細(xì)胞很適合在此環(huán)境生長。實驗室中采用六平葉渦輪攪拌槳反應(yīng)器培養(yǎng)植物細(xì)胞，由于剪切太劇烈，細(xì)胞會自溶，次生代謝產(chǎn)物合成會降低。各種植物細(xì)胞耐剪切的能力不盡相同，細(xì)胞越老遭受的破壞也越大。煙草的細(xì)胞和長春花的細(xì)胞在渦輪攪拌器轉(zhuǎn)速150r/min和300r/min時，一般還能保持生長。培養(yǎng)雞眼藤的細(xì)胞時，渦輪攪拌器的轉(zhuǎn)速應(yīng)低于20r/min。因此培養(yǎng)植物細(xì)胞，氣升式反應(yīng)器更為合適。前體在植物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，有時培養(yǎng)細(xì)胞不能很理想地把所需的代謝產(chǎn)物按所想像的得率進行合成，其中一個可能的原因就是缺少合成這種代謝物所必須的前體，此時如在培養(yǎng)物中加入外源前體將會使目的產(chǎn)物產(chǎn)量增加。因此，在植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，選擇適當(dāng)?shù)那绑w是相當(dāng)重要的。對于所選擇的前體除了有增加產(chǎn)物產(chǎn)量的外，還要求是無毒和廉價。但是，尋找能使目的產(chǎn)物含量增加最有效的前體是有一定難度的。雖然前體的作用在植物細(xì)胞培養(yǎng)中未完全清楚，可能是外源前體激發(fā)了細(xì)胞中特定酶的作用，促使次生代謝產(chǎn)物量的增加。有人在三角葉薯蕷細(xì)胞培養(yǎng)液中加人100mg/L膽甾醇，可使次生代謝產(chǎn)物薯蕷皂甙配基產(chǎn)量增加一倍。在紫草細(xì)胞培養(yǎng)中加入L-苯丙氨酸使右旋紫草素產(chǎn)量增加三倍。在雷公藤細(xì)胞培養(yǎng)中加入萜烯類化合物中的一個中間體，可使雷公藤羥內(nèi)酯產(chǎn)量增加三倍以上。但同樣一種前體，在細(xì)胞的不同生長時期加入，對細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物合成的作用極不相同，有時甚至還起抑制作用。如在洋紫蘇細(xì)胞的培養(yǎng)中，一開始就加入色胺，無論對細(xì)胞生長和生物堿的合成都起抑制作用，但在培養(yǎng)的第二星期或第三星期加入色胺卻能刺激細(xì)胞的生長和生物堿的合成。生長調(diào)節(jié)劑在細(xì)胞生長過程中生長調(diào)節(jié)劑的種類和數(shù)量對次生代謝產(chǎn)物的合成起著十分重要的作用。植物生長調(diào)節(jié)劑不僅會影響到細(xì)胞的生長和分化，而且也會影響到次生代謝產(chǎn)物的合成。生長素和細(xì)胞分裂素有使細(xì)胞分裂保持一致的作用，不同類型的生長素對次生代謝產(chǎn)物的合成有著不同的影響。生長調(diào)節(jié)劑對次級代謝的影響隨著代謝產(chǎn)物的種類的不同而有很大的變化，對生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用需要非常慎重。目前，在大規(guī)模植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，為了提高生物量和次生代謝產(chǎn)物量，一般采用二階段法。第一階段盡可能快地使細(xì)胞量增長，可通過生長培養(yǎng)基來完成。第二階段是誘發(fā)和保持次生代謝旺盛，可通過生產(chǎn)培養(yǎng)基來調(diào)節(jié)。因此在細(xì)胞培養(yǎng)整個過程中，要更換含有不同品種和濃度的植物生長激素和前體的液體培養(yǎng)基。為了獲得能適合大規(guī)模懸浮培養(yǎng)和生長快速的細(xì)胞系，首先要對細(xì)胞進行馴化和篩選，把愈傷組織轉(zhuǎn)移到搖瓶中進行液體培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖后，再把它們轉(zhuǎn)移到瓊脂培養(yǎng)基上。經(jīng)過反復(fù)多次馴化篩選得到的細(xì)胞株，比未經(jīng)過馴化、篩選的原始愈傷組織在懸浮培養(yǎng)中生長快得多。毋庸置疑，在過去幾十年中，植物生物技術(shù)方面已取得了相當(dāng)巨大的進展，大大縮短了向工業(yè)化邁進的距離。國內(nèi)有關(guān)單位對藥用植物，人參、三七、紫草、黃連、薯蕷、蘆筍等已展開了大規(guī)模的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，并對植物細(xì)胞培養(yǎng)專用反應(yīng)器進行研制。國外，培養(yǎng)植物細(xì)胞用的反應(yīng)器已從實驗規(guī)模1?30L，放大到工業(yè)性試驗規(guī)模130?20000L，如希臘毛地黃轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)規(guī)模為2m3,煙草細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模最大已達到20m3。值得注意的是影響植物細(xì)胞培養(yǎng)物的生物量增長和次生代謝產(chǎn)物積累的因素是錯綜復(fù)雜的，往往一個因素的調(diào)整會影響到其他因素的變化，所以，需要在培養(yǎng)過程中不斷加以調(diào)整，同時，由于不同的植物有機體有自身的特殊性。因此，對于一種植物或一種次生代謝物適合的培養(yǎng)條件，不一定對其他的細(xì)胞或次生代謝作用適合。植物細(xì)胞培養(yǎng)是指在離體條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞的方法。將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，進行振蕩培養(yǎng)，使組織分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，獲得大量的細(xì)胞群體。小規(guī)模的懸浮培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中進行，大規(guī)模者可利用發(fā)酵罐生產(chǎn)。.利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物具有十分廣闊的前景。.植物細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化目前植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的化合物很多，包括糖類、酚類、脂類、蛋白質(zhì)、核酸以及帖類和生物堿等初生和次生代謝產(chǎn)物，植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用主要包括以下3個方面：有用物質(zhì)（次生代謝產(chǎn)物）的生產(chǎn)；植物無性系的快速繁殖和遺傳突變體的篩選；植物細(xì)胞遺傳、生理、生化和病毒方面的深入研究。但是由于植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的局限性使得植物細(xì)胞仍難以實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，迫切需要進一步研究和發(fā)展細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化控制及其工藝。1植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化1.1植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中物理因素的優(yōu)化控制對于植物細(xì)胞培養(yǎng)來說，環(huán)境中的許多物理因素對細(xì)胞的生長以及目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的合成具有很大的影響。如通過溫度、光照、電場、磁場電磁輻射、機械力以及超聲波等對于植物細(xì)胞培養(yǎng)過程都有著十分重要的作用。植物細(xì)胞的生長、繁殖和次生代謝物的生產(chǎn)需要一定的溫度條件，在一定的溫度范圍內(nèi)細(xì)胞才能正常生長、繁殖和維持正常的新陳代謝，植物細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度一般為25r，但不同的植物種類略有差異，而且植物細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物的合成所需的溫度并不一致，因此選擇合理的培養(yǎng)溫度并進行相應(yīng)的調(diào)控對于細(xì)胞生長以及產(chǎn)物合成十分關(guān)鍵1.2植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中化學(xué)因素的優(yōu)化控制植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的一些化學(xué)因素如培養(yǎng)基組成、溶氧、其它添加物等對于細(xì)胞的生長也具有十分重要的意義。合理的培養(yǎng)基組分、適當(dāng)?shù)娜苎跻约捌渌T導(dǎo)子及其前體等物質(zhì)的有效調(diào)控能夠在很大程度上促進細(xì)胞的生長以及次生代謝物的合成。培養(yǎng)基中的碳源、氮源及其一些微量的金屬離子以及一些有機物質(zhì)不僅是細(xì)胞生長以及合成的物質(zhì)基礎(chǔ)，而且很多都能夠促進細(xì)胞生長或者是有利于產(chǎn)物的形成。植物細(xì)胞培養(yǎng)通常使用蔗糖作為碳源，研究表明，一定濃度的蔗糖不僅能夠促進植物細(xì)胞的生長，還能夠刺激次生物質(zhì)的合成，2植物細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)模型的研究進展利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物，已發(fā)展成植物細(xì)胞培養(yǎng)在生產(chǎn)運用中的主流之一。目前全世界約有四分之三的人以植物作為預(yù)防疾病的藥物來源。因葡萄球菌、大腸桿菌、結(jié)核桿菌等都表現(xiàn)出對由微生物來源的各種抗生素的耐藥性，人們對抗生素類藥的局限性已有了深刻的認(rèn)識。植物產(chǎn)生的藥物在微生物中很少發(fā)現(xiàn)，而且植物產(chǎn)生的藥能克服微生物來源藥物的諸多不足，而化學(xué)合成藥物的難度又遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了從植物中獲得天然產(chǎn)物。然而由于藥用植物的過度采伐，其資源日趨貧乏，同時對環(huán)境也造成了極大的破壞，因此為了解決植物資源短缺、環(huán)境保護等問題，藥用植物細(xì)胞的大量培養(yǎng)顯得十分重要。目前國內(nèi)外在藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)方面的研究取得了很大進展，特別是運用生物反應(yīng)器進行藥用植物細(xì)胞大量培養(yǎng)的技術(shù)正日趨成熟。在植物細(xì)胞放大培養(yǎng)的過程中最關(guān)鍵的問題是建立對培養(yǎng)過程中各種現(xiàn)象進行合理描述的模型，為細(xì)胞的大量培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外在植物細(xì)胞培養(yǎng)過程動力學(xué)模型的研究方面取得了很大的進展。植物細(xì)胞培養(yǎng)始于20世紀(jì)初，運用生物反應(yīng)器對植物細(xì)胞進行大量培養(yǎng)的報道最初始于1960年，Tuleche和Nickel運用134L的生物反應(yīng)器成功培養(yǎng)了不同種類的植物。但由于植物細(xì)胞固有的性質(zhì)代謝途徑和代謝產(chǎn)物與細(xì)胞生長關(guān)系的復(fù)雜性，細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境相互作用，使得對植物細(xì)胞的放大培養(yǎng)變得難以實現(xiàn)，只有針對不同的植物細(xì)胞，采用相應(yīng)的簡化策略建立細(xì)胞培養(yǎng)模型，逐級模擬和優(yōu)化培養(yǎng)過程才能夠最終實現(xiàn)細(xì)胞的大量培養(yǎng)。現(xiàn)分別就近幾年關(guān)于植物細(xì)胞培養(yǎng)過程的動力學(xué)模型的研究進展進行歸納。2.1植物細(xì)胞培養(yǎng)非結(jié)構(gòu)化動力學(xué)模型最初植物細(xì)胞培養(yǎng)的數(shù)學(xué)模型的建立是在細(xì)菌等微生物培養(yǎng)過程動力學(xué)模型的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。在傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵過程中通常都是以一個簡單的生物量組分來進行模型化，因此都是非結(jié)構(gòu)化的，如Monod模型、Nyholm模型及其Leudeking-piret模型等，這些類型的模型通常都只能夠考慮一些單組分的變化情況，而不能夠考慮到植物細(xì)胞組分的多樣性和細(xì)胞在培養(yǎng)過程及其代謝過程中變化的復(fù)雜性，如次生代謝產(chǎn)物的生成和細(xì)胞生長以及細(xì)胞在代謝過程中其它中間物質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化的復(fù)雜關(guān)系等。因此這類模型不能夠預(yù)測植物細(xì)胞