溶解氧控制對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的影響

溶解氧控制對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的影響劉劍;徐達(dá)【摘要】在50L的生物反應(yīng)器中，通過(guò)控制溶解氧水平為5%、10%、20%、30%四個(gè)水平考察枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的影響，發(fā)現(xiàn)該菌株生長(zhǎng)的溶解氧濃度在10%-20%。并通過(guò)發(fā)酵過(guò)程中菌株的生長(zhǎng)情況、菌體攝氧率和發(fā)酵產(chǎn)苷進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果表明，在發(fā)酵過(guò)程中DO水平控制在10%~20%時(shí)腺苷積累量高，發(fā)酵液中DO水平為5%和30%均不利于發(fā)酵液中的腺苷積累。通過(guò)對(duì)發(fā)酵終點(diǎn)丙酮酸的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌在低溶氧狀態(tài)下比高溶氧狀態(tài)下積累更多的丙酮酸。在此基礎(chǔ)上，提出兩階段DO控制策略，最終腺苷積累量達(dá)到20.1g/L。%TheeffectofoxygensupplyonadenosineproductionofBacillussubtiliswasstudiedusing50Lfermen-torwiththeairsaturationat5%,10%,20%and30%.Wefoundthattheconcentrationofthecriticaldissolvedoxy-genintheindustrialstrainswas10%-20%.Therelationshipamongstraingrowths,oxygenuptakerateintheprocessanddissolvedoxygen(DO)tensiononadenosineaccumulationwasanalyzed.TheresultsshowedthatduringtheadenosinefermentationofBacillussubtilis,itwasbettertocontrolDOat10%-20%thanat5%and30%.Wefoundthattheconcentrationofpyruvateatthefinaltimeoffermentationwashigherunderlowoxygenconditionthanthatunderhighoxygencondition.Basedontheresults,astrategyoftwostagesforDOmanipulationwasproposed.Withthisstrategy,theadenosineaccumulatedin50Lfermentorultimatelyreached20.lg/L.【期刊名稱】《食品與發(fā)酵工業(yè)》【年(卷)，期】2012(038)007【總頁(yè)數(shù)】4頁(yè)(P86-89)【關(guān)鍵詞】枯草芽孢桿菌;發(fā)酵;腺苷;溶解氧【作者】劉劍;徐達(dá)【作者單位】廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東肇慶526060;廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東肇慶526060【正文語(yǔ)種】中文［中圖分類】TQ929腺苷(Adenosine)又稱腺嘌呤核苷，具有促進(jìn)冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張及心肌代謝的機(jī)能，擴(kuò)張血管，增加冠血量的藥理作用，可用于治療冠狀血管障礙、狹心癥、動(dòng)脈硬化癥及高血壓癥等疾病，具有廣泛的藥用價(jià)值。此外，腺苷是合成阿糖腺苷、腺苷酸(AMP)、三磷酸腺苷(ATP)的主要原料，是一種重要的醫(yī)藥原料［1-2］。從1968年小西真八［3］利用枯草桿菌的異亮氨酸缺陷型發(fā)酵法生產(chǎn)鳥(niǎo)苷后，發(fā)酵法是生產(chǎn)腺苷主要的方法，常用的菌種是枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌屬于好氧微生物，對(duì)氧的需求量較高，但其在不同溶氧條件下仍具有不同的生理特性，因此溶氧濃度作為有氧控制的一個(gè)關(guān)鍵因素，直接影響腺苷的生產(chǎn)水平［4］。通常而言，在生產(chǎn)嘌呤核苷產(chǎn)物時(shí)需要大風(fēng)量，以保證發(fā)酵液中高的溶氧(DO)和低的CO2分布，但是，細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成都存在一個(gè)最適DO值，較低的DO值會(huì)限制細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝物合成，較高的DO也可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成產(chǎn)生不利作用。因此，通過(guò)控制發(fā)酵液中的DO水平，同時(shí)監(jiān)測(cè)分析發(fā)酵進(jìn)氣、排氣中的O2、CO2含量，可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)代謝的變化情況［5-8］。根據(jù)張嗣良教授的多尺度微生物過(guò)程優(yōu)化理論［9］的發(fā)酵過(guò)程參數(shù)相關(guān)分析原理，通過(guò)控制50L的生物反應(yīng)器中發(fā)酵液DO值在5%、10%、20%、30%四個(gè)不同水平，研究了不同溶解氧水平對(duì)菌體代謝活力及腺苷發(fā)酵產(chǎn)苷的影響，為腺苷工業(yè)生產(chǎn)提供理論枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)M-090，遺傳標(biāo)記為:黃嘌呤缺陷型(Xan-),8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤抗性，星湖生物科技股份有限公司腺苷生產(chǎn)菌株。葡萄糖10，酵母膏10，蛋白腺5，玉米漿5,尿素2,NaCl2.5;pH7.0~7.2。葡萄糖120，酵母膏10，酵母粉8，玉米漿5,K2HPO42,MgSO44,(NH4)2SO420,Ca2CO320(分消);pH7.0~7.2。取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面，30°C恒溫靜置培養(yǎng)20~24h。250mL錐形瓶中培養(yǎng)基裝量20mL,34C,100r/min，培養(yǎng)12h。發(fā)酵液裝量35L,接種量8%,37C，通氣攪拌培養(yǎng)。定時(shí)測(cè)定和記錄腺苷含量、DO值、OUR等參數(shù)。WatersHPLC,AgilentZorbaxSB-Aqcolumn(150mmx4.6mm,5pm)oMettlerToledod在線溶氧檢測(cè)系統(tǒng)。分別用順磁氧分析儀(Magnos4G,德國(guó)H&B公司生產(chǎn))與不分光紅外儀(Uras3G，德國(guó)H&B公司生產(chǎn))在線測(cè)定。吸取樣品0.2mL,用2mol/LHCl溶液稀釋20倍，搖勻后測(cè)定600nm下的吸光度。WatersHPLC,AgilentZorbaxSB-Aqcolumn(150mmx4.6mm,5pm)流動(dòng)相0.001mol/LH3PO4，流速0.6mL/min，柱溫35C,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。所有試劑均為色譜純。在發(fā)酵過(guò)程中，隨著菌體代謝的加劇，OUR逐漸上升，造成DO不斷下降，當(dāng)DO與OUR反向變化時(shí)，表明工程水平的供氧對(duì)發(fā)酵不是限制因素。從腺苷發(fā)酵過(guò)程O(píng)UR和DO變化曲線圖(圖1)可以看出，發(fā)酵進(jìn)行到8h，DO跌至10%左右，此時(shí)OUR形成第1個(gè)峰值后轉(zhuǎn)而下降，DO與OUR出現(xiàn)順?lè)瀣F(xiàn)象，表明此時(shí)DO已低于滿足菌體呼吸要求的最低濃度，菌體代謝受到抑制［10］。從曲線初步判斷氧濃度在20%以下在一定程度上影響了菌體細(xì)胞的呼吸(OUR)，因此我們把當(dāng)DO降到20%以下時(shí)的DO值作為腺苷發(fā)酵過(guò)程中的臨界氧濃度。發(fā)酵過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)受到不同的DO控制水平的影響如圖2(a)所示，DO控制在10%和20%的菌體濃度在29左右，而DO控制5%的菌體濃度比DO控制在10%和20%的菌體濃度降低15%左右，說(shuō)明在限制氧濃度下，菌體生長(zhǎng)明顯受到抑制。發(fā)酵DO控制在30%菌體濃度在36h略高于DO控制在10%和20%的菌體濃度，而36h后菌體濃度比DO控制在10%和20%的菌體濃度高出10%左右。不同的DO控制水平對(duì)腺苷積累量的影響如圖2(b),在限制氧濃度下(DO在5%左右)，發(fā)酵28h后，腺苷產(chǎn)物積累量基本不增加，僅為10.83g/L。DO控制在10%和20%腺苷產(chǎn)率分別達(dá)18.25g/L和19.079兒發(fā)酵DO控制在30%，雖然前期產(chǎn)物積累較快，但后期增長(zhǎng)緩慢，最終產(chǎn)物量為16.87g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DO控制適當(dāng)水平(在10%-20%)，發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)物積累呈穩(wěn)定增加的趨勢(shì)，發(fā)酵液中產(chǎn)苷水平最高。而溶氧水平控制太低，則影響菌體生長(zhǎng)，菌體活力下降，代謝緩慢，產(chǎn)量下降。而溶氧控制過(guò)高導(dǎo)致前期菌體快速生長(zhǎng)，菌體容易衰老，導(dǎo)致產(chǎn)物積累量減少。如圖3所示，在發(fā)酵過(guò)程中分別控制DO在5%、10%、20%、30%等4個(gè)不同的水平檢測(cè)菌體的攝氧率。DO在5%時(shí)，菌體的攝氧率30-40mmol/(L?h)，在發(fā)酵中后期(30h后)，菌體的攝氧率呈下降趨勢(shì)，50h之后菌體的攝氧率已低于20mmol/(L?h);DO在10%-20%，產(chǎn)物積累期的菌體的攝氧率比較平穩(wěn)，基本處于30-40mmol/(L?h);而DO在30%時(shí)，發(fā)酵前期菌體的攝氧率較高，略高于40mmol/(L?h),但在發(fā)酵中后期攝氧率下降幅度加大，與DO在5%時(shí)出現(xiàn)的情況類似。50h之后，菌體的攝氧率已低于20mmol/(L?h)。通過(guò)對(duì)4個(gè)溶氧控制之下，腺苷發(fā)酵過(guò)程攝氧率的比較發(fā)現(xiàn)，5%DO在36h后，30%DO在42h后菌體的攝氧率均低于30mmol/(L?h);而DO在10%和DO在20%時(shí)，54h后攝氧率才低于30mmol/(L?h)水平。由此可見(jiàn)，DO水平控制在10%~20%時(shí)，有利于菌體維持生長(zhǎng)活力，有利于產(chǎn)物積累;DO過(guò)低(5%左右)會(huì)抑制菌體活力，DO過(guò)高(30%左右)，發(fā)酵前期呼吸代謝旺盛，但發(fā)酵后期菌體容易衰老，活力不足，DO過(guò)低和過(guò)高均對(duì)產(chǎn)物積累造成影響。通過(guò)檢測(cè)不同溶氧條件下的丙酮酸積累水平，如圖4所示，結(jié)果反映了在低溶氧控制下(10%~20%)丙酮酸水平比30%溶氧控制下的丙酮酸水平要高，而5%丙酮酸水平較低的原因是菌體生長(zhǎng)受到了抑制。這個(gè)結(jié)果和Wen-BangYu等［10］研究結(jié)果相吻合，他們從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的角度指出，枯草芽孢桿菌在低溶氧條件下能上調(diào)碳代謝途徑上的基因表達(dá)，如葡萄糖代謝、丙酮酸代謝等，從而提高碳代謝的利用率，提高腺苷產(chǎn)量。為了提高整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中腺苷產(chǎn)率，提出兩階段控制的策略。在發(fā)酵前期(0h~24h),控制DO水平在30%~40%;發(fā)酵24h后控制DO在10%~20%。通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程不同階段控制不同的DO水平，來(lái)得到提高腺苷產(chǎn)量的目的。圖5顯示了在50L發(fā)酵罐中采用兩階段DO控制策略，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中菌體的攝氧率變化曲線以及腺苷積累曲線，最終腺苷積累量為20.1g/L。發(fā)酵前期控制較高的DO水平，由于菌體代謝活力的增加，初始產(chǎn)物的積累得到相應(yīng)的提高;發(fā)酵中后期DO控制在10%~20%，菌體攝氧率(OUR)平穩(wěn)，產(chǎn)物代謝途徑正常，腺苷產(chǎn)物的積累穩(wěn)步增長(zhǎng)。對(duì)微生物發(fā)酵來(lái)說(shuō)，溶解氧是發(fā)酵過(guò)程中需要考慮的重要因素，氧的不足會(huì)造成代謝異常，產(chǎn)量降低，而溶氧過(guò)高雖滿足了菌體生長(zhǎng)的需求，但未必能控制菌株經(jīng)濟(jì)利用，達(dá)到提高產(chǎn)量的目的[11-13]。本文通過(guò)控制不同溶氧水平對(duì)腺苷生產(chǎn)菌——枯草芽孢桿菌的研究，表明控制發(fā)酵的溶解氧濃度在10%~20%之間，能控制菌體生長(zhǎng)，菌體的攝氧率平穩(wěn)處于30~40mmol/(L?h)，從而使發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)物積累呈穩(wěn)定增加的趨勢(shì)，達(dá)到較高的水平。通過(guò)檢測(cè)不同溶氧條件下的丙酮酸積累水平，也印證了枯草芽孢桿菌在低溶氧條件下能提高碳代謝的利用率，從而提高腺苷產(chǎn)量。文章通過(guò)兩個(gè)階段控制的策略，在發(fā)酵前期(0h~24h)，控制DO水平在30%~40%，發(fā)酵24h后控制DO在10%~20%，最終腺苷積累量達(dá)到20.1g/L?？莶菅挎邨U菌是一種應(yīng)用非常廣泛的工業(yè)微生物，本文的研究可為枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)其它品種起到參考作用。KeywordsBacillussubtilis,fermentation,adenosine,dissolvedoxygen【相關(guān)文獻(xiàn)】[1]柏建新，張一平，朱曉宏，等.微生物發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2001,27(3):16-20.[2]張克旭，陳寧，張蓓，等.代謝控制發(fā)酵[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998.KonishiS,KubotaK,AokiR,etal.Studiesontheproductionofpurinehucleotides[J].AminoAoidandNucleicAcid,1968,18(15):22-24.KoleMM,DraperI,GersonDF.ProteaseproductionbyBacillussubtilisinoxygen-controlled,glucosefed-batchfermentations[J].ApplMicrobiolBiotechnol,1988,28:404-408.林開(kāi)建，鄭慶建.溶解氧濃度對(duì)多粘菌素發(fā)酵影響的研究[J].化學(xué)工程與設(shè)備，2007(1):47-49.葛飛，黃寅，桂琳.溶解氧對(duì)細(xì)腳擬青霉小試發(fā)酵過(guò)程及胞內(nèi)核苷積累的影響[J].食品工業(yè)科技,2010,31⑺:180~186.張建勇，王曉港，王水蓮，等.溶氧對(duì)重組畢赤酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的影響[J].齊魯藥事，2007,26(7):428-430.PapagianniM.EffectsofdissolvedoxygenandpHlevelsonweissellinAproductionbyWeissellaparamesenteroidesDXinfermentation[J].BioprocessBiosystEng,2012,DOI10.1007.[9]張嗣良，儲(chǔ)炬.多尺度微生物過(guò)程優(yōu)化[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2003:94.YuWen-Bang,GaoShu-Hong,YinChun-Yun,etal.ComparativetranscriptomeanalysisofBacillussubtilisrespondingtodissolvedoxygeninadenosinefermentation[J].PLoSONE,2011,6(5):e20092.DOI10.1371.王恒偉，陳長(zhǎng)華，付水林，等?腺苷發(fā)酵液中有機(jī)酸的代謝規(guī)律[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,30(2):223-226.CalikP,CalikG,OzdamarTH.OxygentransfereffectsinserinealkalineproteasefermentationbyBacilluslicheniformis:useofcitricacidasthecarbonsource[J].EnzymeandMicrobialTechnology,1997,23(7-8):451-461.LiY,HugenholtzJ,ChenJet,al.EnhancementofpyruvateproductionbyTorulopsisglabratausingatwo-stageoxygensupplycontrolstrategy[J].ChemistryandMaterialsScience,2002,60:101-106.ABSTRACTTheeffectofoxygensupplyonadenosineproductionofBacillussubtiliswasstudied