秦川牛的雙肌臀基因敲除

姓名：朱秀生學(xué)號：1418302029專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖蘇太豬功能基因及其設(shè)計實驗應(yīng)用于經(jīng)濟性狀的研究摘要：蘇太豬是我國本地培育的一個優(yōu)良品種，它具有產(chǎn)仔多、生長速度快、瘦肉率高、耐粗飼、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點。本文主要簡單介紹下蘇太豬的經(jīng)濟性狀和基因的關(guān)系然后用一定的分析方法對這些基因的位點進行檢測，為今后的蘇太豬育種提供一定的根據(jù)。關(guān)鍵詞：蘇太豬；PCR-RFLP；屠體和肉質(zhì)性狀；候選基因1.蘇太豬簡介隨著生活水平的提高，人們對豬肉品質(zhì)的要求越來越高，肉色、PH值、系水力、肌肉脂肪和適口性等都是影響豬肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，并且早在1999年就被美國國家豬肉生產(chǎn)委員會認定為“有重要經(jīng)濟價值的肉品性狀”[1]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展尤其是分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，使得人們可以在DNA水平上操控這些性狀的基因，進而采取標(biāo)記選擇輔助的方法達到是肉質(zhì)和肉量同步提高的目的。蘇太豬是江蘇省蘇州市太湖豬育種中心培育而成。1991，培育中心以太湖豬為母本，杜洛克豬為父本進行雜交，得到含有50%太湖豬血統(tǒng)和50%杜洛克豬血統(tǒng)的雜交豬。采用群體繼代選育法，橫交固定，1年1個世代。個世代。至1995年達4個世代，作為一個新品系(D7)通過農(nóng)業(yè)部驗收。1999年3月通過國家畜禽品種資源委員會豬品種專業(yè)委員會審定為新品種，并改名為蘇太豬?！熬盼濉逼陂g被農(nóng)業(yè)部列為重大科技成果推廣項目，2000年度被國家列為“農(nóng)業(yè)科技跨越計劃”的28個推廣項目之一[2]。蘇太豬既保持了太湖豬繁殖力強、肉質(zhì)鮮美等特點，又具備了瘦肉率高、生長速度快等瘦肉型豬的明顯特征。外部特征為耳中等大，垂向下方，頭面有清晰皺紋，嘴中等長而直，部分豬允許有玉鼻，全身被毛黑色偏直。豬肉質(zhì)，生長相關(guān)基因研究進展人類基因組計劃和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，推動了豬基因圖譜的研究進展，使豬的QTL定位研究取得長足的進步，從而為利用分子標(biāo)記進行數(shù)量性狀位點的鑒別和定位奠定了堅實的基礎(chǔ)。目前，對影響豬的數(shù)量性狀的QTL的研究己成為國際上的研究重點，并已取得了一定的成效。對QTLs的分析，有很多種方法，比如分離分析法，基因組掃描法和侯選基因法，其中利用侯選基因法進行豬肉質(zhì)等相關(guān)基因的研究取得了很大的進步。下面就簡單闡述下豬生長、肉質(zhì)相關(guān)基因的研究進展。2.1與生長性狀有關(guān)的基因：IGF1和IGF2在神經(jīng)內(nèi)分泌軸上，生長激素GH主要是通過工GFs系統(tǒng)而發(fā)揮其促生長功能。下面就簡單介紹下IGF1和IGF2的功能。2.1.1.1IGF1的作用GH作為神經(jīng)內(nèi)分泌生長軸的主體激素，它的作用主要是通過工GF1介導(dǎo)的。GH的分泌和血液中IGF1的濃度的密切相關(guān)，也即IGFI成為GH分泌的特異性指示信號，但工GFl的表達量也依賴于GHoIGFI主要與其本身受體即工GF1R結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)功能。IGFl主要在肝臟中合成，并釋放入血液中，通過血循環(huán)到達腎，在腎中降解。其它器官如腎、骨等處也可合成IGFI，通過局部的旁分泌和自分泌促進靶細胞的分化與增重。IGF1的作用機制尚不清楚。一般認為膚類激素是通過細胞膜受體而發(fā)揮其生物學(xué)作用的，但IGF1在胞膜上，而且在細胞內(nèi)的滑面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等結(jié)構(gòu)中也發(fā)現(xiàn)有其特異性的結(jié)合位點[3。IGFl又叫生長介素(SWC)，是由70個氨基酸組成的具有內(nèi)分泌、自分泌及旁分泌特性的單鏈堿性多膚，分子量為7648.7Da。pIGFl基因由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，全長80kb。Winter.A.K.等于1994年通過連鎖分析將豬的IGFI基因定位于第5號染色體的q23-24，并得到了一個線性連鎖圖譜:Sw1071-IFNG-S0015-MHC-IGFl-Sw995-Sw967【4】。豬pIGFI生物學(xué)功能主要包括介導(dǎo)生長激素的促生長作用，促使體脂的合成，乳腺的發(fā)育，卵巢的發(fā)育，以及促進某些性腺分泌性激素等作用。pIGFI與豬的胚胎以及出生后的生長有著密切關(guān)系。IGF1在仔豬初生時含量最高，出生后第1周開始下降，瘦肉型豬血漿中IGF1含量高于脂肪型，斷奶前高于斷奶后。對豬的試驗結(jié)果表明，血漿中IGF1水平與體重及增重呈正相關(guān)，在這方面已經(jīng)闡述得比較清楚。IGF1在不同的豬品種中其濃度也有所差異，生長速率快的豬其血漿中的IGFl濃度也高于生長速率慢的豬。IGF1對豬肌肉的生長也有一定的促進作用，主要是因為GH/IGF1軸作用的主要靶組織是肌肉。給豬注射人或牛的IGF1會使豬的肌肉生長加快，且肌肉中總蛋白和總的IGFI-mRNA豐度上升。Gerrard等發(fā)現(xiàn)，隨著豬日齡的增加，肌肉中IGF1的表達量也增加到出生后的最高水平，但IGF2基因在肌肉中的表達量卻下降(P<0.05)【5】。2.1.1.2IGF1基因的多態(tài)性檢測由于胰島素樣生長因子-1是豬肌肉生長的主效因子，且是生長的候選基因，因此有必要對它進行深入的研究。Casas-Carrill【5】等對6頭公豬與18頭無相關(guān)母豬雜交的群體，分析了與GH和IGFI位點連鎖的染色體區(qū)域?qū)ιL與胭體性狀的影響。發(fā)現(xiàn)在一個公豬家系中IGF1基因型與斷奶后日增重存在連鎖(LOD值為2.3)，斷奶后日增重的假定QTL所在區(qū)間要大于IGF1至Sw1071的范圍。因此需要建立幾個較大的參考群來進行研究，以確定是否為生長的主要候選基因，還是一種遺傳標(biāo)記。方美英等【6】對我國6個地方豬種的基因頻率進行了研究，結(jié)果表明香豬除與桃源豬基因頻率差異不顯著之外，與其它4個豬種(民豬、桃源豬、內(nèi)江豬、姜曲海豬)之間基因頻率差異極顯著((P<0.0l)，而其它4個豬種之間差異均不顯著。王文君等用PCR-RFLP法對南昌白豬(92頭)和大約克夏豬(170頭)的工GF1基因的多態(tài)性進行了研究并分析了不同基因型對個體初生重、2月齡重、4月齡重、6月齡重、料重比、背膘厚和瘦肉率等生產(chǎn)性能的影響。結(jié)果表明，在南昌白豬中，AA(等位基因A為151+28bp,B為116十35+28bp)型豬比AB型仔豬初生重高，差異顯著((P<0.05);在大約克夏豬中，BB型豬比AB型豬的6月齡體重大，差異顯著((P<0.05),AA型豬比AB型和BB型豬瘦肉率低，差異極差著((P<0.01)。周杰等【7】對二花臉豬和大白豬脂肪組織中基因表達量的研究結(jié)果表明豬脂肪組織中GHR,IGFI和IGF2R的基因表達有特定的發(fā)育模式。IGF1基因表達量的品種差異可能正是兩品種豬脂肪沉積規(guī)律不同的主要原因之一。李加琪等【8】對216頭F2代個體的長白X藍塘豬資源群應(yīng)用PCR-RFLP方法檢測了工GF1基因的多態(tài)性，結(jié)果表明IGF1基因不同基因型對斷奶后日增重、骨率、月同體瘦肉量和皮脂率等4個性狀有顯著的遺傳影響。2.1.2.1IGF2基因的作用胰島素樣生長因子2是胰島素一胰島素樣生長因子一釋放生長因子家族的成員之一，與有促進有絲分裂活性作用的胰島素在結(jié)構(gòu)上具有高度同源性。其生物活性受IGF1受體、IGF2受體、胰島素受體、6個IGF結(jié)合蛋白(IGFbindingproteins,IGFBPI-IGFBP6)以及其它激素和營養(yǎng)的調(diào)控。IGF2是生長激素發(fā)揮作用的中間信使，即生長激素首先作用于IGF2，再由IGF2作用于靶器官，進而發(fā)揮促進生長發(fā)育的作用。2.1.2.2IGF2基因的結(jié)構(gòu)特點、定位Nezer【9】最早把IGF2基因定位到乓SC2p上。AnderssonL等第一次利用大白豬和歐洲野公豬以及大白豬和皮特蘭豬雜交建立的參考家系，收集所有F2代個體表型性狀資料，表型性狀包括生長性狀、月同體性狀和肌肉品質(zhì)等，通過250個遺傳標(biāo)記的基因組掃描，鑒定了幾個重要經(jīng)濟性狀的QTL。其中，影響肌肉含量和脂肪沉積的QTL定位在豬2號染色體短臂末端((SS.C2p)。Andersson等分析歐洲野豬與大約克雜交后代的資料，將一個對骨骼肌和心肌重量有中等效應(yīng)的QTL定位于2號染色體，與IGF2基因共線性。deKoning等同樣觀察到了影響肌肉含量和脂肪沉積的印跡QTL存在于SSC2P。AmargerV等研究認為豬IGF2基因全長約23.8kb，包含共4個啟動子、10個外顯子，同時含有5，端和3，端非翻譯序列。IGF2存在著具有時空特異性表達的啟動子。2.1.2.3IGF2基因的多態(tài)性研究IGF2是常染色體上的母源印跡基因，由于在肌纖維形成中起重要作用，所以IGF2被認為是影響瘦肉率和脂肪沉積的主要候選基因。Jeon在研究歐洲野公豬X大白豬參考家系的實驗中發(fā)現(xiàn)豬工GF2微衛(wèi)星位點Swc9具有高度多態(tài)性。通過連鎖分析確定了IGF2內(nèi)含子2中有一個單核營酸多態(tài)(G-A轉(zhuǎn)換)，但這一轉(zhuǎn)換所引起的NciI限制性酶切位點改變的作用未被確證;并且發(fā)現(xiàn)豬IGF2基因的編碼區(qū)域的多態(tài)性不能解釋觀察到的 QTL效應(yīng)。目前己發(fā)現(xiàn)IGF2基因8個內(nèi)含子中有3個(第2,3,8內(nèi)含子)與基因表達調(diào)控有關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)該基因內(nèi)含子突變與肌肉、脂肪的沉積密切相關(guān)。劉桂蘭等采用PCR-RFLP技術(shù)，分析了工GF2基因第8內(nèi)含子部分片段在豬資源家系群體中的NciI酶切片段多態(tài)性分布，發(fā)現(xiàn)IGF2基因該片段的兩個Ncil酶切位點在資源家系中均具有多態(tài)性。IGF2基因B位點酶切未突變個體均比酶切突變的個體背膘薄18.28%(P<0.O1)，肥肉率低22.43%(P<0.O1)，瘦肉率高8.71(P<0.0l)，位點A具有相同的影響趨勢。分子育種方法選育蘇太豬3.1分子標(biāo)記育種方法簡介傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳學(xué)育種方法，雖給家畜育種帶來巨大發(fā)展，但存在周期長、選擇，效應(yīng)小且不穩(wěn)定的缺點，這些缺點延緩了家畜改良的速度。而基于分子遺傳學(xué)和分子數(shù)量遺傳學(xué)的分子育種技術(shù)的興起有可能克服這些缺點而給家畜育種工作帶來一場革命，大大加快育種進度。傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳學(xué)育種技術(shù)是根據(jù)個體及其親屬的表型值通過選擇進行的，它只能有效地利用具有加性效應(yīng)的基因座位，對具有互作和上位效應(yīng)的一些基因座位則無能為力，而分子標(biāo)記技術(shù)則可以利用一切有利的基因座位來改良動物的生產(chǎn)性狀，同時能作到真正的基因型選擇，大大提高了選擇的準(zhǔn)確性和育種效率。分子標(biāo)記育種即通過DNA標(biāo)記技術(shù)對某些重要生產(chǎn)性狀直接進行選擇改良。DNA標(biāo)記技術(shù)分為三大類:一是以分子雜交為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記技術(shù)，包括基因組DNA限制性酶切、電泳分離、Southern轉(zhuǎn)移與異性探針雜交檢測基因組的RFLPs。另一類是以PCR為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記技術(shù)，包括RFLP,RAPD,AFLP,DNA擴增指紋(DNA)、SSCP，SSR，SNP、引物判別PCR(AP-PCR)等。第三類是衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA分析。3..2分子標(biāo)記輔助選擇標(biāo)記輔助選擇是將現(xiàn)代分子生物技術(shù)與常規(guī)育種方法相結(jié)合，借助分子標(biāo)記選擇某一位點來改變該位點的基因頻率的過程，也稱分子輔助選擇。3.3PCR-RFLPs原理及在豬育種中的應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性(RestrictionfragmentlengthpolymorpHisms,RFLPs)標(biāo)記是20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記，屬于第一代分子標(biāo)記，并最早應(yīng)用于人類基因組的研究。和其他分子生物學(xué)技術(shù)手段相結(jié)合，RFLP在動物的遺傳育種上的應(yīng)用日益廣泛。3.3.1RFLPs的原理生物基因組中，DNA分子的堿基序列(除突變外)是穩(wěn)定遺傳的，在個體一生中和上下代傳遞過程中保持不變。DNA限制性酶可以識別并切割DNA特定堿基序列，并生成一定長度的DNA片段。因此，對某一個體或者基因型而言，由限制性內(nèi)切酶切割而成的限制性DNA片段的長度也是固定不變的。突變型由于任何一個堿基的替代、DNA序列的插入或者缺失都影響包含該序列的DNA限制性酶切片段的長度。但在不同的個體或者群體間，酶切片段的長度卻是呈現(xiàn)不同的多態(tài)性。這種多態(tài)性即稱為DNA限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)oRFLP的這種多態(tài)性可以通過電泳和分子雜交技術(shù)而實現(xiàn)。RFLP一般有兩類，一類是堿基替換(也稱點多態(tài)性)，另一類是結(jié)構(gòu)變異型;前者由于識別位點上發(fā)生了單個堿基替換，使原有酶切位點喪失或者獲得新的位點；而后者是由于DNA序列內(nèi)部發(fā)生較大片段的缺失、重復(fù)或者插入以及酶切位點的相對位移引起酶切片段大小發(fā)生了變化，通過對這些變化的檢測，即可以比較不同品種或個體DNA水平的差異，為群體物種的進化以及系統(tǒng)發(fā)育提供信息。目前RFLP研究方法可歸納為兩類:標(biāo)準(zhǔn)RFLP分析法和PCR-RFLP分析法。3.3.2RFLPs方法在豬育種中的應(yīng)用現(xiàn)在己利用分子標(biāo)記定位基因座位，證實了應(yīng)激綜合癥座位是位于第6號染色體的蘭尼定受體基因突變造成。蘭尼定受體結(jié)構(gòu)與功能的改變，導(dǎo)致豬應(yīng)激時骨骼肌鈣離子非常釋放而引起應(yīng)激綜合癥發(fā)生，再用PCR-RFLP法擴增特定片段，進行電泳，根據(jù)酶切片段長度多態(tài)性來判斷應(yīng)激敏感豬與正常豬。李寧等對雌激素受體基因和促卵泡素p亞基基因在二花臉豬雜交群中檢測表明:利用ESR和FSH}受體進行標(biāo)記輔助選擇有可能提高產(chǎn)仔數(shù)，培育仔數(shù)多、生長快、背膘薄的新母系，從而大大地提高養(yǎng)豬的經(jīng)濟效益。隨著分子生物學(xué)、動物遺傳標(biāo)記技術(shù)等的發(fā)展，RFLP標(biāo)記在理論上或者實際應(yīng)用中顯示了一定的局限性，但作為一種遺傳標(biāo)記，RFLP依然提供著有價值的信息資料，如與其它高新技術(shù)相結(jié)合，方能取長補短，提高RFLP的適用性，在動物遺傳育種各個領(lǐng)域的研究會發(fā)揮更大的作用。參考文獻[1]Muell