細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)基本理論一細(xì)胞培養(yǎng)概述細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，將細(xì)胞從機(jī)體中取出，在人工條件下使其生存、生長(zhǎng)、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問題的研究。群體培養(yǎng)（massculture）將大量細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，讓其貼壁或懸浮生長(zhǎng)，形成均勻的單層細(xì)胞或單細(xì)胞懸液。克隆培養(yǎng)（cloneculture）即將少數(shù)的細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，貼壁后彼此間隔距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過繁殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)集落，稱為克隆。組織培養(yǎng)（tissueculture）指把活體的組織取出，分成小塊，直接置于培養(yǎng)瓶底或通過膠原纖維血漿支持物的培養(yǎng)瓶底來進(jìn)行培養(yǎng)。特點(diǎn)：1.，組織不失散，細(xì)胞保持原有的組織關(guān)系。2，形成生長(zhǎng)(cutgrowth)或形成由扁薄細(xì)胞構(gòu)成的單層細(xì)胞培養(yǎng)物。3，在體外生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞間呈相互依存、互相影響的關(guān)系。器官培養(yǎng)（organculture）將活體中器官或器官一部分取出，在體外生長(zhǎng)、生存，并使其保持器官原有的結(jié)構(gòu)和功能特征的培養(yǎng)。特點(diǎn)：1，培養(yǎng)的器官在合適的條件下能生長(zhǎng)和分化，存活數(shù)周或1年。2，觀察受限，只能用組織切片的方法觀察或用透射電鏡、掃描電鏡觀察。細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：.1．活細(xì)胞：同時(shí)、大量、均一性、重復(fù)性；2．可控制：各種物理、化學(xué)、生物等因素可調(diào)控；3．研究方法多樣：倒置、熒光、電子、激光共焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記；4．應(yīng)用廣：不同物種、年齡、組織，正?；虍惓Ｈ秉c(diǎn)：人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同；當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中，時(shí)間久了，必然發(fā)生變化。三細(xì)胞的形態(tài)和類型由不同生長(zhǎng)方式造成的差異呈懸浮生長(zhǎng)時(shí)，因生長(zhǎng)在液體環(huán)境中，胞內(nèi)滲透壓高于周圍液體環(huán)境，因此胞體基本呈圓形。呈貼附于支持物上生長(zhǎng)的細(xì)胞，開始為圓形，很快過渡成扁平形，并逐漸恢復(fù)至原先的細(xì)胞形態(tài).細(xì)胞來源：成纖維型細(xì)胞；上皮型細(xì)胞；其它，不定型細(xì)胞按生長(zhǎng)方式：貼壁型細(xì)胞（Monolayercells）；懸浮型細(xì)胞（Suspensioncells）絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬貼壁型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)。按細(xì)胞形態(tài)(貼壁細(xì)胞）：成纖維型細(xì)胞；上皮型細(xì)胞；其它，不定型貼壁型生長(zhǎng)細(xì)胞或錨著依存性細(xì)胞處于體外培養(yǎng)狀態(tài)下的貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞在形態(tài)上表現(xiàn)單一而失去了在體內(nèi)原有的某些特征。形態(tài)各異反映其胚層起源。如來源于內(nèi)外胚層的細(xì)胞多呈上皮型；來自中胚層的則易呈成纖維細(xì)胞型。分為成纖維型細(xì)胞；皮型細(xì)胞；游走型細(xì)胞；多形型細(xì)胞貼壁型細(xì)胞形態(tài)比較成纖維型細(xì)胞：梭形或不規(guī)則三角形；中央有卵圓形核；胞質(zhì)向外伸出長(zhǎng)短不同的突起；中胚層間質(zhì)起源上皮型細(xì)胞：扁平不規(guī)則多角形；細(xì)胞中央有圓形核；緊密相連單層膜樣生長(zhǎng)；內(nèi)、外胚層細(xì)胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等游走型細(xì)胞：散在生長(zhǎng)，一般不連成片；細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起；活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)；羊水細(xì)胞培養(yǎng)的早期多形細(xì)胞型：難以確定規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)；如神經(jīng)組織的細(xì)胞等四貼壁型細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)：貼附和伸展；接觸抑制；生長(zhǎng)的密度限制接觸抑制（Contactinhibition）：細(xì)胞相互接觸時(shí)，將停止增長(zhǎng)；細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G0期；正常細(xì)胞并不互相重疊生長(zhǎng)，但轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞卻可以繼續(xù)生長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞重疊堆積生長(zhǎng)。生長(zhǎng)的密度限制（DensityInhibition）又稱：密度依賴性調(diào)節(jié)）正常細(xì)胞接觸匯合成單層后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。而轉(zhuǎn)化細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的密度依賴性調(diào)節(jié)常常降低，能生長(zhǎng)至較高的終末細(xì)胞密度。生長(zhǎng)過程單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程——細(xì)胞周期（cellcycle）細(xì)胞系的生長(zhǎng)過程——培養(yǎng)細(xì)胞的生命周期（LifeSpanofCultureCells）每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過程原代培養(yǎng)期與細(xì)胞系原代培養(yǎng)

（primary

culture）從動(dòng)物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。生長(zhǎng)緩慢，繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長(zhǎng)。細(xì)胞株（cell

strain）從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。細(xì)胞系（cell

line）從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖克?。╟lone）亦稱無性繁殖系或無性系。對(duì)細(xì)胞來說，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。傳代培養(yǎng)期（Passage）在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（DiploidCellLine）。細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入衰退期。衰退（老）期（senescence）一般有限細(xì)胞系在此期的細(xì)胞增殖緩慢，并逐漸完全停止，進(jìn)而發(fā)生衰退和死亡。其特點(diǎn)是端粒酶進(jìn)行性縮短，直到最后細(xì)胞不能再進(jìn)一步分裂。例外：生殖細(xì)胞、干細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期分為潛伏期；指數(shù)增生期；停滯期實(shí)驗(yàn)室組成基本要求便于隔離、便于操作、便于滅菌、便于觀察基本需要實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、無菌操作、控制培養(yǎng)基本組成基本實(shí)驗(yàn)室：消毒準(zhǔn)備室、制備室、無菌操作室輔助實(shí)驗(yàn)室：細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室生化分析室攝影室及暗室消毒準(zhǔn)備室配備包括實(shí)驗(yàn)臺(tái)，高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、干熱消毒柜、超聲波清洗器、洗瓶機(jī)等。制備室配備包括低溫冰箱、天平、真空負(fù)壓泵、PH計(jì)、旋轉(zhuǎn)混合儀、水浴箱等?；驹O(shè)施配置基本設(shè)備；滅菌設(shè)備；無菌操作設(shè)備；光溫控制設(shè)備；細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備；細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備滅菌設(shè)備包括蒸汽壓力滅菌鍋；干熱消毒柜；過濾滅菌裝置；噴霧消毒器；紫外燈消毒物理消毒射線、紫外線、干熱、濕熱、濾過化學(xué)消毒來蘇兒、新潔爾滅、過氧乙酸、70%酒精無菌操作設(shè)備原理：內(nèi)設(shè)鼓風(fēng)機(jī)，驅(qū)動(dòng)空氣通過高效濾器過濾，凈化或垂直氣流的狀態(tài)送出，從而形成無菌潔凈工作環(huán)境。分類：垂直流/水平流超凈工作臺(tái)；單邊操作臺(tái)，雙邊操作臺(tái)；普通操作臺(tái)，醫(yī)用（生物）操作臺(tái)。維護(hù)：檢查濾膜，定期清洗，更換?；驹O(shè)施配置之一生物安全柜根據(jù)主要幾項(xiàng)生物安全柜國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，安全柜可分為一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)三大類以滿足不同生物研究和防疫的要求。安全柜的分類級(jí)別與生物安全登記無關(guān)。一級(jí)生物安全柜：保護(hù)工作人員和環(huán)境，而不保護(hù)樣品。排氣口安裝有HEPA過濾器。自帶風(fēng)機(jī)，依賴外接通風(fēng)管中的風(fēng)機(jī)帶動(dòng)氣流。二級(jí)生物安全柜：可提供對(duì)樣品，環(huán)境，工作人員的保護(hù)。排氣口安裝有HEPA過濾器，獨(dú)有特征是具有垂直層狀薄片（無定向的）HEPA過濾器。內(nèi)置風(fēng)機(jī)，形成下沉氣流;無自帶風(fēng)機(jī)，依賴外接通風(fēng)管中的風(fēng)機(jī)帶動(dòng)氣流。三級(jí)生物安全柜:為3－4級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全等級(jí)而設(shè)計(jì)，柜體完全氣閉。通過手套進(jìn)行操作，俗稱“手套箱”。實(shí)驗(yàn)品通過雙門的傳遞箱進(jìn)出。適用于高風(fēng)險(xiǎn)的生物實(shí)驗(yàn)。二級(jí)生物安全柜的使用：確認(rèn)通風(fēng)櫥已經(jīng)打開，并且空氣正在循環(huán)；把框格降低到刻度處；不要阻礙空氣流通；使用前用70％乙醇擦拭臺(tái)面；不要使用酒精燈；減少手臂再通風(fēng)櫥內(nèi)晃動(dòng)基本設(shè)施配置之二光溫控制設(shè)施包括時(shí)間程序控制器；空調(diào)及溫度感應(yīng)器基本設(shè)施配置之三細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備溫度37℃±0.5℃；CO2濃度5%；相對(duì)濕度100%；定期清洗、消毒基本設(shè)施配置之四固定角式轉(zhuǎn)子；水平轉(zhuǎn)子；垂直轉(zhuǎn)子注意：1000RPM10MIN配平基本設(shè)施配置之五細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備（倒置顯微鏡;熒光顯微鏡;酶標(biāo)檢測(cè)儀;流式細(xì)胞儀）三常用器皿、器械(解剖器具\(yùn)培養(yǎng)器皿\移液器\特殊用具)解剖器具主要用于解剖動(dòng)物、取材和原代培養(yǎng)中切割組織。常用的手術(shù)器械有手術(shù)刀柄及刀片、組織剪、眼科剪、鑷子、尖鑷、止血鉗、持針器等。各種器械至少要準(zhǔn)備兩套，以備輪換消毒用。各種金屬器械使用后，及時(shí)刷洗干凈，用干凈紗布拭干，上一薄層液體石蠟，以防生銹。消毒法采用高壓蒸汽滅菌或采用70％乙醇浸泡消毒。培養(yǎng)器皿如溶液瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。多孔培養(yǎng)板材料僅有塑料的一種，適宜少量細(xì)胞和單克隆生長(zhǎng)，也適宜進(jìn)行分組比較的生化、藥理、毒理等方面的實(shí)驗(yàn)，其規(guī)格主要有6孔，12孔、24孔、96孔培養(yǎng)板。移液器電動(dòng)移液器、微量移液器、多通道微量移液器特殊用具細(xì)胞篩網(wǎng)、細(xì)胞刮刀、細(xì)胞計(jì)數(shù)板天然培養(yǎng)基最普遍使用的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最為普遍。血清由于含有多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。常見使用最為5-20%。血清培養(yǎng)基的主要問題：1血清的準(zhǔn)確成份、含量仍不清楚。2批間差異大，保存期短，標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制。3非生理學(xué)液體，可能促進(jìn)/抑制某些細(xì)胞生長(zhǎng)。4含有細(xì)胞毒性物質(zhì)（補(bǔ)體、抗體、細(xì)菌毒素等）。5取材中可能帶入支原體、病毒，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響。6價(jià)格昂貴合成培養(yǎng)基根據(jù)細(xì)胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量,用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工設(shè)計(jì)、配制的培養(yǎng)基。從最初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。顯示劑：酚紅谷氨酰胺無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM)不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。無蛋白培養(yǎng)基（proteinfreemidium,PFM）不含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemicaldefinedmedium,CDM)不含有動(dòng)物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。常用培養(yǎng)基MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列199細(xì)胞培養(yǎng)基系列水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基歐氏平衡鹽F-10,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列其它類型細(xì)胞培養(yǎng)基常用干粉培養(yǎng)基的配置認(rèn)真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4度。實(shí)驗(yàn)室操作注意事項(xiàng)做好實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備，避免反復(fù)進(jìn)出而增加污染機(jī)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室前需更換工作服,換鞋并洗凈、消毒雙手。注意無菌室內(nèi)的紫外燈室內(nèi)常規(guī)用品不準(zhǔn)隨意拿出室外，所有物品不得挪作它用冰箱內(nèi)的培養(yǎng)液要注明姓名、配制日期，不隨便使用他人的培養(yǎng)液，以免交叉污染注意各類設(shè)備運(yùn)行狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)報(bào)告實(shí)驗(yàn)完畢，及時(shí)清潔工作臺(tái)面，將使用過的實(shí)驗(yàn)用品移出無菌室定期對(duì)無菌室進(jìn)行消毒滅菌細(xì)胞因子的檢測(cè)方法：1)生物學(xué)方法①依賴性細(xì)胞株：生物分析法②功能檢測(cè)：生物分析法2)分子生物學(xué)方法①分子雜交技術(shù)：mRNA的測(cè)定②多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）：mRNA的測(cè)定3）免疫學(xué)方法①免疫測(cè)定：免疫酶技術(shù)②功能測(cè)定與抗體抑制抗體檢測(cè)技術(shù)1）免疫酶技術(shù)2）免疫熒光技術(shù)3）間接血凝試驗(yàn)4）放射免疫測(cè)定5）蛋白印跡6）免疫共沉淀酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)實(shí)驗(yàn)原理ELISA利用了免疫反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性檢測(cè)抗原或抗體使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性按一定步驟進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)加底物顯色，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析檢測(cè)方法：1.直接法2.間接法3.雙抗體夾心法4.雙夾心間接法一、試劑及儀器準(zhǔn)備（一）免疫吸附劑1.固相載體⑴要求：①吸附力強(qiáng)②能保持Ag或Ab活性③不參與化學(xué)反應(yīng)⑵載體性能比較①載體材料：+、-結(jié)果差別大②ELISA板：10ug/LIgG包被,加酶標(biāo)抗IgG，顯色后，測(cè)20孔的OD，要求CV<10%⑶常用載體：材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等；形狀：小試管、小珠、微量反應(yīng)板2.Ag或Ab：純度高、效價(jià)高、結(jié)合力高3.免疫吸附劑(固相Ag或Ab)：⑴包被：將Ag或Ab固相化的過程包被緩沖液、包被方法⑵封閉：包被后在用1—5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特異吸附的干擾㈡酶結(jié)合物：1.酶的要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、標(biāo)記后穩(wěn)定。2.ELISA常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等3.酶的底物：HRP可溶性底物及呈色：鄰苯二胺(OPD)：橙紅(492nm)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：藍(lán)色(450nm)4.酶結(jié)合物的制備：⑴戊二醛交聯(lián)法⑵過碘酸鹽氧化法（三）設(shè)備：酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀操作時(shí)室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30min，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀二、操作步驟（間接ELISA法）1.樣本的收集；2.包被抗原；3.封閉；4.加稀釋的待檢樣品；5.加酶標(biāo)抗抗體；6.加底物顯色；7.終止反應(yīng)（一）樣品的收集和保存：注意事項(xiàng)1.溶血標(biāo)本可增加非特異性顯色(Hb作用于HRP的輔基)；2.細(xì)菌污染標(biāo)本因菌體內(nèi)源性酶而假“-”；3.反復(fù)凍融可使抗體效價(jià)下降而假“-”；4.陳舊標(biāo)本可使IgG聚集，引起間接法本底增加；5.標(biāo)本中含NaN3，可出現(xiàn)假“-”。（二）包被：將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。包被的條件pH9.6碳酸鹽緩沖液；pH7.2磷酸鹽緩沖液；pH7-8Tris-HCl緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜或37℃中保溫2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml最適工作濃度的選擇：棋盤滴定法包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度：將包被抗體和酶標(biāo)抗體稀釋成一系列濃度，反應(yīng)后顯色。陽(yáng)性值在0.8左右，陰性值小于0.1為最適，可據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度方陣(棋盤)滴定法選擇包被抗原的工作濃度用包被液將抗原作一系列稀釋(1:50～l:800)后，按行進(jìn)行包被、洗滌。按列分別加入用稀釋液1:100稀釋的強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、陰性參考血清及稀釋液(作空白對(duì)照)，保溫，洗滌。加工作濃度酶標(biāo)抗體，洗滌，加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。選擇強(qiáng)陽(yáng)性參考血清A值為0．8左右，陰性參考血清A值<0．1的包被抗原稀釋度為工作濃度（三）封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附常用封閉劑：1%的BSA；10%的小牛血清或1%明膠;5%脫脂奶粉,比較價(jià)廉（四）加樣抗原或抗體：純化抗原/抗體(天然但干擾多)、合成抗原/抗體(多肽分子較小，常有空間位阻)、基因抗原(與片段的選擇和制備水平有關(guān))（五）加酶標(biāo)抗體酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等（六）顯色顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無色（七）結(jié)果判定拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算結(jié)果以光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是將吸收波長(zhǎng)寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"1.定性測(cè)定：在間接法和夾心法ELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔2.定量測(cè)定：測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。三、基本操作注意事項(xiàng)（一）加樣:在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡（二）孵育：ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的孵育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。（三）洗滌目的：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。四、實(shí)驗(yàn)中常出現(xiàn)的問題1.ELISA出現(xiàn)“一片黃”的原因：⑴酶結(jié)合物濃度過高⑵底物不新鮮⑶洗滌不干凈2.ELISA出現(xiàn)“一片白”的原因：⑴載體吸附性能差⑵底物錯(cuò)⑶稀釋液作包被液⑷加錯(cuò)試劑⑸包被時(shí)間過短⑹酶活力低或下降⑺樣品含有NaN3間接ELISA法操作步驟1.樣本的收集；2.包被抗原；3.封閉；4.加稀釋的待檢樣品；5.加酶標(biāo)抗抗體；6.加底物顯色；7.終止反應(yīng)凋亡時(shí)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變1.細(xì)胞漿濃縮，核糖體、線粒體等聚集，細(xì)胞體積縮小，結(jié)構(gòu)更加緊密2.染色質(zhì)逐漸凝聚成新月狀附于核膜周邊，嗜堿性增強(qiáng)。細(xì)胞核固縮呈均一的致密物，進(jìn)而斷裂為大小不一的片段3.胞膜不斷出芽、脫落，細(xì)胞變成數(shù)個(gè)大小不等的由胞膜包裹的凋亡小體(apoptoticbodies)。凋亡小體內(nèi)可含細(xì)胞漿、細(xì)胞器和核碎片，有的不含核碎片4.凋亡小體被具有吞噬功能的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等吞噬、降解凋亡發(fā)生過程中，細(xì)胞膜保持完整，細(xì)胞內(nèi)容物不釋放出來，所以不引起炎癥反應(yīng)壞死（necrosis）是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)

凋亡壞死機(jī)制基因調(diào)控的程序化細(xì)胞死亡，主動(dòng)性自殺意外事故性細(xì)胞死亡，被動(dòng)進(jìn)行誘因生理性或輕微病理性刺激因子誘導(dǎo)病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生死亡范圍多為散在的單個(gè)細(xì)胞多為聚集的大片細(xì)胞形態(tài)特征細(xì)胞固縮，核染色質(zhì)邊集，細(xì)胞膜及各細(xì)胞器膜完整，膜可發(fā)泡成芽，形成凋亡小體細(xì)胞腫脹，核染色質(zhì)絮狀或邊集，細(xì)胞膜及各細(xì)胞器膜溶解破壞，溶酶體酶釋放，細(xì)胞自溶生化特征耗能的主動(dòng)過程，有新蛋白合成，DNA早期規(guī)律降解為180-200bp片段，瓊脂凝膠電泳呈特征性梯帶狀不耗能的被動(dòng)過程，無新蛋白合成，DNA降解不規(guī)律，片段大小不一，瓊脂凝膠電泳不呈梯帶狀胞內(nèi)溶物釋放到胞外無有形成凋亡小體有無炎癥反應(yīng)無有修復(fù)再生無有細(xì)胞凋亡的意義細(xì)胞凋亡普遍存在于生物界，既發(fā)生于生理狀態(tài)下，也發(fā)生于病理狀態(tài)下。細(xì)胞凋亡對(duì)于多細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用。細(xì)胞凋亡過多引起的疾病艾滋病的發(fā)展過程中，CD4+T細(xì)胞數(shù)目的減少移植排斥反應(yīng)中，細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞死亡缺血及再灌注損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡增多神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾?。ˋlzheimer病、Parkinson‘s?。┘?xì)胞凋亡過少引起的疾病腫瘤：乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病自身免疫性疾?。合到y(tǒng)性紅斑狼瘡各種病毒感染：腺病毒、皰疹病毒、痘病毒感染三.細(xì)胞凋亡的過程及特征1凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外的凋亡誘導(dǎo)因素與被作用的細(xì)胞受體結(jié)合后，細(xì)胞產(chǎn)生復(fù)雜的生化反應(yīng)，并形成與凋亡有關(guān)的第二信使：cAMP,Ca2+,神經(jīng)酰胺等信號(hào)分子形成死亡信號(hào)。2.凋亡基因激活調(diào)控的凋亡基因在接受死亡信號(hào)后，開始按預(yù)定程序啟動(dòng)，并合成執(zhí)行凋亡所需的各種酶和相關(guān)物質(zhì)。3.凋亡的執(zhí)行凋亡的主要執(zhí)行者有兩類酶：核酸內(nèi)切酶（Dnase）徹底破壞細(xì)胞的生物命令系統(tǒng)；Caspases3—細(xì)胞的結(jié)構(gòu)全面解體4.凋亡細(xì)胞的清除凋亡后細(xì)胞可以被鄰近巨噬細(xì)胞分解凋亡時(shí)細(xì)胞的生化特征變化1.胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高。2.細(xì)胞內(nèi)活性氧增多。3.質(zhì)膜通透性變大。4.DNA內(nèi)切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成180~200bp為基數(shù)的有序片段。5.Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和需鈣蛋白酶（Calpain）活性升高。1.DNA的片段化由于核酸內(nèi)切酶激活，基因組的DNA在核小體連接區(qū)發(fā)生非隨機(jī)性降解，產(chǎn)生寡核小體片段，其大小相當(dāng)于核小體（180～200bp）的倍數(shù)。在瓊脂糖凝膠電泳中可見特征性的“梯”狀（ladderpattern）條帶2.鈣依賴蛋白酶可導(dǎo)致細(xì)胞膜的改變—磷脂酰絲氨酸(PS)的暴露四、細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制氧化損傷機(jī)制氧化應(yīng)激（oxidativestress）指機(jī)體活性氧產(chǎn)生過多或抗氧化能力下降，活性氧的清除不足，導(dǎo)致活性氧在體內(nèi)積聚并引起氧化損傷的病理過程。氧化應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制1.DNA受損激活P53基因2.生物膜損傷膜通透性↑ΔΨm↓Ca內(nèi)流↑DNase↑脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物↑3.多聚ADP核糖合成酶活化，NAD＋耗竭，ATP大量消耗4.可活化NF-kB、AP-1，加速細(xì)胞凋亡相關(guān)的一些基因表達(dá)鈣穩(wěn)態(tài)失衡機(jī)制鈣穩(wěn)態(tài)失衡誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制1.激活Ca2＋/Mg2＋依賴的DNase2.激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（GTase），促進(jìn)凋亡細(xì)胞中蛋白廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體的形成3.激活Ca2＋敏感的蛋白酶核骨架蛋白酶核基質(zhì)蛋白絲氨酸蛋白酶膜蛋白4.激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄線粒體損傷機(jī)制線粒體損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制線粒體的功能改變表現(xiàn)為線粒體內(nèi)膜通透性↑線粒體內(nèi)膜的跨膜電位（Δψm）↓能量合成水平↓細(xì)胞凋亡相關(guān)基因促凋亡基因P53p53是腫瘤抑制基因，其產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞核內(nèi)。p53基因在人類腫瘤有關(guān)基因的突變率最高，人類腫瘤的50％以上是由p53基因的缺失造成的抑制凋亡基因Bcl2家族Bcl2是一種原癌基因，是ced9在哺乳類中的同源物。Bcl2能延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，但不促進(jìn)細(xì)胞增殖，能抑制細(xì)胞凋亡caspase家族與凋亡caspase是近年發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，它們可特異地?cái)嚅_天冬氨酸殘基后的肽鍵。切割的結(jié)果是使某些蛋白活化或失活，由此細(xì)胞凋亡天然的caspase抑制劑細(xì)胞凋亡失機(jī)體用來清除病毒、防止其進(jìn)一步感染的一種機(jī)制，而病毒也發(fā)展出一種對(duì)抗機(jī)制──抑制caspase的活性，來逃避或阻止凋亡的發(fā)生。痘病毒蛋白CrmA和桿病毒蛋白p35就是這樣的天然的caspase抑制劑五.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)(一)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)(二)磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）(三)線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè)(四)DNA片斷化檢測(cè)(五)TUNEL法(六)Caspase-3活性的檢測(cè)(七)凋亡相關(guān)基因的基因芯片檢測(cè)(八)有關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)(一)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)1.光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)2.熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評(píng)判細(xì)胞凋亡。常用的DNA特異性染料：Hoechst33342、Hoechst33258、DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)可發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為2～5mg/ml。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色，使用終濃度一般為0.5～1mg/ml。熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡結(jié)果判定Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體透射電子顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體（二）磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35-36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法：碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。方法

1懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.5-1×106）用PBS洗2次，加入100ulBindingBuffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應(yīng)5min后，加入400ulBindingBuffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)（一般不超過1h），同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對(duì)照2貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞3爬片細(xì)胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。注意事項(xiàng)1.整個(gè)操作動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞2.操作時(shí)注意避光，反應(yīng)完畢后盡快在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)（三）線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè)線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽(yáng)離子熒光染料如Rhodamine、Tetramethylrhodaminemethylester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低方法：將正常培養(yǎng)的細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加入使用終濃度為Rhodamine123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°注意事項(xiàng)1始終保持平衡染液中pH值的一致性，因?yàn)閜H值的變化將影響膜電位2與染料達(dá)到平衡的細(xì)胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合，降低染料的濃度，引起假去極化（四）DNA片斷化檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成50~300kbp長(zhǎng)的DNA大片段,或180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNAladder)1．DNALadder測(cè)定

方法：收獲細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，13000rpm5min,收集上清。1%SDS和RnaseA2h。蛋白酶2h，1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA，4°本實(shí)驗(yàn)雖然具有較高的診斷價(jià)值，但缺點(diǎn)是敏感性差，需較大量的凋亡細(xì)胞才能顯示出陽(yáng)性反應(yīng)，此外不能定位發(fā)生細(xì)胞凋亡的部位。2.流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡根據(jù)正常、死亡細(xì)胞對(duì)某些DNA結(jié)合熒光染料的通透性不同來加以區(qū)別，其實(shí)質(zhì)是檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA含量。最常用的PI（碘化丙啶）染色法，此外尚有丫啶橙、溴乙錠染色法等。方法：收集細(xì)胞，70%冷乙醇4℃該法具有快速、可定量、檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量大等優(yōu)點(diǎn)。不足是不能區(qū)分凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞，不能檢出早期凋亡細(xì)胞，對(duì)有S期或G2/M期阻滯的細(xì)胞凋亡漏檢率較高等。3.LM-PCRLadderAssay當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞數(shù)量少及檢測(cè)樣品量很少（如活體組織切片）時(shí)，直接用瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的LM-PCRLadderAssayKit通過LM-PCR(ligation-mediatedPCR),連上特異性接頭，專一性地?cái)U(kuò)增核小體的梯度片段，從而檢測(cè)細(xì)胞凋亡。優(yōu)點(diǎn)：敏感度高，適合于檢測(cè)少量樣本，小部分凋亡細(xì)胞。如臨床活組織檢測(cè)。TUNEL法脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）是檢測(cè)細(xì)胞凋亡較常用的方法。主要原理：細(xì)胞凋亡中DNA斷裂是內(nèi)切酶的作用，其斷端3′-OH暴露，這是凋亡細(xì)胞DNA斷裂的特征，以此區(qū)別細(xì)胞壞死DNA斷裂。TUNEL是一種將生化技術(shù)與免疫組化相結(jié)合，在組織切片或細(xì)胞涂片上顯示細(xì)胞凋亡的新技術(shù)。由于不需要模板，每一標(biāo)記處平均摻入4個(gè)左右的標(biāo)記dUTP，因此敏感性較高。但多次實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，由于該方法敏感性較高，會(huì)使固定不當(dāng)或具有基因轉(zhuǎn)錄活性的非凋亡細(xì)胞也出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，即假陽(yáng)性較明顯。（六）Caspase-3活性的檢測(cè)Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。1.Westernblot分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對(duì)底物PARP的裂解。方法：收集細(xì)胞→PBS洗滌→抽提細(xì)胞裂解液→蛋白定量→SDS電泳→硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移→封閉→加Caspase-3多抗或單抗→TBS-T洗3次→加HRP-標(biāo)記的二抗→TBS-T洗3次→顯色。2.熒光分光光度計(jì)分析原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測(cè)定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。方法：收獲細(xì)胞正常或凋亡細(xì)胞。PBS洗滌，制備細(xì)胞裂解液。加Ac-DEVD-AMC，37℃反應(yīng)1h3.流式細(xì)胞術(shù)分析方法：收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞。PBS洗滌，加Ac-DEVD-AMC37℃反應(yīng)1h。UV流式細(xì)胞計(jì)分析caspase-3(七)凋亡相關(guān)基因的基因芯片檢測(cè)基因芯片（又稱DNA芯片、生物芯片）技術(shù)指將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400）探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。(八)有關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定利用原位雜交、免疫組化等方法，檢測(cè)bax、bcl-2、c-myc、p53等凋亡相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)水平。單克隆抗體的制備抗體的定義免疫球蛋白：結(jié)構(gòu)概念抗體：功能概念與相應(yīng)抗原特異結(jié)合具有免疫功能的球蛋白抗體生產(chǎn)技術(shù)的三個(gè)時(shí)代多克隆抗體單克隆抗體基因工程抗體基因工程抗體:人源化全人源小型化噬菌體抗體庫(kù)二、單克隆抗體(monoclonalantibody)由一個(gè)B淋巴細(xì)胞通過有絲分裂繁殖形成的細(xì)胞群稱為“克隆”。針對(duì)一個(gè)抗原決定簇，由這一個(gè)克隆系產(chǎn)生的抗體稱為單克隆抗體特點(diǎn)：特異性強(qiáng)、性質(zhì)均一、易于大量生產(chǎn)三、單克隆抗體的制備生物方法：病毒誘導(dǎo)物理方法：電融合化學(xué)方法：PEG融合融合前的準(zhǔn)備抗體檢測(cè)方法的建立;針對(duì)抗體的特異性：ELISA;針對(duì)抗體使用目的;WB細(xì)胞染色;免疫組化小鼠的標(biāo)記(1)染色法（常用）3.5%－5%的苦味酸溶液;先左后右，從前到后;雙色：雙位數(shù)(2)打孔法(3)戴環(huán)法免疫小鼠(1)一般選擇健康8-12周齡的雌性BALB/C小鼠：融合用骨髓瘤細(xì)胞多來自此品系小鼠(2)常用的免疫途徑：腹腔注射：完全福氏佐劑初次;不完全福氏佐劑加強(qiáng)靜脈注射脾內(nèi)包埋、注射：抗原少、快速、高效(3)一般要經(jīng)過初次免疫、加強(qiáng)免疫、沖擊免疫三個(gè)過程(4)免疫前取血作陰性對(duì)照，加強(qiáng)免疫時(shí)取血檢測(cè)特異性抗體的產(chǎn)生和效價(jià)，決定沖擊免疫和融合時(shí)機(jī)免疫流程1.每只小鼠100μg抗原與完全福氏佐劑等量混勻，腹腔注射2.2~4周后，同量抗原加不完全福氏佐劑追加免疫一次（檢測(cè)抗體效價(jià)，必要時(shí)重復(fù)步驟2）3.同量抗原不加佐劑靜脈沖擊免疫一次4.沖擊免疫后3~4天獲取小鼠脾細(xì)胞親本細(xì)胞的選擇骨髓瘤細(xì)胞：1.本身不分泌抗體2.次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT-）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）的骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞：1.經(jīng)特定抗原免疫能產(chǎn)生目的抗體2.免疫動(dòng)物種系要與骨髓瘤細(xì)胞系一致或有相近親源關(guān)系3.細(xì)胞準(zhǔn)備復(fù)蘇小鼠骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期融合收集小鼠脾細(xì)胞1.取血：陽(yáng)性血清、減少脾內(nèi)紅細(xì)胞2.處死小鼠3.消毒小鼠：75%酒精浸泡4.取出脾臟：分層打開、更換器械5.分離脾細(xì)胞：研磨法、注射法6.離心收集（1500rpm,5min）無血清培養(yǎng)基分別沖洗脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞各三遍細(xì)胞計(jì)數(shù)：脾細(xì)胞/骨髓瘤細(xì)胞=2-10/1融合：均在37℃1min：0.7mlPEG加入混合細(xì)胞中2min：繼續(xù)攪拌3min：1ml無血清培養(yǎng)液4min：3ml無血清培養(yǎng)液5min：加至30ml離心：800-1000rpm,5min加入HAT選擇培養(yǎng)基鋪板注意事項(xiàng)1.PEG：MW1000~4000濃度30%~50%作用時(shí)間2.培養(yǎng)液緩緩加入：滲透壓改變3.加入和傾倒PEG時(shí)均需徹底融合細(xì)胞的選擇原理:HAT選擇培養(yǎng)基熒光流式細(xì)胞儀（FACS）分選A.HAT選擇培養(yǎng)基1964年Littlefield首先發(fā)明了HAT(H—Hypoxanthine次黃嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T—Thymidine胸腺嘧啶核苷)培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)HAT選擇性培養(yǎng)基是根據(jù)次黃嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途徑設(shè)計(jì)的B.熒光流式細(xì)胞儀分選（FACS法）兩種顏色熒光素分別標(biāo)記兩種融合細(xì)胞:異硫氰酸熒光素（FITC）,羅丹明篩選同時(shí)有兩種熒光素的融合細(xì)胞所篩細(xì)胞直接接種96孔板融合后的管理?yè)Q液Day3：半量換液Day7：半量換液觀察融合細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，有無細(xì)胞克隆的出現(xiàn)檢測(cè)一個(gè)高倍視野大小2.檢測(cè)上清3.間接法4.篩選陽(yáng)性孔入24孔板擴(kuò)增亞克隆軟瓊脂克隆法有限稀釋法(常用)：從陽(yáng)性分泌孔收集雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)逐步稀釋，使每孔只有一個(gè)細(xì)胞亞克隆細(xì)胞的培養(yǎng)添加飼養(yǎng)細(xì)胞：胸腺細(xì)胞提高血清濃度：20%添加細(xì)胞因子：IL-6，胰島素多次亞克?。?-3次）確保每個(gè)孔中只有來自于一個(gè)細(xì)胞的克隆群淘汰核型不穩(wěn)定的克隆，獲得穩(wěn)定基因型和穩(wěn)定分泌抗體的克隆體外培養(yǎng)培養(yǎng)上清中的牛血清可能干擾抗體活性，影響純化效果逐步降低培養(yǎng)基中血清濃度20%-10%-5%-2.5%-1%-0把握時(shí)機(jī)專用無血清培養(yǎng)基生物反應(yīng)器（Bioreactor）體內(nèi)培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)注射雜交瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)含有大量單克隆抗體的腹水將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期雜交瘤細(xì)胞洗滌后重懸于無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液中注射接種前一周需用降植烷處理小鼠腹腔，抑制腹腔免疫系統(tǒng)，有益于雜交瘤接種抗體效價(jià)高，但可能被小鼠自身抗體污染實(shí)驗(yàn)內(nèi)容腹腔注射小鼠眼眶取血處死小鼠原代脾細(xì)胞的分離腹腔注射：①用左手拇指和食指緊緊抓住頸部背的皮膚，手掌成杯狀緊握鼠背，同時(shí)用小指壓住尾根，固定好動(dòng)物②抬高小鼠腹部，右手將注射器的針頭刺入左下腹皮膚③針尖通過腹肌后抵抗力消失，固定好針尖，緩緩注入液體④為避免刺破內(nèi)臟，可將小鼠頭部放低，尾部抬高，使臟器移向橫膈處小鼠眼眶采血：先將鼠倒持，壓迫頸部，使眼球突出充血，酒精棉球局部消毒，用毛細(xì)管或塑料管沿眼角向后、下方插入眼底靜脈叢，血可從毛細(xì)管中自然流出脾細(xì)胞分離：①拉頸處死小鼠，浸泡于75%酒精中消毒體表②用剪刀依次剪開小鼠腹部皮膚和腹膜，暴露腹腔，取出脾臟，剃除周圍結(jié)締組織和脂肪，無血清培養(yǎng)液沖洗一次后置于100目不銹鋼網(wǎng)中③輕輕研磨脾臟，并用無血清培養(yǎng)液沖洗，收集脾細(xì)胞懸液，以1000rpm離心5min，棄上清，重懸浮于不完全培養(yǎng)液中抗原抗體應(yīng)用一、抗體的分離純化及測(cè)定1.抗體的分離純化按照分離方法分類，大致分為沉淀、鹽析、膜技術(shù)、電泳以及色譜等方法。只有色譜和電泳可用于抗體的精細(xì)分離即純化。1）鹽析原理：蛋白質(zhì)的溶解度在一定范圍內(nèi)隨鹽的濃度而變化。蛋白質(zhì)表面電荷被中和，水化膜被破壞，致使蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀。鹽的選擇：硫酸氨、硫酸鎂、硫酸納、氯化鈉、磷酸鈉等。注意的問題：鹽的飽和度、PH、蛋白濃度、溫度、脫鹽。2）膜分離技術(shù)以多孔膜進(jìn)行過濾或過篩子的過程。濾膜，透析帶，超濾管等。通常超濾膜的孔徑在1～100nm之間，截留的分子量在幾百到一百萬，所需的驅(qū)動(dòng)壓力在0.1～1.0MPa左右。3）色譜法也稱為層析法。分離的本質(zhì)是溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間分配的差異。使用最多的是離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜。A．凝膠色譜是體積排除色譜的一種，溶質(zhì)與填料以及流動(dòng)相之間沒有額外的相互作用，只依據(jù)其分子體積的大小而分離。常用的有交聯(lián)葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等。B．離子交換色譜通過酯化、醚化或氧化等化學(xué)反應(yīng)，在合成的高聚物型凝膠上引入具有堿性或酸性離子基團(tuán)。含有陽(yáng)離子基團(tuán)時(shí)，可交換陰離子樣品，稱之為陰離子交換樹脂；反之為陽(yáng)離子交換樹脂。C．親和色譜利用抗原、半抗原與其抗體，蛋白A和一些抗體之間，具有專一性的親和力，在一定條件下能緊密結(jié)合成復(fù)合物，而這種結(jié)合又是可逆的。蛋白A——大部分哺乳動(dòng)物的IgG蛋白G——機(jī)制相似，能力不同，與蛋白A互補(bǔ)。蛋白L——專一的與K鏈結(jié)合蛋白H——很強(qiáng)的種屬專一性和溫度依賴性。組氨酸——IgG金屬鰲合親和色譜——MCAC常用Zn2+、Ni2+、Cu2+等。2．抗體的測(cè)定包括抗體純度、含量、抗體活性、抗體特異性以及抗體親和力的測(cè)定等幾個(gè)方面。1）抗體特異性的測(cè)定：ELISA測(cè)定法放射免疫測(cè)定（RIA）：利用核素示蹤法的高靈敏度和抗原－抗體免疫學(xué)反應(yīng)的高特異性。免疫熒光測(cè)定：FITC、Rhodamine2）抗體含量及免疫活性的測(cè)定檢測(cè)雜交瘤上清中McAb的含量一般用夾心ELISA。高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定抗體含量毛細(xì)管電泳（CE）測(cè)定抗體含量3）抗體親和力的測(cè)定抗體的親和力（affinity）指的是抗體與其抗原相結(jié)合的緊密程度，親和力越強(qiáng)，則結(jié)合越牢固。決定抗體親和力除了抗體結(jié)合位點(diǎn)與抗原決定簇的空間構(gòu)型的適合度外，抗體抗原分子間的分子鍵、庫(kù)侖引力、范德華引力，反應(yīng)條件如pH等也有一定的作用。親和力的測(cè)定方法Scatchard分析竟?fàn)幗Y(jié)合方法硫氰酸鹽洗脫法非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫實(shí)驗(yàn)二、抗體的規(guī)模生產(chǎn)抗體的規(guī)模生目前大量制備單抗的方法主要有兩大系統(tǒng)。動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)法是國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室所廣泛采用體外培養(yǎng)法動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)單抗通常情況下均采用動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法，絕大多數(shù)動(dòng)物用雜交瘤均由BALB/C小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與同品系的脾細(xì)胞融合而得。操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)腹水中?；煊行∈蟮母鞣N雜蛋白，很多情況下要提純后才能使用，而且還有污染動(dòng)物病毒的危險(xiǎn)，故而最好用SPF級(jí)小鼠。體外培養(yǎng)生產(chǎn)單抗的方法要想在體外大量制備單抗，就必須進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的大量（高密度）培養(yǎng)。單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量越多，細(xì)胞存活時(shí)間越長(zhǎng)，單抗的濃度就越高，產(chǎn)量就越大。體外培養(yǎng)生產(chǎn)單抗目前在雜交瘤細(xì)胞的大量培養(yǎng)中，主要有兩種類型的培養(yǎng)系統(tǒng)。懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)采用轉(zhuǎn)瓶或發(fā)酵罐式的生物反應(yīng)器，其中包括使用微載體細(xì)胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)包括中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)法：目前小規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，通過攪拌使細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)；而大規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用發(fā)酵式的生物反應(yīng)器，美國(guó)、加拿大、法國(guó)和德國(guó)等幾家公司生產(chǎn)這類反應(yīng)器，其培養(yǎng)方式可分為純批式、流加式、半連續(xù)式和連續(xù)式。微載體培養(yǎng)法：微載體（Microcarrier）是以小的固體顆粒作為細(xì)胞生長(zhǎng)的載體，在攪拌作用下微載體懸浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞則在固體顆粒表面生長(zhǎng)成單層?？捎米骷?xì)胞大量培養(yǎng)的微載體主要以交聯(lián)瓊脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作為基質(zhì)的產(chǎn)品。微載體培養(yǎng)的基本方法上與懸浮培養(yǎng)相同。研究表明，該法是雜交瘤細(xì)胞大培養(yǎng)的理想途徑之一。中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：該系統(tǒng)由中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動(dòng)泵等組成。用于細(xì)胞培養(yǎng)的中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯-丙烯復(fù)合物、多聚碳酸硅等材料制成。中空纖維的內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜，其孔徑只允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物出入，而對(duì)細(xì)胞和大分子物質(zhì)（如單抗等）有滯留作用。目前使用的中空纖維生物反應(yīng)器分為柱式、板框式和中心灌流式。盡管該培養(yǎng)系統(tǒng)在大規(guī)模生產(chǎn)單抗時(shí)成本較低，并可獲得高產(chǎn)量高純度的抗體，由于設(shè)備價(jià)格昂貴，限制了其使用范圍。微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：該系統(tǒng)是先將雜交瘤細(xì)胞微囊化，然后將此具有半透膜的微囊置于培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，一定時(shí)間后，從培養(yǎng)液中分離出微囊，沖洗后打開囊膜，離心后即可獲得高濃度的單抗。三．抗體的應(yīng)用基礎(chǔ)研究診斷治療預(yù)防1抗體的基礎(chǔ)研究1）抗體功能抗體阻斷病原體入侵宿主細(xì)胞；抗原抗體結(jié)合后激活補(bǔ)體，對(duì)病原體產(chǎn)生殺傷作用；ADCC；ADCI干擾病原體的營(yíng)養(yǎng)代謝；某些抗菌素和殺蟲藥有抗體依賴性2）組織定位，受體定位，結(jié)構(gòu)研究3）抗原純化eg:親和層析4）定量5）分類（型）eg:病毒分型,寄生蟲種群分類,CD