細(xì)胞工程教案2011

細(xì)胞工程（第二版）李志勇科學(xué)出版社上篇細(xì)胞工程基礎(chǔ)第1章細(xì)胞工程簡(jiǎn)介1.1生物工程bioengineering

也稱生物工藝學(xué)（biotechnology或bioprocess）,一般稱為生物技術(shù)，是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體系和工程學(xué)原理生產(chǎn)生物制品和創(chuàng)造新物種的一門綜合技術(shù)。1.1.1生物工程發(fā)展歷程1.1.1.1第一代生物工程(1)4000多年以前的釀造技術(shù)(2)1674年荷蘭人列文·虎克顯微鏡微生物(3)1857年巴斯德酒精發(fā)酵是由酵母引起的19世紀(jì)末——20世紀(jì)30年代，乳酸、酒精、丙酮、檸檬酸、淀粉酶等發(fā)酵產(chǎn)品問世，真正意義上的生物工程才正式誕生。大多數(shù)產(chǎn)品是嫌氣發(fā)酵過程的產(chǎn)物。產(chǎn)物多屬于初級(jí)代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)過程比較簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備的要求不高，規(guī)模一般不大。1.1.1.2第二代（近代）生物工程20世紀(jì)40年代，第二次世界大戰(zhàn)時(shí)期，戰(zhàn)爭(zhēng)需要一種有效而副作用小的抗細(xì)菌感染藥物。青霉素1928年，英國人弗萊明（Fleming）發(fā)現(xiàn)1940年，弗羅里（Florey）和錢恩（Chain）等實(shí)現(xiàn)人工提取并證實(shí)青霉素的療效，但是大規(guī)模制備仍未實(shí)現(xiàn)。1941年，美、英合作對(duì)青霉素的大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行研究和開發(fā)，建立了青霉素大規(guī)模發(fā)酵制備工藝。不久鏈霉素、金霉素、新霉素等相繼問世。抗生素工業(yè)的興起標(biāo)志著生物工程進(jìn)入了一個(gè)新的階段?？股厣a(chǎn)的經(jīng)驗(yàn)很快促進(jìn)了20世紀(jì)50年代氨基酸發(fā)酵工業(yè)60年代酶制劑工業(yè)的發(fā)展此時(shí)期產(chǎn)品特點(diǎn)：⑴產(chǎn)品類型多，不但有初級(jí)代謝產(chǎn)物，也有次級(jí)代謝產(chǎn)物，還有生物轉(zhuǎn)化、酶反應(yīng)等產(chǎn)品。⑵技術(shù)要求高，菌種的活力和性能有了顯著提高；生產(chǎn)過程在無菌條件下進(jìn)行；大多數(shù)過程為好氣發(fā)酵。⑶規(guī)模巨大，一些發(fā)酵罐規(guī)?？蛇_(dá)到幾噸以上。1.1.1.3第三代（現(xiàn)代）生物工程1953年，美國的沃森（Waston）和克里克（Crick）發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。1974年，美國的波依耳（Boyer）和科恩（Cohen）首次在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。20世紀(jì)70年代，隨著基因重組、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、酶的固定化、動(dòng)植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)、現(xiàn)代化生物反應(yīng)器和生物制藥等技術(shù)的迅速發(fā)展，生物工程進(jìn)入了新的發(fā)展階段?；蚬こ淌谷藗?cè)O(shè)計(jì)新生命體成為可能。同時(shí)，基因工程將外源基因在體外與載體DNA連接以后導(dǎo)入宿主細(xì)胞獲得所需的目標(biāo)產(chǎn)品。一些正在開發(fā)或已經(jīng)生產(chǎn)的產(chǎn)品：干擾素、胰島素、生長(zhǎng)激素、血纖維蛋白溶解劑、疫苗、胸腺素、白蛋白、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、降血鈣素、絨毛促性腺激素、抗血友病因子Ⅷ等。醫(yī)藥、食品、化學(xué)、農(nóng)業(yè)及環(huán)保等領(lǐng)域新的技術(shù)革命1.1.2現(xiàn)代生物工程組成三門基礎(chǔ)學(xué)科：生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)為生物工程學(xué)提供理論支撐。生物工程反過來又推動(dòng)這些基礎(chǔ)學(xué)科的發(fā)展。傳統(tǒng)的生物工程：發(fā)酵工程、酶工程、細(xì)胞工程、基因工程。后來，生物化學(xué)工程、蛋白質(zhì)工程、代謝工程、組織工程等生物工程技術(shù)得以迅速發(fā)展?，F(xiàn)代生物工程技術(shù)發(fā)展既相互關(guān)系：1.1.2.1發(fā)酵工程（fermentationengineering）也稱微生物工程（microbialengineering）,是指采用現(xiàn)代工程技術(shù)手段，利用微生物的某些特定功能，生產(chǎn)有用產(chǎn)品，或直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程的一種技術(shù)。最古老的生物工程技術(shù)曾經(jīng)是主體技術(shù)對(duì)象：天然微生物基因工程菌1.1.2.2酶工程(enzymeengineering)是利用酶的催化作用，生產(chǎn)人類所需的產(chǎn)品或達(dá)到某一特殊目的的技術(shù)。6大類：氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類、裂解酶類、連接酶類和異構(gòu)酶類。特定地催化某個(gè)化學(xué)反應(yīng)，具有效率高、條件溫和、污染小、能耗低、反應(yīng)容易控制等特點(diǎn)。1.1.2.3蛋白質(zhì)工程（proteinengineering）

是指在基因工程基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)知識(shí)通過對(duì)基因的人工定向改造等手段，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、改造和拼接以生產(chǎn)出能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)的技術(shù)。第二代基因工程研究方向：①基因水平上的蛋白質(zhì)改造，創(chuàng)造結(jié)構(gòu)和功能全新的蛋白質(zhì)②蛋白質(zhì)修飾，即蛋白質(zhì)翻譯后的基因修飾。1.1.2.4基因工程（geneticengineering）

是指對(duì)生物的遺傳基因進(jìn)行切割、拼接或重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)生產(chǎn)出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新遺傳性狀的生物類型的一門技術(shù)。1.1.2.5生物化學(xué)工程（biochemicalengineering）

簡(jiǎn)稱生化工程，主要研究實(shí)驗(yàn)室研究成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力過程中帶有共性的工程技術(shù)問題。主要包括：①新型生物反應(yīng)器系統(tǒng)及生產(chǎn)工藝；②新型分離技術(shù)和設(shè)備開發(fā)；③描述生物反應(yīng)過程的數(shù)學(xué)模型的建立；④生產(chǎn)過程在線檢測(cè)和控制技術(shù)。1.2細(xì)胞工程cellengineering是應(yīng)用生命科學(xué)理論，借助工程學(xué)原理與技術(shù)，有目的地利用或改造生物遺傳性狀，以獲得特定的細(xì)胞、組織產(chǎn)品或新型物種的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。研究對(duì)象：細(xì)胞染色體、細(xì)胞核、原生質(zhì)體、受精卵、胚胎、組織或器官。研究對(duì)象：生物類別劃分

微生物細(xì)胞工程（發(fā)酵工程）

植物細(xì)胞工程

動(dòng)物細(xì)胞工程1.2.1細(xì)胞工程發(fā)展歷史1.2.1.1探索期P71902年，德國植物學(xué)家哈伯蘭德（Haberlandt）提出了細(xì)胞全能性學(xué)說溫特（Went）、高特里特（Gautheret）和諾比考特（Nobercourt）一起成為植物組織培養(yǎng)的奠基人。1.2.1.2誕生期P7腺嘌呤和生長(zhǎng)素的比例是控制芽形成的重要因素激動(dòng)素植物激素控制器官形成生長(zhǎng)素與分裂素比例是控制植物細(xì)胞分化的關(guān)鍵：當(dāng)生長(zhǎng)素與分裂素比例高時(shí)利于根的生長(zhǎng)，比例低時(shí)利于芽或莖的分化，比例相當(dāng)時(shí)利于保持分裂但無分化的狀態(tài)。1.2.1.3快速發(fā)展期P820世紀(jì)70年代開始，隨著細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科的發(fā)展和研究的日益深入，細(xì)胞工程進(jìn)入快速發(fā)展階段。加籍華裔科學(xué)家高國楠發(fā)現(xiàn)：聚乙二醇可以促使植物原生質(zhì)體融合，植物細(xì)胞融合技術(shù)初步建立。1981年，齊默曼利用可變電場(chǎng)誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，建立了細(xì)胞融合物理方法，進(jìn)一步完善了細(xì)胞融合技術(shù)。1.2.2細(xì)胞工程與其他生物工程技術(shù)的關(guān)系1.2.3細(xì)胞工程主要應(yīng)用1.2.3.1動(dòng)植物快速繁殖優(yōu)良動(dòng)植物的快速繁殖以及瀕危物種的保護(hù)主要技術(shù)：植物組織培養(yǎng)、人工種子、體外受精動(dòng)物、克隆動(dòng)物等1.2.3.2品種改良與新品種培育主要是指在細(xì)胞、細(xì)胞器、染色體、細(xì)胞核水平上進(jìn)行遺傳性狀改良，培育出生物新品種。主要技術(shù)：細(xì)胞水平上的原生質(zhì)體誘變、細(xì)胞融合技術(shù)；細(xì)胞器水平上的細(xì)胞重組；染色體水平上的多倍體、單倍體育種；以及雌（雄）核發(fā)育、胚胎嵌合、植物離體受精等。1.2.3.3細(xì)胞工程生物制品利用動(dòng)植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物制品是現(xiàn)代細(xì)胞工程的一個(gè)代表性領(lǐng)域。藍(lán)藻、綠藻、光合細(xì)菌等一些單細(xì)胞生物可以在特定條件下產(chǎn)生氫氣。硅藻等微藻富含油脂，因此，微藻細(xì)胞高密度培養(yǎng)產(chǎn)生氫、制備生物柴油以及微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等在能源領(lǐng)域大有可為。1.2.3.4組織工程利用體外培養(yǎng)的細(xì)胞或者人造組織器官可以實(shí)現(xiàn)受損組織或器官的修復(fù)與替換，克服目前器官移植的原料不足、免疫排斥等問題。復(fù)習(xí)題：1.生物工程包括哪些技術(shù)，各有什么特點(diǎn)？2.什么是細(xì)胞工程？有什么應(yīng)用價(jià)值？第2章細(xì)胞工程基礎(chǔ)2.4細(xì)胞分化與脫分化2.4.1細(xì)胞全能性是指分化細(xì)胞保留著全部的核基因組，具有生物個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育所需要的全部遺傳信息，具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能。1958年，史都華德（Steward）等利用胡蘿卜根韌皮部組織培養(yǎng)出了完整的新植株，證明高度分化的植物營養(yǎng)組織仍保持著發(fā)育成完整植株的能力。動(dòng)物細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)證明，胚胎細(xì)胞及高度分化的體細(xì)胞具有全能性。2.4.2細(xì)胞分化持家基因（house-keepinggene）：維持細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)和最低限度功能所不可缺少的基因，此類基因在所有類型的細(xì)胞中都表達(dá)。組織特異性基因（tissue-specificgene）：又稱奢侈基因，是在各種組織中進(jìn)行不同的選擇性表達(dá)的基因，與各類細(xì)胞的特殊性有直接關(guān)系。2.4.3細(xì)胞脫分化脫分化：又稱去分化，是指分化細(xì)胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只?xì)胞特性的過程，即分化的細(xì)胞在適當(dāng)條件下轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝誀顟B(tài)而重新獲得分裂能力的過程。不同生物的細(xì)胞脫分化能力不同，通常采用人工誘導(dǎo)技術(shù)誘導(dǎo)體細(xì)胞的脫分化。2.4.4細(xì)胞再分化再分化是指在離體條件下，無序生長(zhǎng)的脫分化的細(xì)胞在適當(dāng)條件下重新進(jìn)入有序生長(zhǎng)和分化狀態(tài)的過程。細(xì)胞再分化過程事實(shí)上是基因選擇性表達(dá)與修飾的人工調(diào)控過程。脫分化是細(xì)胞全能性表現(xiàn)的前提，再分化是細(xì)胞全能性的最終體現(xiàn)。復(fù)習(xí)題：1.名詞解釋：持家基因、組織特異性基因下篇?jiǎng)游锛?xì)胞工程

第11章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)制備藥用蛋白11.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（animalcellculture）

是模擬動(dòng)物體內(nèi)的生理環(huán)境使細(xì)胞分裂增殖的一種技術(shù)。體外培養(yǎng)原代培養(yǎng)（初代培養(yǎng)）傳代培養(yǎng)（繼代培養(yǎng)）原代培養(yǎng)（primaryculture）——在首次傳代前的培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞。傳代培養(yǎng)（passageculture/subculturing）——是指將原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的過程。細(xì)胞的體外大量增殖是通過傳代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)的。1907年，哈里森（Harrison）采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，保持存活了幾周時(shí)間，并觀察到細(xì)胞突起的生長(zhǎng)過程，開創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河。1923年，法國學(xué)者卡勒爾（Carred）設(shè)計(jì)的卡氏培養(yǎng)瓶成功地用于培養(yǎng)雞胚的心肌組織。1951年，厄爾利（Earle）等人開發(fā)了動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。20世紀(jì)70年代，發(fā)展起來的淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)使動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用進(jìn)入了一個(gè)新的領(lǐng)域。11.2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞屬于真核細(xì)胞，結(jié)構(gòu)和成分更復(fù)雜，功能也更全面。連接形式緊密連接間隙連接相對(duì)普遍橋粒連接隔壁連接無脊椎動(dòng)物細(xì)胞中間連接脊椎動(dòng)物細(xì)胞貼附非貼附動(dòng)物細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：⑴動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大，無細(xì)胞壁。⑵動(dòng)物細(xì)胞倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢。⑶培養(yǎng)過程需氧量少，對(duì)機(jī)械攪拌或剪切力敏感。⑷動(dòng)物細(xì)胞間主要以聚集體形式存在。⑸原代細(xì)胞一般繁殖50代左右即退化死亡。⑹動(dòng)物細(xì)胞對(duì)于營養(yǎng)要求更加苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，一般還需要血清。⑺對(duì)于培養(yǎng)環(huán)境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等。⑻細(xì)菌、真菌、病毒、支原體均可導(dǎo)致動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的污染。⑼絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞只有貼附在固體或半固體的表面才能生長(zhǎng)。11.2.1貼附型細(xì)胞貼附生長(zhǎng)是大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)的基本存在方式。細(xì)胞之間相互接觸細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合形成組織，細(xì)胞與周圍環(huán)境保持聯(lián)系。當(dāng)細(xì)胞布滿表面后即停止生長(zhǎng)。從生長(zhǎng)表面脫落進(jìn)入液體的細(xì)胞通常不再生長(zhǎng)而逐漸退化。貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞可用胰蛋白酶、酸、堿等試劑或機(jī)械方法使其脫落下來。還有一些細(xì)胞，既可貼壁生長(zhǎng)，也可懸浮生長(zhǎng)。按照體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不同：（一）成纖維型細(xì)胞細(xì)胞外形：與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形狀相似，細(xì)胞大致呈梭形或不規(guī)則形。貼壁后呈長(zhǎng)梭形，圓形核位于中央，胞質(zhì)外伸出2~3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、漩渦狀走向。多數(shù)細(xì)胞之間排列疏散，有較大的細(xì)胞間隙。有時(shí)也相互平行排列，成群細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀、漩渦狀等形式。起源于中胚層的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)一般表現(xiàn)為此種形式。（二）上皮型細(xì)胞泛指那些形狀上類似上皮細(xì)胞的細(xì)胞特點(diǎn)是：扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞貼壁后呈三角形即不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，生長(zhǎng)時(shí)彼此緊密連接成單層細(xì)胞。內(nèi)胚層與外胚層的細(xì)胞（三）游走型細(xì)胞具有類似巨噬細(xì)胞樣的特征。在支持物上分散生長(zhǎng)，一般不連接成片、形成群落；胞質(zhì)常伸出偽足和突起；在培養(yǎng)器皿壁上生長(zhǎng)位置不固定，呈活躍的游走和變形運(yùn)動(dòng)，速度快且方向不規(guī)則；細(xì)胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒。該類細(xì)胞不很穩(wěn)定，外形不規(guī)則且不斷變化。當(dāng)細(xì)胞密度增大、連接成片時(shí)，形狀類似于成纖維樣細(xì)胞型或上皮細(xì)胞型。具有吞噬作用的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，例如，顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等（四）多形型細(xì)胞形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞胞體：略呈多角形胞突：細(xì)長(zhǎng)形，類似絲狀偽足不常見，神經(jīng)原和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的主要因素包括：血清成分、培養(yǎng)基成分及添加成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣相環(huán)境、溫度等。體外培養(yǎng)的細(xì)胞并不一定呈現(xiàn)典型的形態(tài)形式，而多呈現(xiàn)的是一些過度性形態(tài)。11.2.2非貼附型細(xì)胞懸浮型細(xì)胞細(xì)胞密度一般都較高，培養(yǎng)的效率也高、操作也容易，因此易于大規(guī)模生產(chǎn)，便于過程的控制。形態(tài)學(xué)特點(diǎn)：胞體始終為球形白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等11.3培養(yǎng)工具與條件11.3.1工具多數(shù)為玻璃或無毒塑料制成的不同規(guī)格、類型的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)管等。多孔塑料培養(yǎng)板：6~96孔關(guān)鍵儀器：CO2培養(yǎng)箱，相差顯微鏡等目前，大多采用以微球（微載體）作為支持介質(zhì)，使附壁細(xì)胞的培養(yǎng)具有懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。11.3.2培養(yǎng)條件11.3.2.1溫度37℃實(shí)踐證明，細(xì)胞對(duì)低溫的耐受性要比對(duì)高溫的耐受性強(qiáng)些，低溫下會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)代謝速率降低；一經(jīng)恢復(fù)正常溫度時(shí)，則細(xì)胞會(huì)再行生長(zhǎng)。高溫對(duì)細(xì)胞的威脅甚大，若在40℃左右，則在幾小時(shí)內(nèi)細(xì)胞便會(huì)死亡。11.3.2.2pH最適為：7.2~7.4多數(shù)類型的細(xì)胞對(duì)偏酸性的耐受性較強(qiáng)，而在偏堿性的情況下則會(huì)很快死亡。11.3.2.3氣體O2CO2還有調(diào)節(jié)pH的作用一定濃度CO2便可以將培養(yǎng)環(huán)境中的氫離子濃度保持恒定以提供一個(gè)比較穩(wěn)定的pH范圍。11.3.3培養(yǎng)基對(duì)營養(yǎng)的要求很高滿足細(xì)胞進(jìn)行糖代謝、脂代謝、蛋白質(zhì)代謝及核酸代謝所需要的各種營養(yǎng)很多成分系用血清、胚胎浸出液等提供。10%胎牛或小牛血清血清使用前必須經(jīng)過鑒定，只有無菌、無內(nèi)毒素、無溶血或低溶血、蛋白質(zhì)以及營養(yǎng)素達(dá)一定標(biāo)準(zhǔn)以上的血清才能使用11.3.3.1天然培養(yǎng)基直接采用取自動(dòng)物體液或從組織中提取的成分作培養(yǎng)液。營養(yǎng)價(jià)值高，但是成分復(fù)雜，來源有限。血清、組織提取液、雞胚汁等血清——最有效和最常用的培養(yǎng)成分含有許多維持細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖和保持細(xì)胞生物學(xué)性狀不可缺少的成分。牛血清：胎牛血清——來源少，價(jià)格高小牛血清——?jiǎng)偖a(chǎn)下尚未哺乳的小牛馬血清血清中已知的主要成分：蛋白質(zhì)：白蛋白、球蛋白氨基酸：有12種是細(xì)胞本身不合成的，必須由培養(yǎng)液提供葡萄糖：激素等：胰島素、生長(zhǎng)激素和多種生長(zhǎng)因子表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）水解乳蛋白、膠原是兩種較好的天然培養(yǎng)基。0.5%溶液，微酸性。膠原是從動(dòng)物真皮中提取的，具有改善細(xì)胞表面特性促使其附著生長(zhǎng)作用。11.3.3.2合成培養(yǎng)基為了營造與細(xì)胞體內(nèi)相似的生長(zhǎng)環(huán)境，便于細(xì)胞體外生長(zhǎng)，厄爾利于1951年開發(fā)了MEM培養(yǎng)基成分已知，便于培養(yǎng)條件的控制，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展起了很大推動(dòng)作用。加入一定量的天然培養(yǎng)基：小牛血清和胎牛血清商業(yè)化培養(yǎng)基：MEM、DMEM、RPMI-1640、F12等11.3.3.3無血清培養(yǎng)基血清成分復(fù)雜，有些成分至今尚不清楚。血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)很有效，但后期對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測(cè)造成一定困難。另外高質(zhì)量的動(dòng)物血清來源有限，成本高，不宜大量使用。無血清培養(yǎng)基就是試圖全部采用已知成分，其中包括血清中的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，從而代替血清。無血清培養(yǎng)基不加動(dòng)物血清，在已知細(xì)胞所需營養(yǎng)物質(zhì)和貼壁因子基礎(chǔ)上，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入適宜的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，保證細(xì)胞的良好生長(zhǎng)。補(bǔ)充的生長(zhǎng)因子中，胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白幾乎是所用細(xì)胞株所必需的。激素胰島素、生長(zhǎng)激素、胰高血糖素、氫化考的松等是常用的補(bǔ)充因子。11.3.4常用溶液11.3.4.1平衡鹽水（BSS）生理鹽水+葡萄糖無機(jī)離子：細(xì)胞的組成成分具有維持細(xì)胞滲透壓、調(diào)控培養(yǎng)液酸、堿度平衡的功能。少量酚酞指示劑：pHHanks液和Earle液：常用BSS的基礎(chǔ)溶液。前者緩沖能力較弱，后者較強(qiáng)。11.3.4.2pH調(diào)整液pH調(diào)整液應(yīng)單獨(dú)配制，單獨(dú)滅菌，待滅菌后的培養(yǎng)基使用前再加入。可以保證營養(yǎng)成分的穩(wěn)定和延長(zhǎng)其保存期。常用pH調(diào)整液：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）液等。11.3.4.3細(xì)胞消化液（一）胰蛋白酶溶液分離自牛、豬等動(dòng)物胰臟的胰蛋白酶呈黃色粉末狀，極易潮解，注意冷藏干燥保存。能水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)0.125%和0.25%，用無Ca2+和Mg2+的溶液配制，調(diào)pH6.8~7.2之間。消化細(xì)胞結(jié)束時(shí)，加入少量血清或含血清的培養(yǎng)基終止酶作用。（二）乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液EDTA為一種化學(xué)螯合劑，其溶液又稱為Versen液。具一定的非酶性解離作用因經(jīng)濟(jì)方便、毒性小、易配制而成為常用的消化液0.02%（個(gè)別細(xì)胞系要求濃度較高）EDTA與胰蛋白酶：1:1或2:1效果更好鏈酶蛋白酶、骨膠原酶、透明質(zhì)酸酶等也可用于消化細(xì)胞。因價(jià)格昂貴、保存困難，只用于特殊種類的細(xì)胞消化。（三）抗生素溶液防止微生物污染青霉素——抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成鏈霉素、卡那霉素——抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成制霉菌素——能干擾細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的合成11.4體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖過程體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)生存空間和營養(yǎng)都是有限的。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一般經(jīng)過組織獲得、組織消化、接種、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)幾個(gè)過程。（一）原代（初代）培養(yǎng)期從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)1~4周細(xì)胞比較活躍，有細(xì)胞分裂，但不旺盛。多呈2n（二）傳代期原代培養(yǎng)一經(jīng)傳代后便稱為細(xì)胞系。10~50次后，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止。（三）衰退期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖。細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后開始衰退凋亡。11.4.1原代培養(yǎng)11.4.1.1組織塊培養(yǎng)處死動(dòng)物，取出組織塊放入小燒杯中，用尖嘴眼科剪刀將組織塊剪碎成1mm3大小，用吸管吸取Hanks液沖下剪刀上的碎塊，補(bǔ)加3~5mLHanks液，吸管輕輕吹打，低速離心，棄上清液，留下組織塊。用兩只手術(shù)刀片將組織切碎，這樣對(duì)細(xì)胞損傷較小，但操作時(shí)間長(zhǎng)，容易污染。對(duì)某些軟組織如腫瘤、胚胎、腦等可將碎組織塊放入注射器玻璃管中擠壓分離。用1mm、10μm、20μm三種規(guī)格的不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩擠壓分離。待準(zhǔn)備好培養(yǎng)瓶后，用彎頭吸管吸出組織塊一一放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（間隔0.5cm為宜），使其貼在瓶壁上，貼有組織塊的瓶壁朝上，加入培養(yǎng)液。塞上瓶塞，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使瓶液慢慢覆蓋組織塊，置于37℃11.4.1.2組織消化培養(yǎng)（一）取材與消化用酶解方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。胰蛋白酶：適用于細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、羊膜、上皮、肝、腎等。方法：將剪碎的組織塊放入有玻璃珠的三角燒瓶中，加入30~50倍體積的0.25%濃度胰蛋白酶。37℃水浴內(nèi)消化30~60min，每5~10min搖動(dòng)一次，根據(jù)效果可中間更換消化液。Hanks液漂洗兩次，每次2~3min。800r/min離心5min，棄上清液，加入營養(yǎng)液，如有大塊，可用紗網(wǎng)過濾。如消化傳代細(xì)胞，可與EDTA混用。膠原酶對(duì)膠原和細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化作用，適用于消化纖維組織、上皮組織、癌組織等。此酶不受Ca2+和Mg2+的螯合作用，可用BSS和含血清培養(yǎng)基配制成200單位/mL或0.1~0.3mg/mL濃度，作用溫和，無需機(jī)械震蕩。方法：向培養(yǎng)瓶中放入1~5mm3大小碎組織塊，加5mL2000單位/mL的膠原酶液，使終濃度為200單位/mL，pH6.5；36.5℃水浴4~48h，視情況可適當(dāng)延長(zhǎng)，無需搖動(dòng)，期間可更換酶液一次；當(dāng)組織塊已變軟，分散于瓶底，輕微震蕩即散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞，小心吸出培養(yǎng)液，瓶底可能附著一些巨噬細(xì)胞，借此可將其分開，單獨(dú)培養(yǎng)或棄之不用；800r/min離心5min，棄上清液，重懸于BSS鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等也可用于培養(yǎng)細(xì)胞的消化，需根據(jù)酶的作用特點(diǎn)及組織成分的不同適當(dāng)選用。（二）培養(yǎng)與檢查每1~2天檢查內(nèi)容：是否污染、生長(zhǎng)狀況、培養(yǎng)液的pH等，并根據(jù)情況及時(shí)處理。貼壁細(xì)胞⑴檢查細(xì)胞形態(tài)及活力：倒置顯微鏡狀態(tài)良好的細(xì)胞：輪廓形態(tài)不十分清晰，較透明生長(zhǎng)不良的細(xì)胞：輪廓反而變清，細(xì)胞間隙增大，胞內(nèi)有空泡、脂滴、顆粒等出現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。細(xì)胞活力=活細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)百分比⑵檢查營養(yǎng)液pH及污染：新鮮培養(yǎng)液呈桃紅色，pH在7.2~7.45%的CO2的含量細(xì)胞培養(yǎng)危害最大又不易發(fā)現(xiàn)是支原體污染：個(gè)體小0.25~1μm，能透過漏斗11.4.2傳代培養(yǎng)當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞分裂增殖擴(kuò)展成片，即將占滿器皿表面時(shí)需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。80%~90%或剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞是傳代培養(yǎng)的理想時(shí)期。根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn)，掌握適當(dāng)?shù)募?xì)胞消化時(shí)間和選擇適宜的方法很關(guān)鍵。⑴吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。⑵加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底。⑶2~5min后檢查，如有細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞質(zhì)回縮現(xiàn)象，加入含血清的新鮮培養(yǎng)基終止消化（血清中含有抗蛋白酶成分）。⑷吸出消化液，加入Hanks液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以免細(xì)胞流失，洗去殘留的消化液。⑸用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落制成懸液，計(jì)數(shù)后記錄其濃度。⑹重新接種培養(yǎng)。11.5細(xì)胞株與保存有限細(xì)胞系（finitecellline）不能連續(xù)培養(yǎng)的為~。連續(xù)細(xì)胞系（infinitecellline）——無限系能連續(xù)培養(yǎng)下去的為~。無限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。11.5.1分類用于生產(chǎn)的動(dòng)物細(xì)胞株包括原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞、連續(xù)細(xì)胞系、融合細(xì)胞和重組細(xì)胞。11.5.1.1原代細(xì)胞1949年，恩德斯（Enders）利用胚胎組織細(xì)胞生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)滅活疫苗生產(chǎn)。用的較多的：雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞或鼠腎細(xì)胞、血液淋巴細(xì)胞。缺點(diǎn)：需要大量動(dòng)物組織、成本高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等。11.5.1.2二倍體細(xì)胞具有正常細(xì)胞的特點(diǎn)：二倍體染色體，貼壁和接觸抑制特性，有限的增殖能力，無致瘤性。一般從動(dòng)物的胚胎中分離。第一批獲得批準(zhǔn)用于脊髓灰質(zhì)滅活疫苗生產(chǎn)的二倍體細(xì)胞：WI-38、MRC-5等。屬于有限細(xì)胞系，傳代次數(shù)一般都不超過50代。11.5.1.3融合細(xì)胞通過細(xì)胞融合技術(shù)可得到具有兩親本特征的細(xì)胞，例如雜交瘤細(xì)胞11.5.1.4基因工程細(xì)胞將編碼藥用蛋白質(zhì)的基因重組到動(dòng)物細(xì)胞構(gòu)建的基因工程細(xì)胞，多應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞生物制藥。11.5.1.5轉(zhuǎn)化細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)化：細(xì)胞發(fā)生遺傳改變而產(chǎn)生永生化，可以在體外進(jìn)行無限傳代和生長(zhǎng)繁殖。轉(zhuǎn)化一般轉(zhuǎn)化：與癌變不同，沒有致瘤性惡性轉(zhuǎn)化生產(chǎn)方式上細(xì)胞自轉(zhuǎn)化人工誘發(fā)轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化后遺傳特性、生長(zhǎng)特性、生物學(xué)特性都可能會(huì)發(fā)生改變20世紀(jì)50年代建立了一些可無限傳代的細(xì)胞系。轉(zhuǎn)化細(xì)胞于20世紀(jì)80年代獲得批準(zhǔn)用于生產(chǎn)。優(yōu)點(diǎn)：與原代細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有生長(zhǎng)快速、細(xì)胞類型均一等。轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有無限的增殖能力，倍增時(shí)間短，對(duì)培養(yǎng)條件要求低，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)需要。11.5.2常用細(xì)胞株㈠CHO細(xì)胞（Chinesehamsterovarycell）從中國倉鼠卵巢分離的細(xì)胞，亞二倍體，有多種突變株。貼壁生長(zhǎng)，也可以懸浮培養(yǎng)，對(duì)剪切力和滲透壓改變有較高的忍受能力。㈡Vero細(xì)胞（verocell）1962年日本從非洲綠猴腎中分離的細(xì)胞，成上皮型，異倍體，貼壁型，是最常用的大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞之一。㈢BHK-21細(xì)胞（babyhamsterkidneycell）1961年英國從幼地鼠的腎臟分離的細(xì)胞。成纖維樣，異倍體。常用于病毒疫苗和重組蛋白。㈣WI-38細(xì)胞1961年Wister38研究所從女性高加索人胚肺組織中獲得的一株2倍體細(xì)胞。成纖維細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)，倍增時(shí)間為24h，有限壽命為50代。對(duì)許多病毒敏感，被用于生產(chǎn)人用病毒疫苗。11.5.3細(xì)胞冷凍保存低溫冷凍保存法，其中程序性逐級(jí)冷凍比較常用：⑴細(xì)胞經(jīng)消化分散后，用冷凍保護(hù)液冷卻，同時(shí)將細(xì)胞懸液稀釋成2×106~5×106cells/mL。冷凍保護(hù)液：含10%血清的培養(yǎng)液中加10%甘油或7.5%~10%二甲亞砜（DMSO）冷凍保護(hù)液的作用：結(jié)合細(xì)胞中的水分子，降溫時(shí)減少細(xì)胞內(nèi)冰晶分子的形成，避免對(duì)細(xì)胞造成傷害。長(zhǎng)期低溫保存細(xì)胞，采用DMSO對(duì)二倍體細(xì)胞毒性小，保護(hù)作用效果要好于甘油。⑵按1mL/安瓶的量分裝細(xì)胞懸液，在火焰下將安瓶封口。如果裝量過大，保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞滲透作用不均，冷凍效果不好。⑶將封口的安瓶放入慢凍機(jī)內(nèi)，按每min下降1℃的速度緩慢冷凍。溫度降至-25℃。⑷凍結(jié)好的安瓶放入CO2低溫冰柜或液氮罐中。溫度達(dá)-190~-150℃。⑸如果需要復(fù)蘇，可將安瓶取出后立即放入37℃水浴中，使其快速融化。在加保護(hù)劑的條件下，慢凍快融是保存復(fù)蘇細(xì)胞的要領(lǐng)。11.6動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)11.6.1懸滴培養(yǎng)是組織、器官培養(yǎng)的經(jīng)典方法哈里森（Harrison）1907年創(chuàng)立將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營養(yǎng)液懸掛在蓋玻片下，再置放于一凹形載片之上，最后用熔蠟密封后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。11.6.2灌注小室培養(yǎng)1912年伯羅（Burrows）由上下兩個(gè)蓋玻片（上壁與下壁）與一金屬圈（側(cè)壁）密封圍成的小室內(nèi)，保持在一定條件下培養(yǎng)。在小室的側(cè)面分別有液體流入和流出的開口，供新鮮培養(yǎng)液流入小室和舊培養(yǎng)液排除。特點(diǎn)：營養(yǎng)液可以循環(huán)供應(yīng)。灌注小室培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞生長(zhǎng)可以盡量少受代謝產(chǎn)物積累的影響。后來的許多大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)在設(shè)計(jì)原理上都參考了灌注小室培養(yǎng)的原理。11.6.3培養(yǎng)瓶培養(yǎng)卡雷爾（Carrel）于1923年設(shè)計(jì)了卡氏瓶，硼硅酸玻璃11.6.4培養(yǎng)板培養(yǎng)常規(guī)方法之一最常用的培養(yǎng)板：6、12、24、48和96孔11.6.5轉(zhuǎn)管培養(yǎng)靜止培養(yǎng)時(shí)營養(yǎng)、氣體、代謝產(chǎn)物的吸收、排放等基本都是通過擴(kuò)散進(jìn)行的，具有很多不足1933~1934年，蓋爾（Gey）和劉易斯（Lewis）將培養(yǎng)物接種于一管狀培養(yǎng)器皿中，再將其固定在一可以旋轉(zhuǎn)的裝置上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。培養(yǎng)物可以交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境，利于細(xì)胞或組織成長(zhǎng)，但不宜在顯微鏡下觀察。也可以將培養(yǎng)物接種于載玻片上，再放入旋轉(zhuǎn)管內(nèi)培養(yǎng)，然后取出觀察、染色、保存。11.6.6轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)為了擴(kuò)大細(xì)胞產(chǎn)量轉(zhuǎn)瓶固定在支架上，傾斜度為5°~10°左右，或?qū)⑥D(zhuǎn)瓶放在一排排轉(zhuǎn)軸之間，使轉(zhuǎn)瓶隨著轉(zhuǎn)軸以每小時(shí)6~12轉(zhuǎn)緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)。細(xì)胞貼附于玻璃壁四周，通過轉(zhuǎn)動(dòng)可使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，營養(yǎng)可被充分利用。11.7動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)11.7.1懸浮培養(yǎng)將采集到的活體動(dòng)物組織分散、過濾、離心、純化后接種到有適宜培養(yǎng)液中，置于特定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。細(xì)胞增殖快、產(chǎn)量高、培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單，是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的理想模式。11.7.2微載體培養(yǎng)11.7.2.1微載體特點(diǎn)滾瓶培養(yǎng)：勞動(dòng)強(qiáng)度大、占用空間大而提供面積有限、相對(duì)細(xì)胞產(chǎn)率較低、監(jiān)控不便等不足。1967年，維茨爾（VanWezel）開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，一定程度上改變了這些不足。實(shí)心微載體多孔微載體等理想的微載體應(yīng)該具備以下幾個(gè)特征：⑴良好的生物相容性、無毒無害。⑵有好的粘附性，一般帶正電荷。⑶大的比表面積，顆粒均勻，孔徑均一。⑷良好的傳質(zhì)性能。⑸強(qiáng)的機(jī)械性能。⑹好的熱穩(wěn)定性。11.7.2.2多孔微載體傳統(tǒng)的實(shí)心微載體：在培養(yǎng)后期細(xì)胞由于老化而降低了貼壁能力，容易從微載體中脫落下來，同時(shí)細(xì)胞貼壁需要血清幫助。多孔微載體是近年來發(fā)展起來的一種用于大規(guī)模高密度動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的支持物，其內(nèi)部具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔，因此能使細(xì)胞在其內(nèi)部生長(zhǎng)，可降低血清用量。具有許多優(yōu)點(diǎn)：易固定化；大的比表面積保證細(xì)胞充分的生長(zhǎng)空間；細(xì)胞生長(zhǎng)在載體內(nèi)部，能使細(xì)胞免受機(jī)械損傷，同時(shí)又可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。也適合于懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)，可應(yīng)用于大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。以高溫?zé)Y(jié)法制備多孔陶瓷載體（2MgO·2Al2O3·5SiO2）為例：⑴一定比例的高嶺土、云母、礬土、氫氧化鋁和二氧化硅碾成細(xì)末并充分混合，加入甲基纖維素水溶液制成漿液，在一定壓力下通過模具將漿液擠壓成合適大小的球狀顆粒并干燥。⑵然后在高于1000℃的溫度下燒結(jié)幾個(gè)小時(shí)形成一定大小的陶瓷小顆粒。小顆粒內(nèi)部的微孔主要是通過其中的云母含量來控制。將陶瓷小顆粒加熱至1400℃，熔化其中的云母便形成多孔陶瓷載體，經(jīng)篩分、酸洗、堿洗之后就可以制成成品。11.7.2.3微載體培養(yǎng)細(xì)胞的步驟㈠選擇合適的微載體類型比較幾種不同的微載體的細(xì)胞貼壁率、細(xì)胞容納量、微載體用量、攪動(dòng)速度等，選擇合適的微載體。㈡浸泡水化及消毒在玻璃容器中加入適量的微載體，按50~100mg/g的比例加入無Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液（PBS）浸泡3h以上，輕輕攪動(dòng)。然后按一半的新鮮PBS量再洗一次。高壓蒸汽滅菌1.0×105Pa，15min。㈢接種根據(jù)細(xì)胞類型決定接種濃度，不同的細(xì)胞種類及細(xì)胞株接種濃度不盡相同，例如：人成纖維細(xì)胞的適宜接種濃度為10cells/微載體；非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）為5cells/微載體。㈣培養(yǎng)觀察與細(xì)胞計(jì)數(shù)顯微鏡下直接觀察微載體上細(xì)胞生長(zhǎng)情況。也可將微載體上的細(xì)胞消化下來計(jì)數(shù)。㈤消化與細(xì)胞回收酶消化法細(xì)胞在堿性環(huán)境下貼壁較差，消化前先去掉已經(jīng)變酸性的培養(yǎng)液，再在pH7.6的酶液中消化解離微載體上的細(xì)胞。停止攪動(dòng)，待微載體沉淀后，去盡培養(yǎng)液，用含0.25%（W/V）EDTA的PBS（pH6.7），按50~100mL/g微載體量清洗微載體，棄EDTA-PBS，加入胰蛋白酶-EDTA，37℃攪動(dòng)消化15min后，加入含10%血清的培養(yǎng)液，按20~30mL/g微載體量，終止消化作用，細(xì)胞脫落。采用低滲液進(jìn)行處理，雖回收率較低，但是不含外源蛋白。用不含血清的培養(yǎng)液4℃低溫培養(yǎng)8h，大部分細(xì)胞會(huì)自行脫落，但細(xì)胞活性會(huì)受一定影響。利用超聲波結(jié)合其他方法可提高細(xì)胞回收率。㈥細(xì)胞收獲采用分組離心沉降收獲細(xì)胞。將含微載體的培養(yǎng)液放入細(xì)長(zhǎng)容器，與上清液中分離收集細(xì)胞，400r/min，2min離心可加速微載體沉淀。也可用過濾方法，采用100μm孔徑的尼龍網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)、多孔玻璃濾器等可將細(xì)胞與微載體分離開。㈦傳代培養(yǎng)微載體分離下來的細(xì)胞可進(jìn)一步傳代培養(yǎng)。如果做放大培養(yǎng)，可在細(xì)胞脫離微載體后，加入一些新的微載體以增大培養(yǎng)體積，也可在微載體長(zhǎng)滿細(xì)胞后直接加入微載體進(jìn)行“球傳球”傳代培養(yǎng)。11.7.3中空纖維法理查德·克瑞克等在1972年發(fā)明的。最初使用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合物組成的可透性膜，表面有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)。這樣細(xì)胞能在上面貼附生長(zhǎng)，水分子、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以透過。動(dòng)物細(xì)胞代謝所需的營養(yǎng)都是由毛細(xì)血管供給的。前面介紹的大多數(shù)培養(yǎng)技術(shù)中細(xì)胞生長(zhǎng)在二維空間里（單層生長(zhǎng)，接觸抑制）。中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用人工的“毛細(xì)血管”——中空纖維來供給細(xì)胞生長(zhǎng)的營養(yǎng)。培養(yǎng)系統(tǒng)的核心部分由3~6層空心纖維組成，培養(yǎng)時(shí)將待培養(yǎng)細(xì)胞接種于空心纖維的外腔。由于這種培養(yǎng)方法在分離和純化分泌物時(shí)比較方便，因而在生產(chǎn)激素和單克隆抗體時(shí)經(jīng)常采用。目前已開發(fā)出由硅膠、聚砜、聚丙烯等材料構(gòu)建的空心纖維培養(yǎng)系統(tǒng)。11.8動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器11.8.1生物反應(yīng)器特點(diǎn)⑴混合系統(tǒng)設(shè)計(jì)應(yīng)能提供均勻、溫和的混合狀態(tài)，剪切力小，保證良好的傳質(zhì)效果。⑵反應(yīng)器內(nèi)空間利用率高，選用合適的載體系統(tǒng)和材料。⑶能嚴(yán)格保證無菌環(huán)境。⑷能精確地控制溫度、酸堿度、溶解氧和CO2濃度等條件⑸能夠方便、快捷地實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液的連續(xù)添加、樣品的采樣和觀察。11.8.2生物反應(yīng)器類型㈠柱狀中空纖維反應(yīng)器主體：微孔中空纖維管束。纖維束由外殼包裹，反應(yīng)器可分為中空內(nèi)腔與中空外腔兩部分，每部分各有其進(jìn)出口。殼體部分的細(xì)胞如是附壁性的，則附著在中空纖維外側(cè)。培養(yǎng)結(jié)束后用胰蛋白酶消化將其消化并沖出。若是非附壁性的應(yīng)采用微濾材料將其截留在殼體內(nèi)。㈡板框式中空纖維反應(yīng)器柱狀中空纖維反應(yīng)器缺點(diǎn)：營養(yǎng)供應(yīng)和代謝產(chǎn)物會(huì)存在濃度梯度，所以細(xì)胞分布不均勻，限制了培養(yǎng)系統(tǒng)的進(jìn)一步放大。板框式中空纖維反應(yīng)器：中心是一束中空纖維淺床，置于兩個(gè)不銹鋼微孔濾板之間，營養(yǎng)液通過濾板垂直流向纖維床平面。雖然一定程度上克服了柱狀中空纖維反應(yīng)器的不足，但是因?yàn)橹锌绽w維淺床厚度有限，因而培養(yǎng)系統(tǒng)也不可能太大。㈢中心灌流式反應(yīng)器1986年，撒瑞克恩等設(shè)計(jì)出一種從反應(yīng)器中央輻射狀供應(yīng)營養(yǎng)液的反應(yīng)器。該反應(yīng)器中央為一多孔狀管道，稱為中央分配管。分配管的外周包圍著多層與其平行排列的中空纖維。培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，營養(yǎng)液從分配管的兩端進(jìn)入反應(yīng)器，再由孔流出、穿過中空纖維的壁進(jìn)入中空纖維內(nèi)部。中空纖維內(nèi)通入氣體，一方面帶動(dòng)營養(yǎng)液流動(dòng)，另一方面進(jìn)行氣體交換。附著在中空纖維表面生長(zhǎng)的細(xì)胞既能從流動(dòng)的營養(yǎng)液吸取營養(yǎng)，又能同時(shí)進(jìn)行氣體交換。這樣，細(xì)胞生長(zhǎng)的營養(yǎng)環(huán)境比較均勻，代謝產(chǎn)物也能及時(shí)排出。㈣灌流微載體生物反應(yīng)器這是一種將微載體培養(yǎng)與中空纖維培養(yǎng)相結(jié)合而形成的一種培養(yǎng)裝置。1984年，斯特蘭德（Strand）把微載體放入中空纖維反應(yīng)器，從而設(shè)計(jì)出利用中空纖維提供營養(yǎng)液的灌流微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)。㈤旋轉(zhuǎn)壁式反應(yīng)器一般由水平放置的內(nèi)外兩個(gè)同心圓柱組成。內(nèi)柱：靜態(tài)，由半透膜構(gòu)成，氣體交換。外柱：旋轉(zhuǎn)，由非通透性材料制成。內(nèi)外柱之間充以培養(yǎng)介質(zhì)。通過調(diào)節(jié)外柱的轉(zhuǎn)速，使得旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力剛好與重力平衡。（16.3.1）11.9動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的影響因素主要問題：①細(xì)胞密度低，產(chǎn)物濃度低。②細(xì)胞在大規(guī)模、長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物能力下降。③動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體成本高。④目前對(duì)細(xì)胞代謝途徑和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究比較欠缺。⑤在線檢測(cè)水平技術(shù)不完善。11.9.1氨氨離子的積累是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的主要因素之一。氨的積聚使細(xì)胞內(nèi)UDP氨基己糖（UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺）增加，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)及蛋白的糖基化過程。氨抑制谷氨酰胺（Gln）代謝途徑，使天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）消耗增加。11.9.2乳酸乳酸是細(xì)胞糖代謝的產(chǎn)物。高濃度乳酸會(huì)抑制乳酸脫氫酶（LDH）。→阻止了NADH向NAD的轉(zhuǎn)化及其偶聯(lián)的丙酮酸/乳酸轉(zhuǎn)換，→NADH增加，→部分抑制糖酵解?！鶪ln消耗減少。由于糖酵解和Gln的分解速度降低，能量產(chǎn)生減少，更多的能量用于維持離子濃度梯度，→高乳酸濃度會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。由于Gln和葡萄糖代謝的相互影響，降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度以減少乳酸產(chǎn)生的同時(shí)，必須平衡葡萄糖和Gln的比例。11.9.3甲基乙二醛甲基乙二醛（MGO）主要是丙糖磷酸去除磷酸基后的代謝產(chǎn)物，也是脂類、氨基酸代謝的產(chǎn)物，對(duì)于細(xì)胞有潛在的損傷作用。MGO能改變氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸的氨基和巰基。細(xì)胞內(nèi)MGO的水平由乙二醛縮酶和還原酶兩種酶來平衡，代謝途徑是糖酵解途徑。葡萄糖濃度很高（100mmol/L）時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MGO幾乎是正常培養(yǎng)條件下的兩倍。增加培養(yǎng)基中谷氨酰胺濃度也會(huì)引起MGO增加。通過流加培養(yǎng)限制葡萄糖用量，由此來降低細(xì)胞內(nèi)MGO濃度。培養(yǎng)基中加入胎牛血清也可降低MGO濃度。11.9.4二氧化碳隨著細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模和培養(yǎng)密度的增大CO2會(huì)積聚，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性或者改變細(xì)胞代謝水平。在一定的pH條件下，CO2分壓升高會(huì)使培養(yǎng)基滲透壓升高。通過控制通氣量，平衡氧的輸送及CO2的去除，可防止生物反應(yīng)器中CO2積聚。11.9.5滲透壓高滲透壓不僅影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短、細(xì)胞死亡的速度，而且會(huì)影響某些代謝產(chǎn)物積累。在培養(yǎng)基中加入諸如甘氨酸、甜菜堿、三甲基甘氨酸或脯氨酸等滲透壓保護(hù)劑可在一定程度上能減輕高滲透壓對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。11.9.6載體多孔微載體內(nèi)部空間必須保證細(xì)胞能夠進(jìn)入生長(zhǎng)。對(duì)于有些細(xì)胞株盡管能貼在微載體內(nèi)，但“移動(dòng)性”很差。需提高微孔的開放性或者改善其表面特性，從而提高細(xì)胞貼壁率同時(shí)增加細(xì)胞移動(dòng)性。11.9.7細(xì)胞死亡與凋亡在生物反應(yīng)器中細(xì)胞死亡主要原因是細(xì)胞凋亡，多是在營養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多時(shí)發(fā)生。保證營養(yǎng)供給不能夠及時(shí)排除有害代謝產(chǎn)物積累有助于減少細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡抑制基因bcl-2的過量表達(dá)能抑制Gln或氧缺乏引起的細(xì)胞凋亡。11.9.8參數(shù)控制溫度、pH、溶解氧濃度是細(xì)胞培養(yǎng)的重要控制參數(shù)。此外，可通過在線測(cè)量氧吸收速率確定細(xì)胞生長(zhǎng)期、病毒感染期和終止感染時(shí)間；可用在線葡萄糖分析儀測(cè)定調(diào)整灌流速度；測(cè)定氧消耗估計(jì)代謝負(fù)荷。11.10動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白轉(zhuǎn)基因微生物在生產(chǎn)分子質(zhì)量較小、結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的異源蛋白方面具有優(yōu)越性。微生物表達(dá)復(fù)雜真核蛋白時(shí)存在折疊方式不正確、缺乏翻譯后加工修飾等缺陷。大多數(shù)哺乳動(dòng)物蛋白翻譯后的糖基化、磷酸化和乙?；刃揎検潜３稚飳W(xué)活性、穩(wěn)定性及抗原性的前提。動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)可以較好地解決這些微生物表達(dá)系統(tǒng)的問題，進(jìn)行有效的蛋白質(zhì)的折疊和加工，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物制藥的重要途徑。11.10.1轉(zhuǎn)基因方法物理化學(xué)生物⑴暫時(shí)轉(zhuǎn)染：質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中不停留很長(zhǎng)時(shí)間，DNA被轉(zhuǎn)錄為mRNA，隨后被翻譯成蛋白質(zhì)，并不進(jìn)入細(xì)胞基因組。磷酸鈣沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂質(zhì)體載體法⑵永久性轉(zhuǎn)染：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法11.10.1.1物理法電穿孔法：簡(jiǎn)單、效率較高。利用脈沖電場(chǎng)提高細(xì)胞膜的通透性，在細(xì)胞膜上形成納米級(jí)的微孔，達(dá)到增加通透性的效果，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。11.10.1.2化學(xué)方法主要原理：改變細(xì)胞膜的通透性或者增加DNA與細(xì)胞的吸附而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。㈠DEAE-葡聚糖法（高分子碳水化合物）最早的動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)化率低DNA鏈上帶負(fù)電的磷酸骨架便被吸附于DEAE的正電荷基團(tuán)上，從而形成DNA大顆粒。后者粘附于受體細(xì)胞表面，并通過胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。㈡磷酸鈣-DNA共沉淀法這種方法是受二價(jià)金屬離子能促進(jìn)細(xì)菌吸收外源DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來的。大致步驟：將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在磷酸根離子的緩沖液中，在特定pH條件下（一般為7.1）加入氯化鈣溶液混合均勻。此時(shí)磷酸鈣與DNA共沉淀形成大顆粒。加入受體細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后，DNA就通過細(xì)胞膜脂相收縮時(shí)裂開的空隙進(jìn)入細(xì)胞，或者在鈣、磷的誘導(dǎo)作用下被細(xì)胞吞噬而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。㈢脂質(zhì)體載體包埋法將需轉(zhuǎn)移的外源DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)。由于脂質(zhì)體具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜類似，因此可以與受體細(xì)胞膜融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。效率高11.10.1.3生物學(xué)方法主要是指病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。常用的：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA病毒載體（腺病毒載體、牛痘病毒載體等）優(yōu)點(diǎn)：宿主范圍廣對(duì)受體細(xì)胞分裂周期要求不嚴(yán)外源基因在載體上容易高效表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種整合型的單鏈RNA病毒。病毒進(jìn)入細(xì)胞后，RNA首先編碼出反轉(zhuǎn)錄酶，在該酶作用下，病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA分子，DNA通過一種尚未明確的機(jī)制整合到宿主細(xì)胞DNA中。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以獲得穩(wěn)定、有效的轉(zhuǎn)染。缺陷：所有病毒載體都會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生一定程度的免疫反應(yīng)；或多或少存在一定的安全隱患。牛乳頭瘤病毒（BPV）載體是一種小雙鏈DNA病毒，其基因組為7945bp。轉(zhuǎn)錄為單向性可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)外源基因，而質(zhì)粒DNA并不整合入宿主的基因組BPV表達(dá)載體插入的外源DNA的大小沒有限制，既可表達(dá)基因組DNA，也可表達(dá)cDNA序列；一般用于建立穩(wěn)定的細(xì)胞系；可帶有顯性選擇標(biāo)記基因。11.10.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率較低，必須選用來源豐富、在體外能無限生長(zhǎng)的細(xì)胞作為受體細(xì)胞。即使在最佳轉(zhuǎn)化條件下，得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株也很少，因此必須建立動(dòng)物特異性選擇標(biāo)記用于快速有效地篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。一些選擇標(biāo)記基因如下：⑴胸腺嘧啶核苷激酶（TK）：當(dāng)轉(zhuǎn)入TK-細(xì)胞時(shí)，其基因產(chǎn)物可使宿主細(xì)胞獲得對(duì)HAT培養(yǎng)液的抗性。⑵氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH）：APH由aph基因編碼，幾乎可轉(zhuǎn)入任何宿主細(xì)胞，這一顯性選擇標(biāo)記可賦予細(xì)胞對(duì)氨基糖苷類抗生素抗性。⑶潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH）：hph基因編碼，幾乎可轉(zhuǎn)入任何類型的細(xì)胞，陽性細(xì)胞則可獲得潮霉素B抗性。⑷二氫葉酸還原酶（DHFR）：缺失DHFR的CHO細(xì)胞不能合成四氫葉酸，只能在添加胸苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)液上生長(zhǎng)。11.10.3外源基因表達(dá)11.10.3.1短時(shí)表達(dá)外源基因的表達(dá)一般發(fā)生在目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞后的12~72h，質(zhì)粒載體并不整合入宿主細(xì)胞基因組。短時(shí)表達(dá)的目的在于短期內(nèi)獲得大量的爆發(fā)式的基因表達(dá)，因而當(dāng)大量DNA樣本在短期內(nèi)需要檢測(cè)時(shí)，短時(shí)表達(dá)是較好的選擇。主要缺點(diǎn)：不能整合入宿主細(xì)胞基因組以穩(wěn)定表達(dá)外源基因。必須通過反復(fù)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的宿主細(xì)胞來獲得需要的目的蛋白。11.10.3.2穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染DNA需整合入宿主細(xì)胞染色體。經(jīng)歷一系列非同源分子間重組和連接形成大的串聯(lián)狀結(jié)構(gòu)，最終整合進(jìn)細(xì)胞染色質(zhì)。11.10.3.3目標(biāo)蛋白高效表達(dá)的策略氨甲喋呤（Mtx）是動(dòng)物細(xì)胞關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶（DHFR）的抑制劑。在表達(dá)載體上安裝病毒或細(xì)胞來源的強(qiáng)啟動(dòng)子及有效的翻譯起始信號(hào)也是外源基因高效表達(dá)的一種手段。細(xì)胞巨化病毒CMV啟動(dòng)子、動(dòng)物細(xì)胞珠蛋白基因的內(nèi)含子、SV40的polyA信號(hào)系列等基因表達(dá)元件11.10.3.4動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)藥源蛋白的應(yīng)用第一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的藥用蛋白是溶血栓藥物組織型纖維酶原激活劑（tPA）。將人的tPAcDNA克隆在含有強(qiáng)啟動(dòng)子和終止子的表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用氨甲喋呤處理培養(yǎng)，tPA隨著dhfr基因大量擴(kuò)增，新篩選出的轉(zhuǎn)化株進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)高水平生產(chǎn)人的重組tPA。復(fù)習(xí)題簡(jiǎn)述微載體培養(yǎng)技術(shù)的特點(diǎn)？以一個(gè)例子說明動(dòng)物細(xì)胞在生物制藥中的應(yīng)用？定義：原代培養(yǎng)？傳代培養(yǎng)？第12章雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體12.1雜交瘤技術(shù)（hydridomatechnique）將骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞融合得到既能夠分泌抗體又能在體外長(zhǎng)期繁殖的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過克隆化培養(yǎng)得到可以分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，這種技術(shù)通稱為~。此技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。1975年，英國的科勒（Kohler）和米爾斯坦（Milstein）合作將以適應(yīng)于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）進(jìn)行融合，發(fā)現(xiàn)形成的雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征：既能像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外無限地增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體，通過克隆化培養(yǎng)可獲得純的細(xì)胞就可以生產(chǎn)單克隆抗體。12.2單克隆抗體12.2.1多克隆抗體與單克隆抗體抗原（antigen）：是進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用的外源物質(zhì)。包括蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒、細(xì)菌等?？贵w（antibody）：是動(dòng)物免疫系統(tǒng)分泌的中和或消除抗原物質(zhì)影響的糖蛋白。高等動(dòng)物的脾臟能產(chǎn)生多種淋巴細(xì)胞，其中B淋巴細(xì)胞是能形成抗體的細(xì)胞。一種抗原通常具有多個(gè)不同的抗原決定簇，能刺激多個(gè)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對(duì)不同抗原決定簇的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體（PcAb）。采用常規(guī)免疫方法制備的免疫血清抗體是多克隆抗體，存在特異性差、效價(jià)低、數(shù)量有限、動(dòng)物間個(gè)體差異大，難以重復(fù)制備等缺陷。單克隆抗體（McAb）：經(jīng)過免疫的哺乳類動(dòng)物單一的B淋巴細(xì)胞可以分泌單一性抗體，這種具有特異性的、同質(zhì)性的抗體為~。與多可隆抗體相比，單克隆抗體只識(shí)別并結(jié)合特定的抗原決定簇，因此它對(duì)抗原的反應(yīng)具有高度特異性。由于很難從多克隆抗體中分離純化得到單克隆抗體，也很難將體內(nèi)受抗原刺激的不同B淋巴細(xì)胞分開并在體外維持生長(zhǎng)增殖并分泌抗體。因此，很難通過體外培養(yǎng)單一B淋巴細(xì)胞獲得單克隆抗體。12.2.2單克隆抗體的生產(chǎn)途徑㈠細(xì)胞融合將免疫動(dòng)物B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，得到的融合細(xì)胞稱之為雜交瘤。具有分泌特異性抗體B淋巴細(xì)胞特性以及骨髓瘤細(xì)胞體外無限增殖的特性。㈡病毒轉(zhuǎn)化

通過對(duì)脾臟B淋巴細(xì)胞進(jìn)行某一特異性免疫，繼而進(jìn)行誘變或通過病毒轉(zhuǎn)化形成永久生長(zhǎng)的細(xì)胞系。12.2.3單克隆抗體的雜交瘤制備動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤細(xì)胞、檢測(cè)抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)、單克隆抗體的大量生產(chǎn)。12.2.3.1動(dòng)物免疫與免疫脾細(xì)胞制備抗原是制備McAb的第一要素，它的純度和免疫原性是決定免疫反應(yīng)的關(guān)鍵。抗原顆粒性抗原可溶性抗原免疫的目的是產(chǎn)生足夠多的能識(shí)別目的抗原的B淋巴細(xì)胞。㈠體外法直接分離動(dòng)物淋巴細(xì)胞，加適當(dāng)濃度抗原，3~4d后收集淋巴細(xì)胞。㈡體內(nèi)法將抗原直接注射動(dòng)物體內(nèi)。3~4d后在無菌條件下取出脾或淋巴結(jié)制成細(xì)胞懸液。一般要經(jīng)過初次免疫、第二次免疫、加強(qiáng)免疫三個(gè)過程。小鼠體內(nèi)免疫過程可劃分為5個(gè)階段：①前期反應(yīng)；②初級(jí)上升階段；③初級(jí)回落階段；④次級(jí)上升階段；⑤次級(jí)回落階段。在第2、4階段注意加強(qiáng)免疫。一般多采用腹腔免疫注射。除非特殊需要，通常靜脈注射只用來加強(qiáng)免疫。通常在末次免疫后第3~4d處死小鼠，75%酒精浸泡消毒小鼠毛皮，打開腹腔無菌取脾。去除脂肪和結(jié)締組織，用無血清培養(yǎng)液沖洗，置100目不銹鋼網(wǎng)篩上研磨脾臟，用洗液洗2~3次，經(jīng)1000r/min離心5min，棄上清，加入RPMI-1640等完全培養(yǎng)基，用吸管吹打分散，收集上層懸液，一般一只小鼠可獲（1~2.5）×108脾細(xì)胞。12.2.3.2骨髓瘤突變?nèi)毕菁?xì)胞株的培養(yǎng)和選擇骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣融合效率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)大量產(chǎn)生McAb。通常采用HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）或TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞。一般在細(xì)胞融合前兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可采用一般的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液，小牛血清的濃度一般在10%~20%。細(xì)胞倍增時(shí)間為16~20h。細(xì)胞的最大密度不得超過106cells/mL。骨髓瘤細(xì)胞可以懸浮或半貼壁形式生長(zhǎng)繁殖，對(duì)于半貼壁細(xì)胞無需用胰蛋白酶消化，直接用吸管吹打即可使細(xì)胞分散，每3~5d傳代一次。一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1︰10稀釋傳代。12.2.3.3飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)目的：為促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)可用肉湯刺激小鼠腹腔并收獲腹腔中的巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞（feedercell）。用吸管在打開的腹腔中吸取細(xì)胞懸液，并用培養(yǎng)液沖洗收獲，離心洗一次，再用培養(yǎng)基（含HAT）調(diào)整細(xì)胞至2×105/mL，96孔板培養(yǎng)（0.1mL/孔），每只鼠可獲巨噬細(xì)胞（2~5）×106個(gè)。12.2.3.4HAT培養(yǎng)基篩選HAT培養(yǎng)基此培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine,H）、氨基喋呤（aminopterin,A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine,T）,取三者第一個(gè)字母，稱為~。分離配制時(shí)，HT、A貯備液均采用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃凍存。使用前，于每100mLRPMI-1640培養(yǎng)基中（含10%小牛血清或牛血清）加1mLHT貯備液和1mLA貯備液。次黃嘌呤難溶，可加溫50~80℃促溶。氨基喋呤溶解時(shí)需要滴加1NNaOH溶液并不斷搖動(dòng)，直至完全溶解，再滴加等量1NHCl溶液，恢復(fù)pH至7.0左右。細(xì)胞融合前必須做骨髓瘤細(xì)胞對(duì)HAT選擇培養(yǎng)基敏感性試驗(yàn)，不敏感的細(xì)胞不能用于細(xì)胞融合。DNA的合成有以下兩條途徑：㈠正常途徑糖、氨基酸→核苷酸→DNA，可以被氨基喋呤阻斷。㈡補(bǔ)救途徑核苷酸前體→核苷酸→DNA，需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）兩種酶的參與。HAT培養(yǎng)基中的氨基喋呤可阻斷細(xì)胞正常途徑合成DNA。融合所用的瘤細(xì)胞一般是HGPRT或TK缺陷型，也不能采用補(bǔ)救途徑合成DNA。兩條途徑被阻斷后，瘤細(xì)胞（未融合的與自身融合的）因不能正常合成DNA而死亡。融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，具有來自于淋巴細(xì)胞的HGPRT與TK，可采用補(bǔ)救途徑合成DNA，因此可在HAT培養(yǎng)基中存活與繁殖。12.2.3.5細(xì)胞融合與雜交瘤篩選雜交瘤細(xì)胞制備一般采用聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)細(xì)胞融合法，大致流程如下：將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1︰10或1︰5的比例混合在一起，在37℃水浴中邊搖邊滴加預(yù)熱的50%PEG（MW1000或4000），加入預(yù)熱的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液終止細(xì)胞融合，離心沉淀細(xì)胞，懸浮于HAT培養(yǎng)液中置37℃、5%CO2的培育箱中培養(yǎng)，每3~4d半量更換HAT培養(yǎng)液，15d后改用HAT培養(yǎng)基，3周后改用完全RPMI-1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)8~12d進(jìn)行抗體檢測(cè)。12.2.3.6雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)一旦檢測(cè)到分泌目標(biāo)抗體的克隆，應(yīng)及時(shí)將雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)并盡快進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。目的是從細(xì)胞群體中選育出遺傳穩(wěn)定的能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，淘汰非特異性的或遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞。得到單個(gè)細(xì)胞后采用96孔培養(yǎng)板置入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。通過特異性抗體檢測(cè)選擇抗體效價(jià)高、呈單個(gè)克隆生長(zhǎng)、形態(tài)良好的細(xì)胞。12.2.3.7單克隆抗體的制備㈠體內(nèi)接種法體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，收集血清或腹水提取單克隆抗體：⑴血清法：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按（1~3）×107cells/mL接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2mL。待腫瘤達(dá)到一定大小后采血（一般10~20d），從血清中獲得的單克隆抗體含量可達(dá)到1~10mg/mL。缺點(diǎn)：采血量有限。⑵腹水法：先向小鼠腹腔內(nèi)注射0.5mL的降植烷（pristane）或液體石蠟，1~2周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7~10d后可產(chǎn)生腹水，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1~10mL腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5~20mg/mL，這是比較常用的傳統(tǒng)方法。㈡體外培養(yǎng)法傳統(tǒng)培養(yǎng)法生物反應(yīng)器培養(yǎng)前者使用旋轉(zhuǎn)瓶（管）大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10~60μg/mL，如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。目前已利用生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。12.2.4單克隆抗體的鑒定12.2.4.1特異性的鑒定免疫原（抗原）進(jìn)行抗體的檢測(cè)與其抗原成分相關(guān)的其他抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)可用酶聯(lián)免疫反應(yīng)吸附法（ELISA）免疫熒光法（IFA）12.2.4.2McAb的Ig類與亞類的鑒定一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測(cè)出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于McAb的亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來確定。12.2.4.3McAb中和活性的鑒定可用動(dòng)物的或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來確定McAb的生物學(xué)活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感動(dòng)物或敏感細(xì)胞，來觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。12.2.4.4McAb識(shí)別抗原表位的鑒定可用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、測(cè)相加指數(shù)的方法測(cè)定McAb所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來確定McAb識(shí)別的抗原表位是否相同。12.2.4.5McAb親和力的鑒定可用ELISA或放射性免疫分析（RIA）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。12.3人源化單克隆抗體鼠源性單克隆抗體在生命科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)臨床上應(yīng)用很廣，但是鼠源性單抗仍帶有鼠抗原決定簇而使其應(yīng)用存在一定的局限性。例如：①不能有效地激活人體中補(bǔ)體和Fc受體相關(guān)的效應(yīng)系統(tǒng)；②被人體免疫系統(tǒng)所識(shí)別，產(chǎn)生人抗鼠抗體；③在人體循環(huán)系統(tǒng)中很快被清除掉。因此，必須通過人源化改造獲得低免疫原性、高效性、人源化單克隆抗體，解決鼠雜交瘤單抗用于人體的變態(tài)反應(yīng)問題。與鼠源性單克隆抗體研究相比，人源化單克隆抗體的研究進(jìn)展十分緩慢，原因在于人單克隆抗體制備系統(tǒng)中缺乏像小鼠骨髓瘤那樣的融合率高、性狀穩(wěn)定的融合親本細(xì)胞，不能用任意抗原免疫人體獲得足夠數(shù)量的抗原特異性B淋巴細(xì)胞。斯坦利斯（Steinitz）1977年報(bào)道了利用EB病毒（一種常見的皰疹病毒）在體外直接感染人外周血淋巴細(xì)胞，建立了能分泌半抗原抗體的人B淋巴細(xì)胞系。后來利用這種技術(shù)成功獲得了抗病毒、細(xì)菌、血型抗原、自身抗原及腫瘤相關(guān)抗原的人單克隆抗體分泌細(xì)胞。12.3.1人-鼠雜交瘤單克隆抗體人-鼠雜交瘤的融合方法基本與鼠-鼠雜交瘤相同。親本骨髓瘤細(xì)胞是小鼠骨髓瘤細(xì)胞，親本B淋巴細(xì)胞則來源于人外周血淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、脾細(xì)胞。但是，人-鼠雜交瘤的人單克隆抗體分泌性能很不穩(wěn)定，多數(shù)情況下雜交瘤會(huì)很快失去抗體分泌能力。其原因可能是由于人染色體丟失。12.3.2人-人雜交瘤單克隆抗體可通過建立人骨髓瘤（或其他人細(xì)胞系）與人淋巴細(xì)胞融合來制備人單克隆抗體。人源化融合親本細(xì)胞需具有較高的融合率、產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定并能產(chǎn)生一定量的具有特異性的抗體等特征。然而遺憾的是可供利用的人類骨髓瘤細(xì)胞種類非常有限。12.3.3嚴(yán)重免疫缺陷小鼠制備人源化單克隆抗體SCID小鼠是由CB-17純系小鼠16號(hào)染色體突變，破壞了免疫球蛋白基因和T細(xì)胞受體基因，從而使動(dòng)物T、B淋巴細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致聯(lián)合免疫缺陷。免疫缺陷使動(dòng)物可接受人體組織或器官移植，形成人-鼠嵌合體小鼠。將人免疫干細(xì)胞移植到SCID小鼠體內(nèi)，SCID小鼠實(shí)際上獲得了人的免疫系統(tǒng)。這種小鼠可用任何抗原免疫，從激活的淋巴細(xì)胞中富集抗原特異性人源化B淋巴細(xì)胞，通過細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞制備抗體。12.3.4基因工程單克隆抗體基因工程抗體是通過分子技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當(dāng)載體重組后引入不同表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體。基因工程技術(shù)可以獲得完全人源化抗體。目前的基因工程抗體技術(shù)有人-鼠嵌合抗體、改型抗體、組合抗體庫、噬菌體展示抗體庫等。復(fù)習(xí)題與一般的細(xì)胞融合相比，雜交瘤技術(shù)有什么特殊地方？以一例說明采用雜交瘤技術(shù)的單克隆抗體的制備方法？第13章體外受精與核移植動(dòng)物13.1胚胎工程是指對(duì)動(dòng)物早期胚胎或配子進(jìn)行的工程技術(shù)操作，獲得所需要的成體動(dòng)物的技術(shù)。體外受精胚胎移植胚胎分割與融合胚胎與精子、卵子冷凍、保存胚胎性別控制胚胎細(xì)胞核移植基因?qū)氲?3.2體外受精動(dòng)物（invitrofertilization）是指將哺乳動(dòng)物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)。體外受精動(dòng)物也稱試管動(dòng)物（test-tubeanimal）,是指將供體的精子和卵子在體外受精，體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育到一定階段通過胚胎移植移入受體完成發(fā)育出生的動(dòng)物。⑴發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力：一只良種母畜一生只能繁殖10個(gè)左右的后代，大部分時(shí)間用于妊娠和哺乳。⑵促進(jìn)家畜改良的速度：加速育種過程。

⑶保存遺傳資源：“胚胎庫”體外受精動(dòng)物培育一般經(jīng)過以下幾個(gè)步驟:⑴精子采集與體外獲能、卵子采集與成熟培養(yǎng)。⑵體外受精。⑶重組胚激活與體外培養(yǎng)。⑷胚胎移植。⑸體內(nèi)發(fā)育、出生。13.2.1精子的采集與體外獲能精子的選擇：上浮分離法——在精液中加入少量培養(yǎng)液，有活力的精子會(huì)游到培養(yǎng)液表面，這樣收集培養(yǎng)液上面的精子即可得到有活力的精子。精子獲能——精子獲得穿透卵子透明帶能力的過程。雄性精液中含有“去能因子”（大多是糖蛋白），附在精子表面，是頂體酶的抑制劑，抑制了精子的受精能力。去能因子的清除主要依靠宮頸、子宮及輸卵管液中的β淀粉酶、胰蛋白酶、β葡糖苷酶及唾液酸酶，后者在卵泡液中含量也很高。這些酶可以水解糖蛋白等“去能因子”，使精子頂體酶活性恢復(fù)，具有受精能力。最初通過在同種或異種雌性生殖道孵育精子獲能，后來發(fā)展到用子宮液、卵泡液、子宮內(nèi)膜提取液或血清等在體外培養(yǎng)精子獲能。目前可以采用添加誘導(dǎo)精子獲能物質(zhì)（如鈣離子、血清蛋白（BSA）、肝素等）的特定培養(yǎng)液來完成精子體外獲能。13.2.2卵細(xì)胞回收與成熟培養(yǎng)為了獲得足夠的卵細(xì)胞需要采用超數(shù)排卵技術(shù)。誘導(dǎo)家畜超數(shù)排卵需注射外源激素，其目的是使動(dòng)物的激素水平達(dá)到閾值，從而誘發(fā)卵細(xì)胞的成熟與排放。能促進(jìn)卵細(xì)胞的成熟與排放的激素主要有：孕酮、雌二醇、促卵泡激素（FSH）、黃體生成素（LH）、促性腺激素、前列腺素（PG）和孕馬血清促性腺激素（PMSG）等。排卵的直接原因：促黃體激素（LH）、孕酮的急劇增加，排卵后剩下的卵泡細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)辄S體并分泌孕酮抑制其他卵泡的發(fā)育。影響超數(shù)排卵效果的因素：供體年齡、供體品種差異、激素的處理劑量、卵巢狀況等。13.2.2.1成熟卵細(xì)胞（卵子）的收集用促卵泡素和促黃體素等處理雌性動(dòng)物實(shí)現(xiàn)超排卵。將腹腔鏡插入腹腔，觀察到卵泡后用吸管吸出卵細(xì)胞。這種方法的關(guān)鍵是掌握卵細(xì)胞進(jìn)入輸卵管和卵細(xì)胞在輸卵管中維持受精能力的時(shí)間。操作程序較復(fù)雜，成本較高。由超數(shù)排卵采集的卵細(xì)胞已在體內(nèi)發(fā)育成熟，不需成熟培養(yǎng)可直接受精。13.2.2.2卵母細(xì)胞的收集、選擇與成熟培養(yǎng)㈠活體卵巢采集借助超聲波探測(cè)儀、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡直接從活體動(dòng)物的卵巢中吸取卵母細(xì)胞。方法：對(duì)于牛和馬等大家畜，常用超聲波探測(cè)儀輔助取卵，其方法使用手從直腸把握卵巢，經(jīng)陰道壁穿刺插入吸卵針，借助B型超聲波圖像引導(dǎo)吸取卵泡中的卵母細(xì)胞。簡(jiǎn)單省時(shí)、操作方便，而且可以反復(fù)多次采集㈡屠宰后家畜卵巢采集

從剛屠宰的母畜體內(nèi)摘出卵巢，洗滌后保存在30-37℃的無菌生理鹽水中，快速運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，在無菌條件下用注射器或真空泵抽吸卵泡中的卵母細(xì)胞。也可對(duì)卵巢進(jìn)行切片收集卵母細(xì)胞。摘出卵巢應(yīng)在1-4h內(nèi)收集。

從廢棄卵巢中采集卵母細(xì)胞關(guān)鍵是要注意卵巢的保溫和防止微生物污染。㈢卵母細(xì)胞的選擇采用前面兩種方法采集的卵母細(xì)胞絕大部分與卵丘細(xì)胞形成卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COC）。采集的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體要求卵母細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、細(xì)胞質(zhì)均勻，外圍有多層卵丘細(xì)胞緊密包圍。A級(jí)：有3層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍，細(xì)胞質(zhì)均勻；B級(jí)：卵母細(xì)胞質(zhì)均勻，卵丘細(xì)胞層低于3層或部分包圍卵母細(xì)胞；C級(jí)：沒有卵丘細(xì)胞包圍的裸露卵母細(xì)胞；D級(jí)：死亡或退化的卵母細(xì)胞。在體外受精中，一般只選擇培養(yǎng)A級(jí)和B級(jí)卵母細(xì)胞。㈣卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)對(duì)采集的卵母細(xì)胞需要在體外模擬動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，獲得具有受精能力的成熟的卵細(xì)胞。培養(yǎng)液的主要成分：氨基酸、水溶性維生素、無機(jī)離子、大分子營養(yǎng)物質(zhì)、激素、能量物質(zhì)等。TCM199培養(yǎng)基添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成分。血清是大分子營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，而且可提供細(xì)胞生長(zhǎng)因子。作為能量來源的物質(zhì)主要是葡萄糖，氨基酸也可作為能源起作用。卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)還需對(duì)溫度、滲透壓、pH、氣相等進(jìn)行控制。卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)通常采用微滴培養(yǎng)法，微滴體積一般為50~200μl，10~40個(gè)卵母細(xì)胞/微滴。二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，條件為37℃、100%濕度、5%二氧化碳。卵母細(xì)胞成熟的一些標(biāo)志：生發(fā)泡破裂，染色體凝集，紡錘體形成，極體排出，透明帶軟化，卵丘細(xì)胞擴(kuò)展等。用DNA特異性染料染色后在顯微鏡下進(jìn)行核相觀察，可見卵母細(xì)胞處于第二次成熟分裂中期。13.2.3體外受精精子發(fā)生頂體反應(yīng)時(shí)，精子頂體外膜與其相貼的卵細(xì)胞膜發(fā)生多點(diǎn)融合而破裂，繼而出現(xiàn)小孔。頂體酶通過這些小孔釋放出去，使卵子周圍的卵丘細(xì)胞分散并去除放射冠，分解透明帶。精子頂體內(nèi)膜與卵細(xì)胞相互融合，最終雄性原核和雌性原核合二為一，完成受精過程。13.2.3.1共培養(yǎng)體外受精1個(gè)卵子轉(zhuǎn)至1孔或1滴受精培養(yǎng)液中，對(duì)于一些少精者每孔（滴）可放入2-3個(gè)卵子。每孔（滴）中加入約10萬條活動(dòng)精子，快速置鏡下檢查精子濃度。置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)液：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液類似，但需添加一些特殊物質(zhì)，如腎上腺素、亞?；撬?、肝素等，有助于精子穿卵和促使原核的形成。精子獲能時(shí)間、精子添加密度、精-卵共培養(yǎng)的時(shí)間、培養(yǎng)液pH和離子強(qiáng)度等對(duì)受精率均有顯著影響。通常受精后16-20h，卵子周圍的顆粒細(xì)胞應(yīng)當(dāng)去除。13.2.3.2顯微受精技術(shù)顯微受精是通過顯微操作儀將哺乳動(dòng)物精子注入卵子，使其在體外相互結(jié)合的技術(shù)。透明帶下注射卵漿內(nèi)注射透明帶修飾法等可以解除透明帶和卵質(zhì)膜對(duì)精子的阻擋作用。但是會(huì)受精子質(zhì)量、卵細(xì)胞狀態(tài)、注射部位、操作方法等影響。㈠透明帶下注射法

用微注射器將3-5個(gè)精子直接注射入透明帶下的卵間隙，從而使卵子受精。優(yōu)點(diǎn)是對(duì)卵子的損傷小，但是存在多精受精問題。㈡卵漿內(nèi)精子注射法用微注射器將單個(gè)精子直接注射入卵子的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)使卵子受精。這樣可以避免多精受精問題。卵漿內(nèi)精子注射對(duì)精子活力、形態(tài)和頂體反應(yīng)沒有特殊要求。㈢透明帶修飾法采用人工方法破壞卵子的透明帶，使精子比較容易地通過破損處進(jìn)入卵子完成受精。機(jī)械法（用鋒利的微型玻璃針切除部分透明帶）化學(xué)溶解法（選用透明質(zhì)酸去除卵丘，然后用酸性Tyrode氏溶液局部溶解透明帶）激光法（用波長(zhǎng)為193nm的氟化氬激光束破壞透明帶）。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)卵子的損傷小、但易造成多精子受精，影響胚胎繼續(xù)發(fā)育。13.2.4胚胎培養(yǎng)受精卵需在體外培養(yǎng)發(fā)育至桑葚期或囊胚期才能進(jìn)行移植。通常情況下，移植的較佳時(shí)期是發(fā)育至8~16細(xì)胞期的胚胎。發(fā)育阻滯——體外受精的早期胚胎在體外發(fā)育中，往往會(huì)停止在某一階段不再發(fā)育，這種現(xiàn)象稱為~。小鼠：2細(xì)胞期；倉鼠：2-8細(xì)胞期大鼠：2-4細(xì)胞期；豬：2細(xì)胞期牛、羊：8-16細(xì)胞期；人：4-8細(xì)胞期發(fā)育阻滯是胚胎體外培養(yǎng)的一個(gè)主要障礙，克服發(fā)育阻滯是胚胎體外培養(yǎng)的關(guān)鍵之一。受精卵在發(fā)育早期基本受母源性信息調(diào)控，胚胎的發(fā)育阻滯與胚胎的母源基因調(diào)控向自身基因調(diào)控的轉(zhuǎn)換有關(guān)。近年來，通過改進(jìn)培養(yǎng)液成分和建立體細(xì)胞共培養(yǎng)體系，對(duì)于不少動(dòng)物已克服了胚胎體外培養(yǎng)中的發(fā)育阻滯，使胚胎順利發(fā)育到囊胚階段。例如，將胚胎與某些類型的體細(xì)胞共同培養(yǎng)可以有效地克服發(fā)育阻滯，這些與胚胎共同培養(yǎng)的細(xì)胞稱為飼養(yǎng)層細(xì)胞。這類細(xì)胞包括：輸卵管上皮細(xì)胞、子宮上皮細(xì)胞、顆粒細(xì)胞或卵丘細(xì)胞等。飼養(yǎng)層細(xì)胞的作用可能與產(chǎn)生胚胎營養(yǎng)因子以及對(duì)抗培養(yǎng)環(huán)境中毒性物質(zhì)有關(guān)。13.2.5胚胎移植胚胎移植（embryotransfer,ET）是指將發(fā)育到一定階段的胚胎移植到與供體同時(shí)發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的“受體”母畜輸卵管或子宮的技術(shù)。胚胎移植應(yīng)選擇與供體發(fā)情周期同步、生殖道正常、無疾病、繁育史良好的受體。通常采用藥物調(diào)控發(fā)情期的方法，來刺激或抑制動(dòng)物的生理周期，從而達(dá)到動(dòng)物發(fā)情的同步化。13.2.5.1手術(shù)法綿羊等小家畜將同期發(fā)情的受體動(dòng)物仰面固定在手術(shù)床上，全身麻醉，借助內(nèi)窺鏡觀察排卵和黃體發(fā)育情況。腹部切口，將一側(cè)卵巢上有黃體發(fā)育的子宮遠(yuǎn)端拉出，把胚胎輸入子宮上1/3處。也可先用鈍形針頭在要移植部位刺一個(gè)小孔，然后把吸有胚胎的胚胎移植管插入穿刺孔，小心將胚胎輸入。這種方法移卵容易，卵損傷小，成功率較高。創(chuàng)口用手術(shù)針線縫合，消炎并肌肉注射抗菌素。13.2.5.2非手術(shù)法牛、馬等大家畜一般使用專用輸胚槍直接插入子宮角內(nèi)注入胚胎。13.3試管嬰兒是指卵子與精子在體外受精，培養(yǎng)發(fā)育成早期胚胎，再植回受體子宮內(nèi)發(fā)育出生的嬰兒。1978年，世界首例試管嬰兒路易斯·布朗在英國誕生。1983年，澳大利亞培育出第一例人類冷凍胚胎試管嬰兒。1988年，我國首例常規(guī)試管嬰兒在北京醫(yī)科大學(xué)誕生。2000年，我國首例超快速冷凍胚胎移植的試管嬰兒在湖南醫(yī)科大學(xué)誕生。試管嬰兒可分為三個(gè)類型：⑴第一代試管嬰兒：1977年愛德華茲（Edwards）和斯蒂普特（Steptoe）主要特征：模擬體內(nèi)受精過程，將精子與卵子通過共培養(yǎng)完成受精。主要適用于女性原因的不育。輸卵管堵塞、宮頸粘連等問題⑵第二代試管嬰兒：采用顯微注射儀將單個(gè)精子注射進(jìn)卵子內(nèi)受精培育的嬰兒。優(yōu)點(diǎn)：正常受精率高，多精受精率低，主要適用于男性原因引起的不孕。例如：少精、弱精、畸形精和無精等。缺點(diǎn)是：由于使用的是非自然選擇的精子進(jìn)行受精，因此可能將遺傳缺陷傳給下一代，同時(shí)顯微授精操作容易造成卵子損傷。⑶第三代試管嬰兒：經(jīng)過種植前遺傳學(xué)診斷培育出的試管嬰兒被稱為~。與前兩代的區(qū)別：先從體外受精的胚胎取出部分細(xì)胞進(jìn)行基因診斷，排除帶致病基因的胚胎，然后再進(jìn)行胚胎移植。代表了試管嬰兒的一個(gè)重要發(fā)展方向，對(duì)于遺傳病預(yù)防，提高嬰兒質(zhì)量具有重要意義。試管嬰兒培育技術(shù)主要技術(shù)環(huán)節(jié)：女方超排卵處理、取卵與成熟培養(yǎng)、丈夫精液采集與體外獲能處理、體外受精、受精卵體外培養(yǎng)、胚胎移植、子宮內(nèi)發(fā)育、出生等若干步驟。13.3.1控制性超排卵與取卵正常情況下，女性青春期起卵巢每月有一些卵泡發(fā)育，但通常只有一個(gè)卵泡成熟并排出，而其他的一些卵泡退化成閉鎖卵泡。這種