04蛋白質(zhì)工程制藥匯總課件

04蛋白質(zhì)工程制藥S1蛋白質(zhì)工程制藥概述S2蛋白質(zhì)工程的基本技術(shù)S3蛋白質(zhì)工程制藥實例04蛋白質(zhì)工程制藥S1蛋白質(zhì)工程制藥概述1S1蛋白質(zhì)工程制藥概述從基因工程藥物到蛋白質(zhì)工程藥物蛋白質(zhì)工程的誕生、概念蛋白質(zhì)工程的基本過程蛋白質(zhì)分子設(shè)計S1蛋白質(zhì)工程制藥概述從基因工程藥物到蛋白質(zhì)工程藥物2基因工程藥物蛋白質(zhì)工程藥物1982年第一個基因工程藥物：重組人胰島素重組蛋白存在問題：1、穩(wěn)定性差：體內(nèi)半衰期短2、藥理活性不夠強：使用劑量偏大3、毒副作用大4、生產(chǎn)工藝復(fù)雜蛋白質(zhì)工程藥物基因工程藥物蛋白質(zhì)工程藥物1982年第一個基因工程藥物：重3蛋白質(zhì)工程的誕生1970S末，Smith等人建立了寡核苷酸點突變改變DNA序列的方法1982年，一些實驗室用此技術(shù)來改造蛋白質(zhì)分子，研究蛋白質(zhì)的功能1983年，Ulmer發(fā)表了題為“ProteinEngineering”的專論目前已應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，并有多種產(chǎn)品上市蛋白質(zhì)工程的誕生1970S末，Smith等人建立了寡核苷酸點4已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短2、藥理活性不夠強3、毒副作用大4、生產(chǎn)工藝復(fù)雜已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短5已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短2、藥理活性不夠強3、毒副作用大4、生產(chǎn)工藝復(fù)雜已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短6已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短2、藥理活性不夠強3、毒副作用大4、生產(chǎn)工藝復(fù)雜已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短7蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）(第二代基因工程)是以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的知識為基礎(chǔ)，通過周密的分子設(shè)計以及DNA重組技術(shù)，把天然的蛋白質(zhì)改造成合乎人類需要的新的突變蛋白質(zhì)(mutein)的一項技術(shù)。蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineer8蛋白質(zhì)工程的概念內(nèi)涵：1、從DNA水平改變基因，改造蛋白質(zhì)2、一個或多個氨基酸殘基結(jié)構(gòu)域全新蛋白質(zhì)3、有目的地改造，獲得期望功能——強調(diào)分子設(shè)計4、結(jié)合DNA重組技術(shù)從不同尺度改造蛋白質(zhì)工程的概念內(nèi)涵：從不同尺度改造9蛋白質(zhì)工程的基本過程蛋白質(zhì)工程的基本過程10蛋白質(zhì)工程的基本過程1、分離純化所需改造的目的蛋白2、對蛋白進行氨基酸序列測定、X射線晶體衍射分析、核磁共振分析等——結(jié)構(gòu)和功能信息3、根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能信息、生物信息學信息，運用蛋白質(zhì)分子預(yù)測技術(shù)提出蛋白質(zhì)設(shè)計方案4、分離克隆該蛋白編碼基因，并進行突變改造5、插入適當?shù)妮d體表達6、分離純化表達產(chǎn)物，檢測其生物學功能實驗設(shè)計實驗蛋白質(zhì)工程的基本過程1、分離純化所需改造的目的蛋白實驗設(shè)計實11蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件12蛋白質(zhì)分子設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的三個基本條件：1、蛋白質(zhì)分子的基本知識：理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能、構(gòu)象規(guī)律2、對具體改造的蛋白質(zhì)分子必須有一個系統(tǒng)、全面和深入的了解3、分子設(shè)計的基本工具：高性能的計算機硬件、功能齊全的計算機軟件——只有在此基礎(chǔ)上，才能應(yīng)用蛋白質(zhì)分子預(yù)測技術(shù)，提出合理的設(shè)計方案三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的三個基本條件：1、蛋白質(zhì)分子的13蛋白質(zhì)分子設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類1、小范圍改造：對已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進行少數(shù)幾個殘基的替換、部分片段的缺失，改善蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能。2、較大程度的改造：根據(jù)需求對來源于不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進行拼接組裝，或在蛋白質(zhì)分子中進行大范圍肽鏈替換、結(jié)構(gòu)域替換，獲得多功能復(fù)合體。3、蛋白質(zhì)從頭設(shè)計（denovoproteindesign）三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類1、小范圍改造：對已知結(jié)構(gòu)14概念：從蛋白質(zhì)分子一級結(jié)構(gòu)出發(fā)，設(shè)計制造自然界中不存在的全新蛋白，使之具有特定的空間結(jié)構(gòu)和預(yù)期的生物功能。1、需要扎實的理論基礎(chǔ)2、在分子設(shè)計與試驗驗證之間交互進行蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略概念：從蛋白質(zhì)分子一級結(jié)構(gòu)出發(fā)，設(shè)計制造自然界中不存在的全新15PDA循環(huán)（ProteinDesignAutomation）1、設(shè)計模擬實驗分析2、不斷循環(huán)：一步步的修正最終獲得成功蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計計算機模擬基因構(gòu)建突變蛋白質(zhì)產(chǎn)物功能分析三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略PDA循環(huán)（ProteinDesignAutomatio16蛋白質(zhì)從頭合成的范例

凋亡誘導(dǎo)肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2KLAKLAK：可形成典型的兩親-螺旋結(jié)構(gòu)，進入細胞后，可破壞線粒體膜引起細胞凋亡NGR：與新生血管的內(nèi)皮細胞特異結(jié)合，起到靶向彈頭的作用蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略蛋白質(zhì)從頭合成的范例KLAKLAK：可形成典型的兩親-螺旋17利用NGR為彈頭，將KLALAK肽特異地導(dǎo)向腫瘤部位的新血管內(nèi)皮細胞，通過抑制新血管的生成，從而抑制腫瘤的形成，且對其他細胞沒有明顯的毒性。300mol/L3mol/L蛋白質(zhì)從頭合成的范例凋亡誘導(dǎo)肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略利用NGR為彈頭，將KLALAK肽特異地導(dǎo)向腫瘤部位的新18蛋白質(zhì)從頭合成的范例凋亡誘導(dǎo)肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計考慮的其他因素1、Gly-Gly接頭：防止兩功能部位的立體結(jié)構(gòu)相互影響。2、L-型氨基酸（D-型）：防止蛋白酶的降解三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略蛋白質(zhì)從頭合成的范例蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計考慮的其他因19蛋白質(zhì)從頭合成的范例凋亡誘導(dǎo)肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計實驗結(jié)果1、特異地被激活的新生血管內(nèi)皮細胞內(nèi)吞，引起凋亡2、在小鼠腫瘤模型中，可抑制腫瘤的生長，明顯延長治療組小鼠的存活時間3、對健康小鼠超劑量使用時，沒有毒副作用的產(chǎn)生三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略蛋白質(zhì)從頭合成的范例蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計實驗結(jié)果1、201、順式思維理性化設(shè)計

——合理化設(shè)計2、基于各種功能篩選平臺的非理性逆向改造策略

——非理性的體外進化3、兩種策略的結(jié)合蛋白質(zhì)分子設(shè)計的策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略1、順式思維理性化設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個211、順式思維理性化設(shè)計——合理化設(shè)計基于現(xiàn)有知識信息：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能；因此，受到已有認識水平的制約。蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略1、順式思維理性化設(shè)計蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的策略蛋白222、基于各種功能篩選平臺的非理性逆向改造策略——非理性的體外進化1）構(gòu)建包含眾多突變蛋白的文庫：隨機突變、DNA改組等2）篩選文庫：從功能入手進行篩選所需要的蛋白3）進行蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)、序列信息的分析蛋白質(zhì)分子設(shè)計的策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略2、基于各種功能篩選平臺的非理性逆向改造策略——非理性的體外233、兩種策略的結(jié)合非理性的體外進化：彌補合理性化設(shè)計應(yīng)用中的局限性，并且迅速得到大量有功能的目標分子，通過分析積累所需的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)信息合理化設(shè)計：對非理性篩選出的候選分子進行合理化的分子修正，使之進一步符合實際需求蛋白質(zhì)分子設(shè)計的策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略3、兩種策略的結(jié)合非理性的體外進化：彌補合理性化設(shè)計應(yīng)用中的24S2蛋白質(zhì)工程的基本技術(shù)定點突變技術(shù)隨機突變技術(shù)1、寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變2、PCR介導(dǎo)的定點突變3、盒式突變4、易錯PCR5、DNA改組技術(shù)S2蛋白質(zhì)工程的基本技術(shù)定點突變技術(shù)隨機突變技術(shù)1、寡核苷25易錯PCR連續(xù)易錯PCR（sequentialerror-pronePCR）：經(jīng)以上一次PCR突變的基因很難獲得滿意的結(jié)果，于是將前一輪PCR擴增得到的有用突變基因作為下一輪PCR的模板，每次獲得的突變累積起來，產(chǎn)生重要的有益突變?？蛇z傳的變化只發(fā)生在單一分子內(nèi)部，屬于無性進化（asexualevolution）易錯PCR（error-pronePCR）：利用缺乏修復(fù)功能的Taq酶，并設(shè)置容易引起出錯的PCR反應(yīng)條件，在擴增目的基因的同時引入堿基錯配，導(dǎo)致目的基因隨機突變——完全隨機化易錯PCR連續(xù)易錯PCR（sequentialerror-26易錯PCR優(yōu)點：簡便易行不足：突變文庫規(guī)模有限，有益突變少，后續(xù)篩選工作費力、耗時，只適用于較小的基因片段（<800bp）易錯PCR優(yōu)點：簡便易行不足：突變文庫規(guī)模有限，有益突變少27DNA改組技術(shù)DNA改組（DNAshuffling），又叫有性PCR（sexual-PCR）等，將單一基因隨機片段化，這些片段自配對PCR擴增，由于易錯PCR而引入大量隨機突變，并在多次循環(huán)中重組，使基因在體外迅速進化，從中篩選到有益重組。優(yōu)點：體外定向進化，快速，高效（蛋白質(zhì)、酶、抗體等）DNA改組技術(shù)DNA改組（DNAshuffling），又叫28DNA改組技術(shù)DNA改組技術(shù)2904蛋白質(zhì)工程制藥匯總課件30基因家族改組DNA改組的不足：從單一基因出發(fā)，得到的隨機點突變率很低，且有益突變的積累相對緩慢在自然界中，不同物種同源基因本身就是具有非常豐富的變異，如果加以利用，就可以大大地加速基因在體外的進化速度——基因家族改組（DNAfamilyshuffling）基因家族改組DNA改組的不足：從單一基因出發(fā)，得到的隨機點突31基因家族改組基因家族改組3204蛋白質(zhì)工程制藥匯總課件33S3蛋白質(zhì)工程制藥實例蛋白質(zhì)工程在新藥研究中的應(yīng)用胰島素的蛋白質(zhì)工程研究S3蛋白質(zhì)工程制藥實例蛋白質(zhì)工程在新藥研究中的應(yīng)用34蛋白質(zhì)工程在新藥研究中的應(yīng)用1、提高藥效活性2、提高靶向性3、提高穩(wěn)定性、改善藥代動力學特性4、提高工業(yè)生產(chǎn)效率5、降低蛋白藥物引起的免疫反應(yīng)6、獲得具有新功能的蛋白分子7、獲得特定蛋白的拮抗物或類似物8、模擬原型蛋白分子結(jié)構(gòu)開發(fā)小分子模擬肽類藥物蛋白質(zhì)工程在新藥研究中的應(yīng)用1、提高藥效活性5、降低蛋白藥物35胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥1、糖尿病I型糖尿?。篒I型糖尿?。阂葝u素抵抗（IR）為主，伴胰島素相對缺乏；以及胰島素分泌缺陷，伴IR由于細胞介導(dǎo)的胰島B細胞自身免疫性破壞，導(dǎo)致胰島素絕對缺乏胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥I型糖尿病：36胰島素的蛋白質(zhì)工程研究閉環(huán)系統(tǒng)：自調(diào)控競爭解吸附作用胰島素的蛋白質(zhì)工程研究閉環(huán)系統(tǒng)：自調(diào)控37胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥1、糖尿病中國4000萬，全球1.5億患者急性并發(fā)癥：

酮癥酸中毒（I，昏迷、死亡）非酮癥高滲性昏迷（II）低血糖反應(yīng)（心慌、手抖、饑餓、出冷汗）胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥中國400038胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥1、糖尿病中國4000萬，全球1.5億患者慢性并發(fā)癥（可遍及全身各重要器官）：心血管疾病、慢性腎病視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥中國400039胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥2、胰島素胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥40胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥2、胰島素胰島素從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價格之高可想而知。胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥41胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥2、胰島素1982年，重組人胰島素上市——第一個基因工程藥物！第一個完成序列測定的蛋白質(zhì)（1958年）第一個人工合成的蛋白質(zhì)（1965年）Sanger

胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥第一個完成序42胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥2、胰島素每100L發(fā)酵液就能產(chǎn)生5g胰島素，使其價格降低了30%-50%!提取4-5g胰島素需要100Kg胰腺胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥每100L發(fā)43胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素在臨床應(yīng)用時存在的問題1、在正常生理情況下胰島素在體內(nèi)是不斷地分泌的，但不能連續(xù)不斷地注射胰島素2、皮下注射胰島素時，吸收得也很慢，注射后1.5-2小時，體內(nèi)胰島素水平還未能達到高峰，這就會導(dǎo)致高血糖；3-5小時之后胰島素水平仍在繼續(xù)上升，這又會導(dǎo)致低血糖胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素在臨床應(yīng)用時存在的問題2、皮下注44胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素在臨床應(yīng)用時存在的問題3、糖尿病病人一般需要每日四次注射給藥

胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素在臨床應(yīng)用時存在的問題45胰島素的蛋白質(zhì)工程研究蛋白質(zhì)工程技術(shù)對胰島素的改造1970S初，英國的Hodgkin等、我國的梁棟材等，分別用X-射線晶體衍射法進行了高分辨率的三維結(jié)構(gòu)分析，胰島素的蛋白質(zhì)工程研究奠定了基礎(chǔ)胰島素的蛋白質(zhì)工程研究蛋白質(zhì)工程技術(shù)對胰島素的改造46胰島素的蛋白質(zhì)工程研究蛋白質(zhì)工程技術(shù)對胰島素的改造1、速效胰島素（可快速吸收的單體胰島素）2、長效胰島素3、高效胰島素（與受體親和力增加的胰島素突變體）胰島素的蛋白質(zhì)工程研究蛋白質(zhì)工程技術(shù)對胰島素的改造47速效胰島素胰島素吸收慢的原因：二聚體、六聚體速效胰島素胰島素吸收慢的原因：二聚體、六聚體48速效胰島素3D分析發(fā)現(xiàn)：多聚體的形成與B8、B9、B12、B13、B16、B23-B28的氨基酸殘基有關(guān)用蛋白質(zhì)工程方法在多聚體接觸面上某些氨基酸殘基換上帶負電的氨基酸殘基B鏈Ser9

Asp（-），Thr27

Glu（-）由于相同電荷互斥，減少多聚體形成，吸收速度比野生型胰島素要快許多——“速效胰島素”速效胰島素3D分析發(fā)現(xiàn)：多聚體的形成與B8、B9、B12、B49速效胰島素1996年，第一個速效胰島素Lispro在歐美批準上市

B鏈Pro28

Lys29（＋）A、自身聚集的傾向大大降低，靜脈注射15min起效，1h達到頂峰[45min]；B、血漿清除迅速（2-4h），減少了引起低血糖的危險。速效胰島素1996年，第一個速效胰島素Lispro在歐美批準50速效胰島素另一個產(chǎn)品：Aspert胰島素

B鏈Pro28

Asp（－）A、減少了自身聚集，吸收時間、有效活性都是天然胰島素的2倍；B、縮短了血漿清除時間，使低血糖的危險降低了50%。速效胰島素另一個產(chǎn)品：Aspert胰島素B鏈Pro2851長效胰島素pI5.46.8，在生理pH下形成結(jié)晶，沉淀在注射部位，可緩慢釋放出來，這就可以延長體內(nèi)半衰期長效胰島素pI5.46.8，在生理pH下形成結(jié)晶，沉淀52長效胰島素實際的研究發(fā)現(xiàn)：B鏈Thr27

Arg，B鏈C端氨基化，A鏈Asn2lGly，血漿半衰期可延長至35.3h長效胰島素具有較好的臨床效果，每天注射一次，可與天然胰島素分泌水平相近長效胰島素實際的研究發(fā)現(xiàn)：B鏈Thr27Arg，B鏈C53高效胰島素根據(jù)已獲得的胰島素分子結(jié)構(gòu)模型和生化工作，人們設(shè)計了可以加強胰島素與受體親和性的胰島素突變體，以提高胰島素的生理活性B鏈His10Asp：體外活性比野生型提高了5倍高效胰島素根據(jù)已獲得的胰島素分子結(jié)構(gòu)模型和生化工作，人們設(shè)計5404蛋白質(zhì)工程制藥S1蛋白質(zhì)工程制藥概述S2蛋白質(zhì)工程的基本技術(shù)S3蛋白質(zhì)工程制藥實例04蛋白質(zhì)工程制藥S1蛋白質(zhì)工程制藥概述55S1蛋白質(zhì)工程制藥概述從基因工程藥物到蛋白質(zhì)工程藥物蛋白質(zhì)工程的誕生、概念蛋白質(zhì)工程的基本過程蛋白質(zhì)分子設(shè)計S1蛋白質(zhì)工程制藥概述從基因工程藥物到蛋白質(zhì)工程藥物56基因工程藥物蛋白質(zhì)工程藥物1982年第一個基因工程藥物：重組人胰島素重組蛋白存在問題：1、穩(wěn)定性差：體內(nèi)半衰期短2、藥理活性不夠強：使用劑量偏大3、毒副作用大4、生產(chǎn)工藝復(fù)雜蛋白質(zhì)工程藥物基因工程藥物蛋白質(zhì)工程藥物1982年第一個基因工程藥物：重57蛋白質(zhì)工程的誕生1970S末，Smith等人建立了寡核苷酸點突變改變DNA序列的方法1982年，一些實驗室用此技術(shù)來改造蛋白質(zhì)分子，研究蛋白質(zhì)的功能1983年，Ulmer發(fā)表了題為“ProteinEngineering”的專論目前已應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，并有多種產(chǎn)品上市蛋白質(zhì)工程的誕生1970S末，Smith等人建立了寡核苷酸點58已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短2、藥理活性不夠強3、毒副作用大4、生產(chǎn)工藝復(fù)雜已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短59已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短2、藥理活性不夠強3、毒副作用大4、生產(chǎn)工藝復(fù)雜已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短60已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短2、藥理活性不夠強3、毒副作用大4、生產(chǎn)工藝復(fù)雜已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短61蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）(第二代基因工程)是以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的知識為基礎(chǔ)，通過周密的分子設(shè)計以及DNA重組技術(shù)，把天然的蛋白質(zhì)改造成合乎人類需要的新的突變蛋白質(zhì)(mutein)的一項技術(shù)。蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineer62蛋白質(zhì)工程的概念內(nèi)涵：1、從DNA水平改變基因，改造蛋白質(zhì)2、一個或多個氨基酸殘基結(jié)構(gòu)域全新蛋白質(zhì)3、有目的地改造，獲得期望功能——強調(diào)分子設(shè)計4、結(jié)合DNA重組技術(shù)從不同尺度改造蛋白質(zhì)工程的概念內(nèi)涵：從不同尺度改造63蛋白質(zhì)工程的基本過程蛋白質(zhì)工程的基本過程64蛋白質(zhì)工程的基本過程1、分離純化所需改造的目的蛋白2、對蛋白進行氨基酸序列測定、X射線晶體衍射分析、核磁共振分析等——結(jié)構(gòu)和功能信息3、根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能信息、生物信息學信息，運用蛋白質(zhì)分子預(yù)測技術(shù)提出蛋白質(zhì)設(shè)計方案4、分離克隆該蛋白編碼基因，并進行突變改造5、插入適當?shù)妮d體表達6、分離純化表達產(chǎn)物，檢測其生物學功能實驗設(shè)計實驗蛋白質(zhì)工程的基本過程1、分離純化所需改造的目的蛋白實驗設(shè)計實65蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件66蛋白質(zhì)分子設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的三個基本條件：1、蛋白質(zhì)分子的基本知識：理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能、構(gòu)象規(guī)律2、對具體改造的蛋白質(zhì)分子必須有一個系統(tǒng)、全面和深入的了解3、分子設(shè)計的基本工具：高性能的計算機硬件、功能齊全的計算機軟件——只有在此基礎(chǔ)上，才能應(yīng)用蛋白質(zhì)分子預(yù)測技術(shù)，提出合理的設(shè)計方案三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的三個基本條件：1、蛋白質(zhì)分子的67蛋白質(zhì)分子設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類1、小范圍改造：對已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進行少數(shù)幾個殘基的替換、部分片段的缺失，改善蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能。2、較大程度的改造：根據(jù)需求對來源于不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進行拼接組裝，或在蛋白質(zhì)分子中進行大范圍肽鏈替換、結(jié)構(gòu)域替換，獲得多功能復(fù)合體。3、蛋白質(zhì)從頭設(shè)計（denovoproteindesign）三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類1、小范圍改造：對已知結(jié)構(gòu)68概念：從蛋白質(zhì)分子一級結(jié)構(gòu)出發(fā)，設(shè)計制造自然界中不存在的全新蛋白，使之具有特定的空間結(jié)構(gòu)和預(yù)期的生物功能。1、需要扎實的理論基礎(chǔ)2、在分子設(shè)計與試驗驗證之間交互進行蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略概念：從蛋白質(zhì)分子一級結(jié)構(gòu)出發(fā)，設(shè)計制造自然界中不存在的全新69PDA循環(huán)（ProteinDesignAutomation）1、設(shè)計模擬實驗分析2、不斷循環(huán)：一步步的修正最終獲得成功蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計計算機模擬基因構(gòu)建突變蛋白質(zhì)產(chǎn)物功能分析三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略PDA循環(huán)（ProteinDesignAutomatio70蛋白質(zhì)從頭合成的范例

凋亡誘導(dǎo)肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2KLAKLAK：可形成典型的兩親-螺旋結(jié)構(gòu)，進入細胞后，可破壞線粒體膜引起細胞凋亡NGR：與新生血管的內(nèi)皮細胞特異結(jié)合，起到靶向彈頭的作用蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略蛋白質(zhì)從頭合成的范例KLAKLAK：可形成典型的兩親-螺旋71利用NGR為彈頭，將KLALAK肽特異地導(dǎo)向腫瘤部位的新血管內(nèi)皮細胞，通過抑制新血管的生成，從而抑制腫瘤的形成，且對其他細胞沒有明顯的毒性。300mol/L3mol/L蛋白質(zhì)從頭合成的范例凋亡誘導(dǎo)肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略利用NGR為彈頭，將KLALAK肽特異地導(dǎo)向腫瘤部位的新72蛋白質(zhì)從頭合成的范例凋亡誘導(dǎo)肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計考慮的其他因素1、Gly-Gly接頭：防止兩功能部位的立體結(jié)構(gòu)相互影響。2、L-型氨基酸（D-型）：防止蛋白酶的降解三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略蛋白質(zhì)從頭合成的范例蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計考慮的其他因73蛋白質(zhì)從頭合成的范例凋亡誘導(dǎo)肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計實驗結(jié)果1、特異地被激活的新生血管內(nèi)皮細胞內(nèi)吞，引起凋亡2、在小鼠腫瘤模型中，可抑制腫瘤的生長，明顯延長治療組小鼠的存活時間3、對健康小鼠超劑量使用時，沒有毒副作用的產(chǎn)生三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略蛋白質(zhì)從頭合成的范例蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計實驗結(jié)果1、741、順式思維理性化設(shè)計

——合理化設(shè)計2、基于各種功能篩選平臺的非理性逆向改造策略

——非理性的體外進化3、兩種策略的結(jié)合蛋白質(zhì)分子設(shè)計的策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略1、順式思維理性化設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個751、順式思維理性化設(shè)計——合理化設(shè)計基于現(xiàn)有知識信息：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能；因此，受到已有認識水平的制約。蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略1、順式思維理性化設(shè)計蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的策略蛋白762、基于各種功能篩選平臺的非理性逆向改造策略——非理性的體外進化1）構(gòu)建包含眾多突變蛋白的文庫：隨機突變、DNA改組等2）篩選文庫：從功能入手進行篩選所需要的蛋白3）進行蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)、序列信息的分析蛋白質(zhì)分子設(shè)計的策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略2、基于各種功能篩選平臺的非理性逆向改造策略——非理性的體外773、兩種策略的結(jié)合非理性的體外進化：彌補合理性化設(shè)計應(yīng)用中的局限性，并且迅速得到大量有功能的目標分子，通過分析積累所需的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)信息合理化設(shè)計：對非理性篩選出的候選分子進行合理化的分子修正，使之進一步符合實際需求蛋白質(zhì)分子設(shè)計的策略蛋白質(zhì)分子設(shè)計三個基本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類蛋白質(zhì)從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計策略3、兩種策略的結(jié)合非理性的體外進化：彌補合理性化設(shè)計應(yīng)用中的78S2蛋白質(zhì)工程的基本技術(shù)定點突變技術(shù)隨機突變技術(shù)1、寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變2、PCR介導(dǎo)的定點突變3、盒式突變4、易錯PCR5、DNA改組技術(shù)S2蛋白質(zhì)工程的基本技術(shù)定點突變技術(shù)隨機突變技術(shù)1、寡核苷79易錯PCR連續(xù)易錯PCR（sequentialerror-pronePCR）：經(jīng)以上一次PCR突變的基因很難獲得滿意的結(jié)果，于是將前一輪PCR擴增得到的有用突變基因作為下一輪PCR的模板，每次獲得的突變累積起來，產(chǎn)生重要的有益突變?？蛇z傳的變化只發(fā)生在單一分子內(nèi)部，屬于無性進化（asexualevolution）易錯PCR（error-pronePCR）：利用缺乏修復(fù)功能的Taq酶，并設(shè)置容易引起出錯的PCR反應(yīng)條件，在擴增目的基因的同時引入堿基錯配，導(dǎo)致目的基因隨機突變——完全隨機化易錯PCR連續(xù)易錯PCR（sequentialerror-80易錯PCR優(yōu)點：簡便易行不足：突變文庫規(guī)模有限，有益突變少，后續(xù)篩選工作費力、耗時，只適用于較小的基因片段（<800bp）易錯PCR優(yōu)點：簡便易行不足：突變文庫規(guī)模有限，有益突變少81DNA改組技術(shù)DNA改組（DNAshuffling），又叫有性PCR（sexual-PCR）等，將單一基因隨機片段化，這些片段自配對PCR擴增，由于易錯PCR而引入大量隨機突變，并在多次循環(huán)中重組，使基因在體外迅速進化，從中篩選到有益重組。優(yōu)點：體外定向進化，快速，高效（蛋白質(zhì)、酶、抗體等）DNA改組技術(shù)DNA改組（DNAshuffling），又叫82DNA改組技術(shù)DNA改組技術(shù)8304蛋白質(zhì)工程制藥匯總課件84基因家族改組DNA改組的不足：從單一基因出發(fā)，得到的隨機點突變率很低，且有益突變的積累相對緩慢在自然界中，不同物種同源基因本身就是具有非常豐富的變異，如果加以利用，就可以大大地加速基因在體外的進化速度——基因家族改組（DNAfamilyshuffling）基因家族改組DNA改組的不足：從單一基因出發(fā)，得到的隨機點突85基因家族改組基因家族改組8604蛋白質(zhì)工程制藥匯總課件87S3蛋白質(zhì)工程制藥實例蛋白質(zhì)工程在新藥研究中的應(yīng)用胰島素的蛋白質(zhì)工程研究S3蛋白質(zhì)工程制藥實例蛋白質(zhì)工程在新藥研究中的應(yīng)用88蛋白質(zhì)工程在新藥研究中的應(yīng)用1、提高藥效活性2、提高靶向性3、提高穩(wěn)定性、改善藥代動力學特性4、提高工業(yè)生產(chǎn)效率5、降低蛋白藥物引起的免疫反應(yīng)6、獲得具有新功能的蛋白分子7、獲得特定蛋白的拮抗物或類似物8、模擬原型蛋白分子結(jié)構(gòu)開發(fā)小分子模擬肽類藥物蛋白質(zhì)工程在新藥研究中的應(yīng)用1、提高藥效活性5、降低蛋白藥物89胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥1、糖尿病I型糖尿?。篒I型糖尿?。阂葝u素抵抗（IR）為主，伴胰島素相對缺乏；以及胰島素分泌缺陷，伴IR由于細胞介導(dǎo)的胰島B細胞自身免疫性破壞，導(dǎo)致胰島素絕對缺乏胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥I型糖尿病：90胰島素的蛋白質(zhì)工程研究閉環(huán)系統(tǒng)：自調(diào)控競爭解吸附作用胰島素的蛋白質(zhì)工程研究閉環(huán)系統(tǒng)：自調(diào)控91胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥1、糖尿病中國4000萬，全球1.5億患者急性并發(fā)癥：

酮癥酸中毒（I，昏迷、死亡）非酮癥高滲性昏迷（II）低血糖反應(yīng)（心慌、手抖、饑餓、出冷汗）胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥中國400092胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥1、糖尿病中國4000萬，全球1.5億患者慢性并發(fā)癥（可遍及全身各重要器官）：心血管疾病、慢性腎病視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥中國400093胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥2、胰島素胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥94胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥2、胰島素胰島素從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價格之高可想而知。胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥95胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥2、胰島素1982年，重組人胰島素上市——第一個基因工程藥物！第一個完成序列測定的蛋白質(zhì)（1958年）第一個人工合成的蛋白質(zhì)（1965年）Sanger

胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥第一個完成序96胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥2、胰島素每100L發(fā)酵液就能產(chǎn)生5g胰島素，使其價格降低了30%-50%!提取4-5g胰島素需要100Kg胰腺胰島素的蛋白質(zhì)工程研究胰島素是治療糖尿病的特效藥