病毒的純化與保存課件

病毒的純化和保存病毒純化目的(了解)為了了解病毒的結(jié)構(gòu)、傳染與免疫、遺傳與變異等性質(zhì)，常常需要高純度的病毒病毒純化原理(熟悉)利用物理或化學(xué)的方法盡可能地去除宿主細(xì)胞中的組分，將病毒從其宿主細(xì)胞內(nèi)提純出來，在純化過程中保持病毒的生物活性和感染性。細(xì)胞破碎方法(熟悉)超聲破碎：密集的小氣泡迅速炸裂，破壞細(xì)胞高壓勻漿：機(jī)械切割力高速珠磨：玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑

酶溶法：溶菌酶、蛋白酶、葡聚糖酶化學(xué)滲透：滲透壓改變使細(xì)胞破裂反復(fù)凍融：形成冰晶，使細(xì)胞膨脹破裂病毒純化方法

聚乙二醇(PEG)濃縮法PEG是環(huán)氧乙烷和水縮合而成的水溶性非離子聚合物，無毒、無刺激性。平均分子量不同，性質(zhì)也有差異。分子量200～600者常溫下是無色無臭粘稠液體，分子量在600以上者就逐漸變?yōu)榘牍腆w狀、蠟狀固體。隨著分子量的增大，其吸濕能力相應(yīng)降低。不同分子量PEG性質(zhì)比較聚乙二醇(PEG)濃縮法(掌握)(2)液體濃縮法

超過濾法(熟悉)原理：利用超濾膜將水、鹽及小分子濾過，將大分子或病毒等顆粒截留。超濾膜孔徑要比病毒顆粒小只能去除比病毒小的細(xì)胞碎塊凝膠吸附法-磷酸鈣凝膠常用的凝膠，由0.5mol/LCaCl2和0.5mol/LNa2HPO4溶液混合制備凝膠狀沉淀物，用0.001mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮，置于4℃4～5天，使之充分沉淀后應(yīng)用。凝膠吸附法-氫氧化鋅凝膠是由7mol/L氨水與0.1mol/L醋酸鋅溶液滴加混合(pH8.5)制備，在制備后數(shù)小時(shí)內(nèi)較穩(wěn)定。方法：將水泡性口炎病毒懸液與氫氧化鋅凝膠混合，使它們形成復(fù)合體后沉淀，然后用0.08mol/LEDTA(pH8.5)解離回收病毒。凝膠吸附法-焦磷酸鎂凝膠是由0.1mol/L焦磷酸鈉和0.1mol/LMgCl2，以2：10(體積)比例在室溫中緩慢滴加混合而獲得的較穩(wěn)定的焦磷酸鎂凝膠。將牛痘病毒懸液同此凝膠混合，使病毒吸附于凝膠，然后用0.1mol/L鹽水洗2次，最后用0.3mol/L枸櫞酸鈉溶液解離病毒，將病毒較好地回收于水相中。紅細(xì)胞吸附法(熟悉)用于某些與紅細(xì)胞吸附的病毒的濃縮選擇適宜的動(dòng)物紅細(xì)胞：雞紅細(xì)胞基本步驟：1)1%-3%的紅細(xì)胞與病毒懸液混合，2吸附1h以上；2)1000r/min離心10分鐘，沉淀吸附病毒的紅細(xì)胞，棄上清，生理鹽水洗滌2次；3)用1/50原體積的磷酸緩沖液重懸紅細(xì)胞沉淀，在37保溫2-3h；4)1000r/min離心10分鐘，上清即是濃縮的病毒懸液。葡聚糖柱層析法(熟悉)葡聚糖凝膠是指由葡聚糖與其它交聯(lián)劑交聯(lián)而成的凝膠。最常見的是Sephadex系列，主要型號(hào)是G-10~G-200，后面的數(shù)字是凝膠的吸水率(單位是mL/g干膠)乘以10。如SephadexG-50，表示吸水率是5mL/g干膠。葡聚糖柱層析法將初步濃縮的材料，通過葡聚糖G150或G200柱層析，然后用0.02～0.15mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.6)洗脫，分部收集，測(cè)定280nm波長(zhǎng)處的OD值，滴定各部分的效價(jià)，將含病毒的各部分相混合，再濃縮，透析之后，即可得到比較純的病毒。Nagano(1989年)用Sephacryls-1000柱層析純化了雞傳染性支氣管炎病毒。葡聚糖柱層析法差速離心法(掌握)原理：不同大小和比重的粒子有不同的沉降速度適合分離沉降速度差別較大的粒子適用于從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或經(jīng)過紅細(xì)胞吸附-釋放的病毒懸液中提純病毒。優(yōu)點(diǎn)：能迅速處理大量樣品，作為病毒提純精制的第一步常用方法(熟悉)：以低速(2000-3000r/min)及中速(10000r/min)離心20-30分鐘去除較大的宿主細(xì)胞碎片、污染的細(xì)菌及其它較大的雜質(zhì)，再選擇較高速度離心1-2h使病毒沉淀。差速離心法10％～40％蔗糖密度梯度制備

首先配置好不同百分比(w/v)的蔗糖溶液，然后在離心管中先加入濃度最?。?0%）的溶液，然后用吸管加入濃度稍大的溶液，注意，加時(shí)吸管要插入離心管的底部，緩慢加入，務(wù)求界面分明。然后按上法依次分層加入其余各濃度的蔗糖溶液，即可配成蔗糖梯度液。

將事先用更低密度蔗糖溶液（小于10%）懸浮的樣品輕輕加入10%蔗糖溶液的表面，進(jìn)行密度梯度離心即可。

梯度混合儀等密度梯度離心(掌握)原理：與密度梯度法相同，但不制備梯度介質(zhì)，而是在樣品中加入CsCl，離心過程中CsCl隨離心力而下沉，形成連續(xù)密度梯度，樣品中顆粒隨其密度大小而下沉或上浮到相等密度梯層中。每毫升病毒懸液加1g的CsCl，混勻，40000g離心24-36h。PAGE：聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法：化學(xué)聚合法?；瘜W(xué)聚合以過硫酸銨（APS）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。連續(xù)與不連續(xù)PAGEPAGE按照緩沖液的pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)PAGE不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳是指使用不同孔徑和不同緩沖系統(tǒng)的電泳，它由濃縮膠和分離膠兩部分所組成。由于濃縮膠的堆積（濃縮）作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度的凝膠上進(jìn)行分離。樣品顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較連續(xù)電泳系統(tǒng)佳。SDSSDS：十二烷基磺酸鈉(重點(diǎn))SDS是陰離子去垢劑，使蛋白質(zhì)變性解聚，并與蛋白質(zhì)結(jié)合成帶強(qiáng)負(fù)電荷的復(fù)合物，掩蓋了蛋白質(zhì)之間原有電荷的差異，使各種蛋白質(zhì)的電荷／質(zhì)量比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)遷移率主要取決于蛋白質(zhì)分子大小。SDS也稱變性PAGE通常采用不連續(xù)垂直型系統(tǒng)濃縮膠、分離膠濃縮膠分離膠首次應(yīng)用SDS的論文(了解)LaemmliUK(1970).CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature227:680-685.SDS實(shí)驗(yàn)步驟(熟悉)

1、清洗、烘干、組裝電泳器材SDS實(shí)驗(yàn)步驟

2、1%瓊脂封底SDS實(shí)驗(yàn)步驟

3、配制分離膠SDS實(shí)驗(yàn)步驟

4、灌注分離膠灌注完后，加水覆蓋隔絕空氣，同時(shí)可使界面平整一般20-30分鐘凝固SDS實(shí)驗(yàn)步驟

5、配制、灌注濃縮膠，插上梳子SDS實(shí)驗(yàn)步驟

5、往電泳槽加電泳緩沖液，上樣2×上樣緩沖液(樣品溶解液LoadingBuffer)：SDS,琉基乙醇，甘油，溴酚藍(lán)，Tris-HCl緩沖溶液。蛋白樣品與上樣緩沖液1:1混合，沸水浴3分鐘，離心，上樣其中一個(gè)上樣孔：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)電泳緩沖液(電極緩沖液)包含SDS一般配制成10×或5×SDS實(shí)驗(yàn)步驟

6、連接電源，電泳開始SDS實(shí)驗(yàn)步驟

7、電泳結(jié)束，剝膠，染色，脫色染色液：考馬斯亮藍(lán)；銀染法用硝酸銀脫色液：甲醇/異丙醇+醋酸按下式計(jì)算相對(duì)遷移率：

每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分子量，這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。=

蛋白樣品距加樣端遷移距離cm溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離cm

相對(duì)遷移率8、蛋白相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定(重點(diǎn))當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15,000－200,000之間時(shí)，樣品的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。符合如下方程式：LgMW=－bmR+K其中，MW為蛋白質(zhì)的分子量，mR為相對(duì)遷移率，b為斜率，K為截距。當(dāng)條件一定時(shí)，b與K均為常數(shù)因此通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較，就可以得出未知蛋白的分子量SDS實(shí)驗(yàn)步驟

8、蛋白相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定注意的問題蛋白質(zhì)電泳常用的SDS：?jiǎn)我粊喕M成的蛋白質(zhì)非變性PAGE：多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)

未聚合的聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套WesternBlot蛋白質(zhì)鑒定SouthernBlot：DNANorthernBlot：RNAWesternBlot：?jiǎn)蜗螂娪竞蟮牡鞍踪|(zhì)印跡EasternBlot：雙向電泳后的蛋白質(zhì)印跡EdwinMellorSouthernWesternBlot蛋白質(zhì)鑒定原理(重點(diǎn)掌握)：將SDS上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，讓第一抗體與膜上的目的蛋白質(zhì)的抗原決定簇結(jié)合，然后用經(jīng)過特定酶標(biāo)記的第二抗體結(jié)合第一抗體，加入酶的顯色底物即可檢測(cè)的目的蛋白條帶存在與否。WesternBlot步驟(熟悉)1、SDS電泳結(jié)束后，不染色，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，把SDS凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜或PVDF膜上。(注意凝膠和膜的放置方向)

WesternBlot步驟2、膜的染色(麗春紅、氨基黑)判斷凝膠上的蛋白是否已經(jīng)轉(zhuǎn)移到膜上；記錄蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)/樣品的位置；WesternBlot步驟3、磷酸緩沖液漂洗，進(jìn)行膜的脫色4、膜的封閉封閉是用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)封閉膜上未被占據(jù)的表面，使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。常用的封閉液有牛血清白蛋白BSA，脫脂奶粉等，一般用脫脂奶粉。將膜浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時(shí)。WesternBlot步驟5、結(jié)合一抗(與目的蛋白結(jié)合)

將膜轉(zhuǎn)移到含一抗的封閉液中，室溫下輕搖孵育一小時(shí)。緩沖液洗滌三次

6、一抗與二抗結(jié)合

二抗是一抗的抗體

如果一抗是通過免疫兔子制備，即選擇抗兔的二抗，如羊抗兔、鼠抗兔等。緩沖液洗滌三次WesternBlot步驟7、顯色

(1)生物素-親合素系統(tǒng)生物素(biotin)標(biāo)記二抗，生物素容易與親和素(avidin)結(jié)合,而親和素事先已進(jìn)行酶標(biāo)記，如過氧化物酶，則形成生物素-親和素-過氧化物酶復(fù)合物

加入底物，即可顯色WesternBlot步驟7、顯色

(2)辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)HRP經(jīng)過碘酸鈉氧化而標(biāo)記到二抗，顯色底物：二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、氯萘酚和氨乙基咔唑等。病毒的保存(掌握)1、低溫及超低溫保存法

低溫(-20~-60℃)、超低溫(-70℃以下)冰箱液氮罐(-150~-196℃)溫度越低，保存時(shí)間越長(zhǎng)；常用保護(hù)劑：脫脂牛奶、5%蔗糖、血清用保護(hù)劑配制病毒懸液或與病毒懸液混合病毒的保存2、冷凍干燥保存

原理：微生物懸液冷凍后，在真空中使水分由固體直接升華為氣體，在低溫、干燥和缺氧環(huán)境下，微生物的生長(zhǎng)和代謝暫時(shí)停止，因此保存期較長(zhǎng)，便于運(yùn)輸。病毒的保存2、冷凍干燥保存保護(hù)劑：脫脂牛奶或血清保護(hù)劑作用原理：在冷凍干燥的脫水過程中穩(wěn)定病毒結(jié)構(gòu)，防止病毒受冷凍或干燥而造成損傷。2、冷凍干燥保存步驟(1)準(zhǔn)備安瓿管(高壓滅菌后備用)2、冷凍干燥保存步驟(2)制備保護(hù)劑：脫脂牛奶取市售新鮮、清潔、無抗生素污染的牛奶200g，在5000r/min下離心10分鐘，除去上層奶皮，