新冠核酸混采樣本檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

新冠核酸混米樣本檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程檢驗(yàn)?zāi)康捏w外定性檢新冠(2019-nCoV)0RF1ab和N基因,用于新冠感染的體檢篩查。檢測(cè)原理與方法對(duì)新冠(2019-nCoV)0RF1ab及編碼核衣殼蛋白N基因的特異性保守序列為靶區(qū)域,進(jìn)行了雙靶標(biāo)基因的設(shè)計(jì),配以PCR反應(yīng)液,在熒光定量PCR儀上,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù),通過熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)樣本RNA的檢測(cè)。PCR檢測(cè)體系包含有內(nèi)源性的內(nèi)標(biāo)引物和探針,通過檢測(cè)內(nèi)標(biāo)是否正常來監(jiān)測(cè)樣本采集、提取過程,避免假陰性結(jié)果。職責(zé)保證分子生物組實(shí)驗(yàn)室對(duì)于新冠(2019-nCoV)篩查檢測(cè)結(jié)果的可靠性。性能特征4.1準(zhǔn)確性檢測(cè)企業(yè)陽性參考品,結(jié)果均為陽性。4.2特異性本試劑盒與冠狀病毒(NL63,HKU1,229E,0C43)、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒Yamagata型‘Victoria型、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、呼吸道合胞病毒A、B型、鼻病毒A、B、C型、腺病毒1、2、3、4、5、7、55型、副流感病毒1、2、3型、腸病毒A、B型、腸病毒C型(EV-C95)、腸病毒D型(EV-D70)、偏肺病毒、人間質(zhì)肺病毒、新生隱球菌、化膿性性鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺抱子蟲、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、嗜肺軍團(tuán)菌、百日咳桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎衣原體、EB病毒、人巨細(xì)胞病毒、煙曲霉、白色念球菌、光滑念珠菌、結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、諾如病毒、輪狀病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人類基因組DNA等陽性樣本無交叉反應(yīng)。檢測(cè)企業(yè)陰性參考品均為陰性。4.3精密度批內(nèi)精密度Ct值的變異系數(shù)（CV,%）＜5%04.4最低檢測(cè)限本試劑盒最低檢測(cè)限為200copies/mLo標(biāo)本類型及要求5.1樣本類型:咽拭子、肺泡灌洗液。5.2樣本采集：5.2.1咽拭子：用1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁,將拭子頭浸入含1.5ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中,尾部棄去,旋緊管蓋。5.2.2肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經(jīng)過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管,將其頂端契入支氣管分支開口,經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水,每次30?50ml,總量100?250ml,不應(yīng)超過300ml。5.3樣本滅活：將樣本保存管置于金屬浴56°C以上保持30分鐘。5.4樣本保存和運(yùn)送:待測(cè)樣本可立即用于處理,能在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)本可置于4C保存；24小時(shí)內(nèi)無法檢測(cè)的標(biāo)本則應(yīng)置于-70C或以下保存（如無-70C保存條件,待測(cè)樣本可于-20C保存10天,核酸樣本-20±5C保存15天）。應(yīng)避免反復(fù)凍融。樣本運(yùn)送采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。標(biāo)本包裝和運(yùn)輸6.1標(biāo)本采集后在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)分裝。6.2所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里,擰緊。容器外注明樣本編號(hào)、種類、姓名及采樣日期。6.3將密閉后的標(biāo)本放入大小合適的塑料袋內(nèi)密封,每袋裝一份標(biāo)本。樣本包裝要求要符合《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。6.4涉及外部標(biāo)本運(yùn)輸?shù)?應(yīng)根據(jù)標(biāo)本類型,按照A類感染性物質(zhì)進(jìn)行三層包裝。試劑和儀器7.1試劑：新冠2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）7.1.1試劑來源：湖南圣湘生物科技有限公司7.1.2試劑組份：序號(hào)試劑名稱規(guī)格與裝量主要成分12019-nCoV-PCR-反應(yīng)液624uL/管引物(4.62%)、探針(1.15%)、dNTPs(3.85%)、MgCl2(0.77%)、Rnasin(0.48%)、PCRbuffer(89.13%)22019-nCoV-PCR-酶混合液96uL/管RT酶(62.5%)、Taq酶(37.5%)32019-nCoV-PCR-陽性對(duì)照500uL/管含目標(biāo)基因（ORF1ab、N基因）、內(nèi)標(biāo)基因片段（RnaseP）的體外轉(zhuǎn)錄RNA42019-nCoV-PCR-陰性對(duì)照500uL/管生理鹽水7.1.3開啟所有試劑需注明日期及簽名。每個(gè)試劑盒都應(yīng)貼有下面標(biāo)簽：物質(zhì)名稱、批號(hào)、特殊儲(chǔ)藏說明、開蓋人、開蓋日期、開蓋后有效期。開啟時(shí)應(yīng)檢查試劑是否變色,是否有肉眼可見的細(xì)菌生長(zhǎng)跡象、濁度、沉淀反應(yīng)等,這些表示已經(jīng)變質(zhì)或超過保質(zhì)期。7.1.4試劑應(yīng)避光密閉,試劑組分保存于-20±5°C。7.1.5生產(chǎn)日期,失效日期請(qǐng)見外包裝盒。不使用時(shí),這些試劑在包裝標(biāo)識(shí)的效期內(nèi)可穩(wěn)定存放。一旦使用,擴(kuò)增試劑盒反復(fù)凍融應(yīng)不超過3次。7.2儀器：適用于上海宏石SLAN96熒光PCR儀。環(huán)境和安全控制8.1檢測(cè)環(huán)境：PCR實(shí)驗(yàn)室條件達(dá)到生物安全二級(jí)及以上。8.2安全控制：8.2.1檢驗(yàn)人員個(gè)人防護(hù)應(yīng)達(dá)到生物安全三級(jí),至少穿戴工作服、一次性工作帽、雙層手套、醫(yī)用一次性防護(hù)服、醫(yī)用防護(hù)口罩（N95及以上）或動(dòng)力送風(fēng)過濾式呼吸器、防護(hù)面屏或護(hù)目鏡、工作鞋或膠靴、防水靴套。必要時(shí),可加穿防水圍裙或防水隔離衣。根據(jù)目前實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地設(shè)置要求,個(gè)人防護(hù)設(shè)備在試劑配置區(qū)緩沖間進(jìn)行穿戴齊全后再進(jìn)入核心工作區(qū)。8.2.2避免過度勞累,并及時(shí)對(duì)其健康情況進(jìn)行監(jiān)測(cè),注意監(jiān)測(cè)自身及身邊檢驗(yàn)人員體溫和呼吸系統(tǒng)癥狀。8.2.3防護(hù)裝備脫卸的注意事情：脫卸時(shí)盡量少接觸污染面。脫下的防護(hù)眼罩、長(zhǎng)筒膠鞋等非一次性使用的物品應(yīng)直接放入盛有消毒液的容器內(nèi)浸泡；其余一次性使用的物品應(yīng)放入黃色醫(yī)療廢物收集袋中作為醫(yī)療廢物集中處置。脫卸防護(hù)裝備的每一步均應(yīng)進(jìn)行手消毒,所有防護(hù)裝備全部脫完后再次洗手、手消毒。8.2.4如果操作人員的皮膚或衣物上沾到了血液及廢液,應(yīng)立刻用清水沖洗并進(jìn)行消毒處理。如果眼睛被濺入血液及廢液,用大量的清水沖洗并采取必要的醫(yī)療措施。8.2.5工作臺(tái)在每天工作結(jié)束后用10%的次氯酸鈉溶液清洗,空間用紫外線照射60分鐘。8.2.6此試劑為體外用,試劑含有防腐劑和穩(wěn)定劑,存在一定的危險(xiǎn)性；不要入口,避免和眼睛,皮膚或衣服接觸。8.2.7醫(yī)療廢物處理：本檢測(cè)所產(chǎn)生的全部廢棄物均應(yīng)按《安全手冊(cè)》中有關(guān)規(guī)定執(zhí)行并遵循《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》的要求,規(guī)范使用雙層黃色醫(yī)療廢物收集袋封裝后按照常規(guī)處置流程進(jìn)行處置。操作步驟9.1試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）；9.1.1取出盒中的各組分,室溫放置,待其溫度平衡至室溫后,混勻后備用；9.1.2根據(jù)待測(cè)樣本數(shù)量,陽性對(duì)照和陰性對(duì)照數(shù)量,按比例（2019-nCoV-PCR反應(yīng)液26 /人份+2019-nCoV-PCR-酶混合液4pL/人份）取相應(yīng)量的組分,充分混勻成PCR混合液,瞬時(shí)離心后備用；9.1.3將上述準(zhǔn)備好的試劑轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),待用。9.2樣本處理（在樣本處理區(qū)進(jìn)行）9.2.1新冠2019-Ncov磁珠法提取核酸檢測(cè)（混米樣本）使用S10015核酸提取或純化試劑盒提取核酸9.2.1.1按照S10015-洗滌液2標(biāo)簽指示,使用前加入相應(yīng)量的無水乙醇。9.2.1.2根據(jù)樣本數(shù)量,將蛋白酶K（20pL/人份）和S10015-磁珠溶液（30pL/人份）按照比例混合成蛋白酶K-磁珠混合液,震蕩混勻,低速瞬時(shí)離心。9.2.1.3根據(jù)待測(cè)樣本數(shù)量取1.5ml離心管假設(shè)干,每管加入300pL樣品,每一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)一份弱陽性對(duì)照、一份陽性對(duì)照、三個(gè)陰性對(duì)照；4加入500pLS10015-提取溶液1和50pL蛋白酶K-磁珠混合液；蓋上管蓋,震蕩混勻30s,60°C加熱10min.9.2.1.5室溫靜置Imin,低速瞬時(shí)離心,將離心管置于磁性分離器上,5min后吸棄廢液（注意不要碰到吸附于管壁內(nèi)側(cè)的磁珠）；9.2.1.6加入700pLS10015-洗滌液1,震蕩混勻30s,低速瞬時(shí)離心后將離心管再次置于磁性分離器。磁吸3min,將液體完全吸出丟棄（注意不要碰到吸附于管壁內(nèi)側(cè)的磁珠）；7加入700pLS10015-洗滌液2,震蕩混勻30s,低速瞬時(shí)離心后將離心管再次置于磁性分離器。磁吸3min,將液體完全吸出丟棄,繼續(xù)于磁性分離器上靜置2min,將液體完全吸盡。（注意不要碰到吸附于管壁內(nèi)側(cè)的磁珠；假設(shè)此時(shí)洗滌液并非無色透明,需重復(fù)該步驟）；8室溫開蓋靜置5min（乙醇?xì)埩魰?huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成不良影響,需保證乙醇充分揮發(fā)；同時(shí)不要干燥太長(zhǎng)時(shí)間,以免磁珠掛壁難以洗脫）。9.2.1.9加入60pLS10015-洗脫液S,震蕩混勻30s,將離心管壁上磁珠洗脫到管底,室溫靜置5min；低速瞬時(shí)離心將離心管再次置于磁性分離器上磁吸3min,然后將洗脫下來的核酸轉(zhuǎn)移到干凈的1.5mL離心管中。9.2.1.10根據(jù)樣本數(shù)量,取相應(yīng)量的八連管,各管分別加入提取好的待測(cè)標(biāo)本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照及弱陽性對(duì)照各20pL,將30應(yīng)配制好的PCR-混合液加入到裝有20pL核酸的PCR擴(kuò)增管中,蓋好八連管蓋。9.2.3將上述準(zhǔn)備好的八連排轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)處理區(qū),準(zhǔn)備上機(jī)擴(kuò)增。9.3PCR擴(kuò)增9.3.1確定UPS工作狀況正常后啟動(dòng)控制電腦,開上海宏石SLAN96P電源開關(guān),打開電腦并雙擊桌面“SLAN8.2.2〞圖標(biāo),打開軟件。9.3.2項(xiàng)目創(chuàng)建：首次操作需要進(jìn)行項(xiàng)目創(chuàng)建,在軟件最上方的項(xiàng)目欄點(diǎn)擊項(xiàng)目創(chuàng)建,以后使用時(shí)就只需要調(diào)用相應(yīng)項(xiàng)目程序就可以了。選擇熒光檢測(cè)通道選擇：1）選擇FAM（0RF-1ab區(qū)域）和R0X（N基因）通道檢測(cè)2019-nCoV病毒核酸；2）選擇HEX通道檢測(cè)內(nèi)標(biāo),設(shè)定循環(huán)參數(shù)完成創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。循環(huán)參數(shù):步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)1逆轉(zhuǎn)錄50°C30分鐘12cDNA預(yù)變性95°C1分鐘13變性95°C15秒45退火,延伸及災(zāi)光米集60°C30秒4儀器冷卻25°C10秒19.3.3完成項(xiàng)目創(chuàng)建后,點(diǎn)擊“HOME〞進(jìn)行基本設(shè)置,彈出的對(duì)話框中編輯所創(chuàng)建的項(xiàng)目名稱+樣本號(hào)+日期,實(shí)驗(yàn)名稱以及保存到相應(yīng)的文件夾下,點(diǎn)擊“孔板編輯〞選擇實(shí)驗(yàn)需要運(yùn)行模塊,選擇項(xiàng)目程序,選擇“實(shí)驗(yàn)分析〞模塊下點(diǎn)擊開始運(yùn)行擴(kuò)增程序。9.3.4樣本信息編輯將：將陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及待測(cè)樣本的點(diǎn)樣順序設(shè)置并設(shè)置樣本名稱和實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。9.3.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果,對(duì)檢測(cè)靶標(biāo)以及內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增曲線分別進(jìn)行分析。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,Start值可以在3?15、End值可設(shè)在5?20,調(diào)整陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線使其平直或低于閾值線）,點(diǎn)擊Analyze進(jìn)行分析,使各項(xiàng)參數(shù)符合下述“10.質(zhì)量控制''中的要求,然后到Plate窗口下記錄定性結(jié)果。點(diǎn)擊軟件界面上方文件的下拉菜單打開可以直接打開上機(jī)文件,選擇右側(cè)分析類型,左上角的1?6數(shù)字鍵可以選擇對(duì)應(yīng)的通道進(jìn)行分析。9.3.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果的導(dǎo)出：點(diǎn)擊左上角的文件,在其下拉菜單中有導(dǎo)出,選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以導(dǎo)出*.xls格式的實(shí)驗(yàn)文件。質(zhì)量控制2019-nCoV-PCR-陰性對(duì)照:FAM、ROX通道及內(nèi)標(biāo)(HEX)通道均無Ct值或Ct>40；2019-nCoV-PCR-陽性對(duì)照:FAM、ROX及內(nèi)標(biāo)(HEX)通道均Ct<35；2019-nCoV-PCR-弱陽性對(duì)照:FAM、ROX及內(nèi)標(biāo)(HEX)通道均Ct<40；10.3以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足,否則本次實(shí)驗(yàn)無效,需重新進(jìn)行。干擾和交叉反應(yīng)11.1標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)本收集、處理、運(yùn)送及保存質(zhì)量有關(guān),其中任何失誤都將會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。如果標(biāo)本處理時(shí)沒有控制好交叉污染,可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。11.2樣本中可能存在的干擾物質(zhì)：100pg/mL鹽酸羥甲唑琳、50pg/mL地塞米松、50pg/mL鹽酸頭孢甲月虧、100pg/mL奧司他韋、100pg/mL扎那米韋、100pg/mL利巴韋林、100pg/mL阿奇霉素、300U/mLa-干擾素、320^g/mL布地奈德、125pg/mL苯福林、100pg/mL妥布霉素、50pg/mL倍氯美松、100pg/mL氟尼縮松、100pg/mL莫米松、200pg/mL氟替卡松、200pg/mL鹽酸組胺、100pg/mL帕拉米韋、100pg/mL洛匹那韋、lOOpg/mL莫匹羅星、lOOpg/mL曲安奈德、100^g/mL利托那韋、lOOpg/mL阿比多爾、60pg/mL氯化鈉、lOOpg/mL尿素、10pg/mL血紅素、20pg/mL純化粘蛋白、20%(v/v)無水乙醇、20%(v/v)人全血對(duì)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果無明顯干擾。參考范圍本方法檢測(cè)下限為200IU/ml,檢測(cè)目標(biāo)基因的Ct參考值為40；內(nèi)標(biāo)Ct的參考值為40。檢驗(yàn)結(jié)果分析13.1對(duì)于FAM和ROX通道均檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線,且Ct<40的樣本,更換檢驗(yàn)人員,使用兩種不同廠家的新冠核酸檢測(cè)試劑提取樣本核酸進(jìn)行復(fù)核,假設(shè)結(jié)果ORFIab和N基因同時(shí)陽性時(shí),判定為陽性；假設(shè)僅ORF1a或N基因其中之一檢測(cè)結(jié)果陽性時(shí),需重新采樣復(fù)查,復(fù)查后ORPlab或N基因仍為陽性時(shí),判定為陽性,并采用其他試劑成方法進(jìn)行確認(rèn)；報(bào)告為2019-nCoV病毒“初篩陽性待復(fù)查〞,并將標(biāo)本送至疾控確診。13.2對(duì)于FAM或ROX通道出現(xiàn)單靶標(biāo)檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線,且CtM40的樣本,使用不同廠家的新冠核酸檢測(cè)試劑重新提取樣本核酸進(jìn)行復(fù)查,假設(shè)仍為單靶標(biāo)陽性,則重新采樣進(jìn)行復(fù)檢；如果仍為單靶標(biāo)陽性,報(bào)告為2019-nCoV病毒“初篩陽性待復(fù)查〞,并將標(biāo)本送至疾控確診；否則判斷為陰性。13.3Ct值位于灰區(qū),當(dāng)出現(xiàn)Ct值在37-40之間時(shí)為灰度區(qū)?？赡艽嬖谙旅媲闆r:2個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果均處于“灰度區(qū)〞；1個(gè)位點(diǎn)判讀為陽性,另1個(gè)立點(diǎn)的結(jié)果處于“灰度區(qū)〞1個(gè)位點(diǎn)判讀為陰性,另1個(gè)位點(diǎn)的結(jié)果處于“灰度區(qū)〞。出現(xiàn)以上情況時(shí)宜重新提取原標(biāo)本的核酸,并與該標(biāo)本前一次提取的核酸同時(shí)擴(kuò)增檢測(cè)。分析兩次檢驗(yàn)結(jié)果,單個(gè)位點(diǎn)兩次陽性或兩個(gè)位點(diǎn)為陽性